工业微生物代谢控制育种精.ppt

工业微生物代谢控制育种第1页，本讲稿共63页工业微生物代谢控制育种第2页，本讲稿共63页代谢控制发酵大体过程如下：代谢控制发酵大体过程如下：以生物化学和遗传学为基础，研究代谢产物的生物合成途径和代谢调以生物化学和遗传学为基础，研究代谢产物的生物合成途径和代谢调节的机制节的机制选择巧妙的技术路线，通过遗传育种技术获得解除选择巧妙的技术路线，通过遗传育种技术获得解除或绕过了微生物正常代谢途径的突变株或绕过了微生物正常代谢途径的突变株从而人为地使有用产物从而人为地使有用产物选择性地大量合成和累积选择性地大量合成和累积。代谢控制发酵的关键：代谢控制发酵的关键：取决于微生物代谢调控机制是否能够被取决于微生物代谢调控机制是否能够被解除，能否打破微生物正常的代谢调节，人为地控制微生物的代解除，能否打破微生物正常的代谢调节，人为地控制微生物的代谢。谢。实现代谢控制目标的手段：实现代谢控制目标的手段：代谢控制育种和发酵过程的代谢控制代谢控制育种和发酵过程的代谢控制培养，而代谢控制育种则为主要支柱技术。培养，而代谢控制育种则为主要支柱技术。第3页，本讲稿共63页 微生物菌体微生物菌体积累的发酵产物主要有积累的发酵产物主要有 酶酶 代谢产物代谢产物 （酒精、甘油、乳酸、丙酮、丁醇、酒精、甘油、乳酸、丙酮、丁醇、有机酸、氨基酸、核苷酸、蛋白质、抗生素、维生素、脂肪、多糖等）有机酸、氨基酸、核苷酸、蛋白质、抗生素、维生素、脂肪、多糖等）这些产物中有些是某种微生物在一定的环境条件下生成的，如酒这些产物中有些是某种微生物在一定的环境条件下生成的，如酒精、乳酸等；也有许多产物是生理正常的微生物不能过量积累的，必精、乳酸等；也有许多产物是生理正常的微生物不能过量积累的，必须是具有特异生理特征的微生物才能积累。人为地改变微生物的代谢须是具有特异生理特征的微生物才能积累。人为地改变微生物的代谢调控机制，使有用的中间代谢产物过量积累，这种发酵称为调控机制，使有用的中间代谢产物过量积累，这种发酵称为代谢控制代谢控制发酵。发酵。第4页，本讲稿共63页 考察工业微生物发展史，考察工业微生物发展史，可以看到经典的诱变育种具有一定盲目可以看到经典的诱变育种具有一定盲目性，而代谢控制育种将微生物遗传学的理论与育种实践密切结合，性，而代谢控制育种将微生物遗传学的理论与育种实践密切结合，先研究目的产物的生物合成途径、遗传控制及代谢调节机制，然先研究目的产物的生物合成途径、遗传控制及代谢调节机制，然后进行定向控制育种。后进行定向控制育种。代谢控制发酵的出现与发展，与以下几方面是密不可分的：代谢控制发酵的出现与发展，与以下几方面是密不可分的：生物化学的发展，确立了代谢图谱，同时发现了代谢过程中的各生物化学的发展，确立了代谢图谱，同时发现了代谢过程中的各种调节机制；分子生物学和分子遗传学的发展，可以人为地在种调节机制；分子生物学和分子遗传学的发展，可以人为地在DNA分子水平上改变微生物的代谢，多方面利用微生物的代谢活分子水平上改变微生物的代谢，多方面利用微生物的代谢活性；合理控制环境，采用过程控制方法，对发酵过程进行最优化性；合理控制环境，采用过程控制方法，对发酵过程进行最优化控制，使目的产物大量积累。控制，使目的产物大量积累。第5页，本讲稿共63页第一节 概 论一、初级代谢产物和初级代谢一、初级代谢产物和初级代谢初级代谢产物初级代谢产物微生物产生的对自身生长和繁殖必须的物质微生物产生的对自身生长和繁殖必须的物质初级代谢初级代谢产生这些物质的代谢系称为初级代谢。产生这些物质的代谢系称为初级代谢。初级代谢体系初级代谢体系分解代谢体系：分解代谢体系：包括糖、脂、蛋白质等物质的降包括糖、脂、蛋白质等物质的降解，获取能量解，获取能量素材性生物合成体系：素材性生物合成体系：合成某些小分子材料合成某些小分子材料结构性生物合成体系：结构性生物合成体系：用小分子合成产物装配大用小分子合成产物装配大分子。分子。第6页，本讲稿共63页二、次级代谢产物和次级代谢二、次级代谢产物和次级代谢根据根据Demain的定义：的定义：“次级代谢产物是对产生它们次级代谢产物是对产生它们的生物体本身不需要的一种产物的生物体本身不需要的一种产物”。这些物质有抗生素、生长刺激素、生物碱、色素、这些物质有抗生素、生长刺激素、生物碱、色素、毒素以及甾体等。毒素以及甾体等。通常把以初级代谢产物为前体，合成次生产物的代谢体通常把以初级代谢产物为前体，合成次生产物的代谢体系称为次级代谢。系称为次级代谢。第7页，本讲稿共63页三、初级代谢与次级代谢的关系三、初级代谢与次级代谢的关系1.菌体代谢方面菌体代谢方面 抗生素是微生物的次级代谢产物中的一大类。微生物的初级代谢抗生素是微生物的次级代谢产物中的一大类。微生物的初级代谢与次级代谢既有区别，又有联系。与次级代谢既有区别，又有联系。许多抗生素的基本结构是由少数几种初级代谢产物构许多抗生素的基本结构是由少数几种初级代谢产物构成的，所以次级代谢产物是以初级代谢产物为母体衍生出来成的，所以次级代谢产物是以初级代谢产物为母体衍生出来的，次级代谢途径并不是独立的，而是与初级代谢途径有密的，次级代谢途径并不是独立的，而是与初级代谢途径有密切关系的。切关系的。糖代谢中间体，既可用来合成初级代谢产物，又可用来合成糖代谢中间体，既可用来合成初级代谢产物，又可用来合成次级代谢产物，这种中间体叫做次级代谢产物，这种中间体叫做分支分支(叉叉)中间体中间体。第8页，本讲稿共63页分叉中间体初级代谢产物次级代谢产物-氨基己二糖丙二酰CoA乙酰CoA赖氨酸脂肪酸青霉素、头孢菌素利福霉素族、四环素族大环内酯族、多烯族抗生素、灰黄霉素、橘霉素、环己酰亚胺、棒曲霉素莽草酸对氨基苯丙氨酸苯丙氨酸酪氨酸、对氨基苯甲酸、色氨酸氯霉素绿脓菌素新生霉素第9页，本讲稿共63页 次级代谢产物的合成，至少有一部分取决于与初级代次级代谢产物的合成，至少有一部分取决于与初级代谢产物无关的遗传物质，并和由这类遗传物质形成的酶所谢产物无关的遗传物质，并和由这类遗传物质形成的酶所催化的代谢途径有关，它们多数是特异菌株。从代谢途径催化的代谢途径有关，它们多数是特异菌株。从代谢途径来看，次级代谢产物是以初级代谢产物为前体衍生出来的，来看，次级代谢产物是以初级代谢产物为前体衍生出来的，见下图。见下图。第10页，本讲稿共63页脂肪酸脂肪酸（nC3、nC2）葡萄糖葡萄糖（C6）丙糖丙糖P丙酮酸丙酮酸（C3）（C3）乙酰乙酰CoA（C2）柠檬酸柠檬酸（C6）草酰乙酸草酰乙酸-酮戊二酸酮戊二酸（C5）CO2CO2谷氨酸谷氨酸（C5N）次级代谢产物次级代谢产物戊糖戊糖（C5）氨基糖苷类抗生素氨基糖苷类抗生素糖苷类多糖糖苷类多糖核苷核苷核苷类核苷类抗生素抗生素丝氨酸丝氨酸（C3N）甘氨酸甘氨酸（C2N）半胱氨酸半胱氨酸次级代谢物次级代谢物丁糖丁糖（C4）莽草酸莽草酸（C7）芳香族氨基酸芳香族氨基酸次级代次级代谢产物谢产物芳香族次级芳香族次级代谢产物代谢产物缬氨酸缬氨酸（C5N）生物甲基化生物甲基化次级代谢产物次级代谢产物C1丙氨酸丙氨酸（C3N）甲羟戊酸甲羟戊酸（C3）焦磷酸异戊酯焦磷酸异戊酯（C3）CO2萜萜甾体甾体甾体甾体（6C5）丙二酸丙二酸（C3）CO2CO2CO2聚酮体聚酮体次级代谢产物次级代谢产物天冬氨酸天冬氨酸（C4N）（nC2）葡萄糖分解代谢的主要途径葡萄糖分解代谢的主要途径初级代谢的合成过程初级代谢的合成过程图图从碳代谢流看初级代谢与次级代谢从碳代谢流看初级代谢与次级代谢第11页，本讲稿共63页 由初级代谢产物衍生的次级代谢产物的生物合成途径有由初级代谢产物衍生的次级代谢产物的生物合成途径有七种。在这些次级代谢途径中所涉及的酶有的是初级代谢酶，七种。在这些次级代谢途径中所涉及的酶有的是初级代谢酶，有的是次级代谢所特有的酶。初级代谢与次级代谢都受菌体的有的是次级代谢所特有的酶。初级代谢与次级代谢都受菌体的代谢调节，在调节控制上是相互影响的，当与抗生素合成有关代谢调节，在调节控制上是相互影响的，当与抗生素合成有关的初级代谢途径受到控制时，抗生素的生物合成必然受阻。的初级代谢途径受到控制时，抗生素的生物合成必然受阻。葡萄糖碳架参入途径葡萄糖碳架参入途径 莽草酸途径莽草酸途径 与核苷有关的途径与核苷有关的途径 聚酮糖和聚丙酸途径聚酮糖和聚丙酸途径 由氨基酸衍生的途径由氨基酸衍生的途径 甲羟戊酸途径甲羟戊酸途径 其他复合途径其他复合途径综上所述，在代谢途径、综上所述，在代谢途径、酶系关系以及调控上，次酶系关系以及调控上，次级代谢与初级代谢都有着级代谢与初级代谢都有着密切关系。因此，在研究密切关系。因此，在研究次级代谢时，必须与初级次级代谢时，必须与初级代谢联系起来考虑。代谢联系起来考虑。第12页，本讲稿共63页2.2.遗传代谢方面遗传代谢方面 初级代谢与次级代谢同样都受到核内初级代谢与次级代谢同样都受到核内DNADNA的调节控制的调节控制,而次级而次级代谢产物还受到与初级代谢产物合成无关的遗传物质的控制代谢产物还受到与初级代谢产物合成无关的遗传物质的控制,即即受核内遗传物质受核内遗传物质(染色体遗传物质染色体遗传物质)和核外遗传物质和核外遗传物质(质粒质粒)的控制的控制.有一部分代谢产物的形成，取决于由质粒信息产生的酶所控制的有一部分代谢产物的形成，取决于由质粒信息产生的酶所控制的代谢途径，这类物质称为质粒产物。代谢途径，这类物质称为质粒产物。由于这类物质的形成直接或间接受质粒遗传物质的控制，由于这类物质的形成直接或间接受质粒遗传物质的控制，因而产生了质粒遗传的观点。因而产生了质粒遗传的观点。也有只由染色体也有只由染色体DNADNA控制的抗生素产物。控制的抗生素产物。第13页，本讲稿共63页次级代谢产物（质粒产物）次级代谢产物（质粒产物）初级代谢产物（质粒产物）初级代谢产物（质粒产物）底物（营养物）底物（营养物）中间体（质中间体（质粒产物）粒产物）底物（异常营养物）底物（异常营养物）酶、蛋白质酶、蛋白质酶、蛋白质、次级代谢产物酶、蛋白质、次级代谢产物（质粒产物）（质粒产物）核糖核蛋白体系统核糖核蛋白体系统mRNAmRNA染色体染色体质粒质粒次级代谢产物生物合成与初级代谢产物的关系次级代谢产物生物合成与初级代谢产物的关系第14页，本讲稿共63页第二节第二节 初级代谢的调节控制初级代谢的调节控制一、酶合成的调节一、酶合成的调节通过调节酶合成量进而调节代谢速率，是在基因水平上（原通过调节酶合成量进而调节代谢速率，是在基因水平上（原核生物中转录水平）的代谢调节核生物中转录水平）的代谢调节特点：间接缓慢、节约能量和原料特点：间接缓慢、节约能量和原料酶合成调节酶合成调节诱导酶合成诱导酶合成阻遏酶合成阻遏酶合成 酶合成调节的类型酶合成调节的类型诱导：当环境中存在诱导物（底物及类似物、底物前体）时，诱导：当环境中存在诱导物（底物及类似物、底物前体）时，促进酶合成，诱导方式有同时诱导、顺序诱导促进酶合成，诱导方式有同时诱导、顺序诱导 阻遏：过量代谢产物阻碍代谢途径中包括关键酶在内的一阻遏：过量代谢产物阻碍代谢途径中包括关键酶在内的一系列酶的合成，从而控制代谢，减少末端产物的合成系列酶的合成，从而控制代谢，减少末端产物的合成第15页，本讲稿共63页 酶合成调节的机制酶合成调节的机制乳糖操纵子的调节乳糖操纵子的调节第16页，本讲稿共63页色氨酸操纵子的反馈阻遏色氨酸操纵子的反馈阻遏第17页，本讲稿共63页DNA（促（促 进）进）分解代谢物阻遏的乳糖操纵子模型分解代谢物阻遏的乳糖操纵子模型转乙酰基酶转乙酰基酶调节基因调节基因CAP-cAMPRNApolLacZOLacYLacA阻遏蛋白阻遏蛋白启动基因启动基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因RNA聚合酶聚合酶乳糖乳糖阻遏蛋白阻遏蛋白mRNA半乳糖苷酶半乳糖苷酶透过酶透过酶葡萄糖葡萄糖（阻断）（阻断）XATPcAMPCAPAMP葡萄糖分解代谢物葡萄糖分解代谢物X X阻止阻止CAP-cAMP CAP-cAMP 的形成，从而阻止了的形成，从而阻止了RNARNA聚合酶与启动基因上结合位点聚合酶与启动基因上结合位点(RNApol.)(RNApol.)的的结合，即使有诱导物乳糖存在，与乳糖代谢有关的酶仍无法合成结合，即使有诱导物乳糖存在，与乳糖代谢有关的酶仍无法合成第18页，本讲稿共63页二、酶活性的调节二、酶活性的调节通通过过改改变变现现成成的的酶酶分分子子活活性性来来调调节节新新陈陈代代谢谢的的速速率率的的方方式式。是是酶酶分分子子水水平上的调节，属于精细的调节。平上的调节，属于精细的调节。（一）调节方式：（一）调节方式：包括两个方面：包括两个方面：1、酶酶活活性性的的激激活活：在在代代谢谢途途径径中中后后面面的的反反应应可可被被较较前前面面的的反反应应产产物物所所促进的现象；常见于分解代谢途径。促进的现象；常见于分解代谢途径。如：粗糙脉孢霉的异柠檬酸脱氢酶的活性受柠檬酸促进如：粗糙脉孢霉的异柠檬酸脱氢酶的活性受柠檬酸促进2、酶活性的抑制、酶活性的抑制：包括：竞争性抑制和反馈抑制。：包括：竞争性抑制和反馈抑制。概概念念：反反馈馈：指指反反应应链链中中某某些些中中间间代代谢谢产产物物或或终终产产物物对对该该途途径径关关键键酶酶活活性的影响。性的影响。凡使反应速度加快的称凡使反应速度加快的称正反馈正反馈；凡使反应速度减慢的称凡使反应速度减慢的称负反馈（反馈抑制）负反馈（反馈抑制）；反反馈馈抑抑制制主主要要表表现现在在某某代代谢谢途途径径的的末末端端产产物物过过量量时时可可反反过过来来直直接接抑抑制该途径中第一个酶的活性。主要表现在氨基酸、核苷酸合成途径中。制该途径中第一个酶的活性。主要表现在氨基酸、核苷酸合成途径中。特点：作用直接、效果快速、末端产物浓度降低时又可解除特点：作用直接、效果快速、末端产物浓度降低时又可解除第19页，本讲稿共63页1.直线式代谢途径中的反馈抑制直线式代谢途径中的反馈抑制：苏氨酸脱氨酶苏氨酸脱氨酶苏氨酸苏氨酸-酮丁酸酮丁酸异亮氨酸异亮氨酸反馈抑制反馈抑制其它实例：谷氨酸棒杆菌的精氨酸合成其它实例：谷氨酸棒杆菌的精氨酸合成2.2.分支代谢途径中的反馈抑制：分支代谢途径中的反馈抑制：在分支代谢途径中，反馈抑制的情况较为复杂，为了避免在一个分在分支代谢途径中，反馈抑制的情况较为复杂，为了避免在一个分支上的产物过多时不致同时影响另一分支上产物的供应，微生物发支上的产物过多时不致同时影响另一分支上产物的供应，微生物发展出多种调节方式。主要有：展出多种调节方式。主要有：同功酶的调节，同功酶的调节，顺序反馈，协同反顺序反馈，协同反馈，积累反馈调节等。馈，积累反馈调节等。（二）反馈抑制的类型（二）反馈抑制的类型第20页，本讲稿共63页（1 1）同功酶调节）同功酶调节isoenzymeisoenzyme定义：催化相同的生化反应，而酶分子结构有差别的定义：催化相同的生化反应，而酶分子结构有差别的一组酶。一组酶。意义：在一个分支代谢途径中，如果在分支点以前的一个较早的意义：在一个分支代谢途径中，如果在分支点以前的一个较早的反应是由几个同功酶催化时，则分支代谢的几个最终产物往往反应是由几个同功酶催化时，则分支代谢的几个最终产物往往分别对这几个同功酶发生抑制作用。分别对这几个同功酶发生抑制作用。某一产物过量仅抑某一产物过量仅抑制相应酶活性，对其他产物没影响。制相应酶活性，对其他产物没影响。举例：大肠杆菌的天冬氨酸族氨基酸合成的调节举例：大肠杆菌的天冬氨酸族氨基酸合成的调节第21页，本讲稿共63页（2 2）协同反馈抑制）协同反馈抑制concerted feedback inhibition定义：分支代谢途径中几个末端产物同时过量时才能抑制共同途径定义：分支代谢途径中几个末端产物同时过量时才能抑制共同途径中的第一个酶的一种反馈调节方式。中的第一个酶的一种反馈调节方式。举例：谷氨酸棒杆菌（举例：谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）多粘芽孢杆菌（多粘芽孢杆菌（Bacillus polymyxa）天冬氨酸族氨基酸合成中天冬氨酸激酶受赖氨酸天冬氨酸族氨基酸合成中天冬氨酸激酶受赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制和阻遏。和苏氨酸的协同反馈抑制和阻遏。第22页，本讲稿共63页（3 3）合作反馈抑制）合作反馈抑制cooperative feedback inhibitioncooperative feedback inhibition定义：两种末端产物同时存在时，共同的反馈抑制作用大于二者单独定义：两种末端产物同时存在时，共同的反馈抑制作用大于二者单独作用之和。作用之和。举例：在嘌呤核苷酸合成中，磷酸核糖焦磷酸酶受举例：在嘌呤核苷酸合成中，磷酸核糖焦磷酸酶受AMP和和GMP（和（和IMP）的合作反馈抑制，二者共同存在时，可以完全抑制该酶的活性。而）的合作反馈抑制，二者共同存在时，可以完全抑制该酶的活性。而二者单独过量时，分别抑制其活性的二者单独过量时，分别抑制其活性的70%和和10%。第23页，本讲稿共63页（4）积累反馈抑制）积累反馈抑制cumulative feedback inhibition定义：每一分支途径末端产物按一定百分比单独抑制共同途径中前面的定义：每一分支途径末端产物按一定百分比单独抑制共同途径中前面的酶，所以当几种末端产物共同存在时它们的抑制作用是积累的，各末端酶，所以当几种末端产物共同存在时它们的抑制作用是积累的，各末端产物之间既无协同效应，亦无拮抗作用。产物之间既无协同效应，亦无拮抗作用。第24页，本讲稿共63页（5 5）顺序反馈抑制）顺序反馈抑制sequential feedback inhibitionsequential feedback inhibition一一种种终终产产物物的的积积累累,导导致致前前一一中中间间产产物物的的积积累累，通通过过后后者者反反馈馈抑抑制制合成途径关键酶的活性，使合成终止。合成途径关键酶的活性，使合成终止。举例：枯草芽孢杆菌芳香族氨基酸合成的调节举例：枯草芽孢杆菌芳香族氨基酸合成的调节第25页，本讲稿共63页（三）反馈抑制的机制（三）反馈抑制的机制 尽管反馈抑制的类型很多，但其主要的作用方式在于末端产物尽管反馈抑制的类型很多，但其主要的作用方式在于末端产物对反应途径中调节酶的抑制。对反应途径中调节酶的抑制。受反馈抑制的调节酶一般都是变构酶，酶活力调控的实质就是变构受反馈抑制的调节酶一般都是变构酶，酶活力调控的实质就是变构酶的变构调节。酶的变构调节。变构酶的酶蛋白分子一般都是由两个以上亚基组成的多聚体，具有变构酶的酶蛋白分子一般都是由两个以上亚基组成的多聚体，具有四级结构，四级结构，这是能够产生变构作用的物质基础。这是能够产生变构作用的物质基础。变构酶分子具有两个结合位点，一个是与底物结合的催化中心变构酶分子具有两个结合位点，一个是与底物结合的催化中心（活性中心），另一个可与调节因子（又称效应物）相结合的调节（活性中心），另一个可与调节因子（又称效应物）相结合的调节中心（变构中心）。中心（变构中心）。第26页，本讲稿共63页+激激活活剂剂底物底物+抑抑制制剂剂无活性形式无活性形式活性形式活性形式活性形式活性形式无活性形式无活性形式（不能结合底物）（不能结合底物）底物底物图图 变构酶的激活和变构酶的抑制变构酶的激活和变构酶的抑制 变构效应：当效应物与调节中心结合后，可引起酶蛋白分子发生变构效应：当效应物与调节中心结合后，可引起酶蛋白分子发生构象变化，从而引起酶的活性中心对底物的亲和力和催化能力的改构象变化，从而引起酶的活性中心对底物的亲和力和催化能力的改变，激活或阻碍了酶和它的底物的结合，促进或抑制了酶活力，使变，激活或阻碍了酶和它的底物的结合，促进或抑制了酶活力，使整个代谢途径的快慢受到调节。整个代谢途径的快慢受到调节。第27页，本讲稿共63页28 突变前突变前 突变后突变后 反馈抑制与抗反馈抑制突变反馈抑制与抗反馈抑制突变效应物效应物底物底物第28页，本讲稿共63页三、反馈阻遏与反馈抑制的比较三、反馈阻遏与反馈抑制的比较 类型项目反馈阻遏反馈抑制调控对象调控开关调控的水平调控方式调控动作形成的控制调控反应速度酶的合成终产物浓度DNAmRNA酶蛋白（转录水平）终产物与阻遏蛋白亲和力阻遏蛋白与操纵基因结合,不能合成mRNA开、关控制迟缓、粗的控制酶的活性终产物浓度酶蛋白的构象变化终产物与变构部位亲和力通过变构效应,酶的构象变化控制酶活性的大小迅速、精确的控制第29页，本讲稿共63页第三节第三节 次级代谢的调节控制次级代谢的调节控制 1.1.细胞生长期到抗生素产生期的过渡细胞生长期到抗生素产生期的过渡在细胞生长期，负责次级代谢产物合成的酶处于抑制或在细胞生长期，负责次级代谢产物合成的酶处于抑制或阻遏状态，进入稳定期，这些酶便开始被激活或被合成阻遏状态，进入稳定期，这些酶便开始被激活或被合成（解除阻遏作用的原因是多方面的）。（解除阻遏作用的原因是多方面的）。(1)(1)一种诱导因子在生长期末积累或从外源加入以解除生产期的阻遏作用。一种诱导因子在生长期末积累或从外源加入以解除生产期的阻遏作用。(2)(2)初级代谢的终产物对次级代谢途径的反馈阻遏作用，当终产物耗尽后，受阻初级代谢的终产物对次级代谢途径的反馈阻遏作用，当终产物耗尽后，受阻遏的基因就被解除阻遏。遏的基因就被解除阻遏。(3)(3)在一种易被利用的糖源中生长，其分解代谢物对抗生素合成有阻在一种易被利用的糖源中生长，其分解代谢物对抗生素合成有阻遏作用，当这些阻遏剂被利用后，便解除了阻遏作用。遏作用，当这些阻遏剂被利用后，便解除了阻遏作用。第30页，本讲稿共63页2.2.酶的诱导作用酶的诱导作用 在细胞营养期一般不出现催化次级代谢的酶，在稳定期发生了在细胞营养期一般不出现催化次级代谢的酶，在稳定期发生了次级代谢酶的诱导或解阻遏而生成。如色氨酸（或其类似物）刺激次级代谢酶的诱导或解阻遏而生成。如色氨酸（或其类似物）刺激麦角菌诱导合成麦角灵生物碱；蛋氨酸刺激顶头孢霉生物合成头孢麦角菌诱导合成麦角灵生物碱；蛋氨酸刺激顶头孢霉生物合成头孢菌素菌素C C。(4)(4)抗生素合成途径受高能化合物的阻遏，当抗生素合成途径受高能化合物的阻遏，当ATPATP形成减少后，阻遏作用形成减少后，阻遏作用随即解除。随即解除。(5)(5)在生长期，在生长期，RNARNA聚合酶只能启动生长期基因的转录作用，它不能附着在聚合酶只能启动生长期基因的转录作用，它不能附着在生产期操纵的促进子的位置上，结果次级代谢途径的酶合成受阻遏；当生生产期操纵的促进子的位置上，结果次级代谢途径的酶合成受阻遏；当生长停止后，酶的结构改变，允许长停止后，酶的结构改变，允许RNARNA聚合酶启动生产期基因的转录作用，负聚合酶启动生产期基因的转录作用，负责抗生素合成的酶开始生成。责抗生素合成的酶开始生成。第31页，本讲稿共63页3.3.分解代谢产物的调节控制分解代谢产物的调节控制 葡萄糖效应（分解产物阻遏）：在含有葡萄糖和第二种葡萄糖效应（分解产物阻遏）：在含有葡萄糖和第二种碳源的培养基中，葡萄糖首先被利用，抑制抗生素的生物合成，碳源的培养基中，葡萄糖首先被利用，抑制抗生素的生物合成，只有在葡萄糖耗尽时，利用第二种碳源（如半乳糖）所需的酶只有在葡萄糖耗尽时，利用第二种碳源（如半乳糖）所需的酶开始合成，并解除对抗生素生物合成的抑制。此外，甘露糖、开始合成，并解除对抗生素生物合成的抑制。此外，甘露糖、甘油也呈现明显的阻遏作用。甘油也呈现明显的阻遏作用。第32页，本讲稿共63页4.4.磷酸盐的调节磷酸盐的调节高浓度磷酸盐对许多抗生素合成具有阻遏和抑制作用。高浓高浓度磷酸盐对许多抗生素合成具有阻遏和抑制作用。高浓度磷酸盐只长菌体而不合成抗生素；但磷酸盐太少时，菌体生度磷酸盐只长菌体而不合成抗生素；但磷酸盐太少时，菌体生长不够，也不利于合成抗生素。因此，发酵工艺上要严格控制长不够，也不利于合成抗生素。因此，发酵工艺上要严格控制“亚适量亚适量”的磷酸盐浓度。的磷酸盐浓度。5.NH45.NH4的抑制作用的抑制作用在抗生素发酵中，供给高浓度的容易被利用的无机氨态氮或其在抗生素发酵中，供给高浓度的容易被利用的无机氨态氮或其他迅速被利用的氮源，由于它们促进生长，而强烈抑制抗生素的合他迅速被利用的氮源，由于它们促进生长，而强烈抑制抗生素的合成。成。第33页，本讲稿共63页6.6.初级代谢调节对次级代谢的作用初级代谢调节对次级代谢的作用许多次级代谢产物来自初级代谢的关键中间体，因此次级代许多次级代谢产物来自初级代谢的关键中间体，因此次级代谢也就受初级代谢调节的影响。谢也就受初级代谢调节的影响。7.7.次级代谢的反馈抑制（或阻遏）次级代谢的反馈抑制（或阻遏）许多抗生素能阻止自身的合成。许多抗生素能阻止自身的合成。8.8.次级代谢的能荷调节次级代谢的能荷调节能荷调节机制对次级代谢途径的控制也是有效的。能荷调节机制对次级代谢途径的控制也是有效的。第34页，本讲稿共63页第四节第四节 代谢调节控制育种代谢调节控制育种 从工业微生物育种史来看，诱变育种曾取得了巨大的成就，使微从工业微生物育种史来看，诱变育种曾取得了巨大的成就，使微生物有效产物成百倍、乃致成千倍的增加。但是诱变育种工作量繁生物有效产物成百倍、乃致成千倍的增加。但是诱变育种工作量繁重，盲目性大。重，盲目性大。近年来由于应用生物化学和遗传学原理，深入研究了生物合近年来由于应用生物化学和遗传学原理，深入研究了生物合成代谢途径以及代谢调节控制的基础理论：成代谢途径以及代谢调节控制的基础理论：（1）可进行外因控制，通过培养条件来解除反馈调节而使生物合）可进行外因控制，通过培养条件来解除反馈调节而使生物合成的途径朝着人们所希望的方向进行，成的途径朝着人们所希望的方向进行，即实现代谢控制发酵；即实现代谢控制发酵；第35页，本讲稿共63页（2）还可进行内因改变，通过定向选育某种特定的突变株，以达）还可进行内因改变，通过定向选育某种特定的突变株，以达到大量积累有益产物的目的，到大量积累有益产物的目的，即所谓代谢控制育种。即所谓代谢控制育种。内因是变化的根据，所以改变微生物的遗传型往往是控制代谢内因是变化的根据，所以改变微生物的遗传型往往是控制代谢的更为有效的途径。的更为有效的途径。代谢控制育种可以大大减少传统育种的盲目性，提高了代谢控制育种可以大大减少传统育种的盲目性，提高了效率。效率。代谢控制育种很快在初级代谢产物的育种中得到广泛的代谢控制育种很快在初级代谢产物的育种中得到广泛的应用，成就也十分显赫，应用，成就也十分显赫，几乎全部氨基酸和多种核苷酸生产菌几乎全部氨基酸和多种核苷酸生产菌株都被打上了抗性或缺陷型遗传标记。株都被打上了抗性或缺陷型遗传标记。第36页，本讲稿共63页 代谢调节控制育种通过特定突变型的选育，达到改变代谢通路、代谢调节控制育种通过特定突变型的选育，达到改变代谢通路、降低支路代谢终产物的产生或切断支路代谢途径及提高细胞膜的降低支路代谢终产物的产生或切断支路代谢途径及提高细胞膜的透性，使代谢流向目的产物积累方向进行。透性，使代谢流向目的产物积累方向进行。下表列出微生物代谢控制育种措施下表列出微生物代谢控制育种措施第37页，本讲稿共63页调节体系育种措施诱导分解阻遏分解抑制 1.组成型突变株的选育2.抗分解调节突变株的选育l解除碳源分解调节突变株的选育l解除氮源分解调节突变株的选育l解除磷酸盐调节突变株的选育反馈阻遏反馈抑制3.营养缺陷型突变株的选育4.渗漏型缺陷型突变株的选育5.回复突变株的选育6.耐自身代谢产物的突变株的选育7.抗终产物结构类似物的突变株的选育8.耐前体物突变株的选育9.条件突变株的选育细胞膜渗透性10.营养缺陷型突变株的选育l生物素缺陷型l油酸缺陷型l甘油缺陷型11.温敏突变株第38页，本讲稿共63页一、组成型突变株的选育一、组成型突变株的选育组成型突变株：组成型突变株：在没有诱导底物存在时也能产生大在没有诱导底物存在时也能产生大量诱导酶的突变株。量诱导酶的突变株。筛选原理筛选原理：通过诱变处理，使调节基因发生突变，：通过诱变处理，使调节基因发生突变，不产生有活性的阻遏蛋白，或者操纵基因发生突不产生有活性的阻遏蛋白，或者操纵基因发生突变不再能与阻遏物相结合，从而使诱导型酶变为变不再能与阻遏物相结合，从而使诱导型酶变为组成型酶。组成型酶。第39页，本讲稿共63页40 筛选方法及实例：筛选方法及实例：创造一种有利于组成型菌株生长而不利于诱创造一种有利于组成型菌株生长而不利于诱导型菌株生长的培养条件，造成对导型菌株生长的培养条件，造成对组成型突组成型突变株的选择优势；变株的选择优势；选择适当的鉴别培养基，直接在平板上选择适当的鉴别培养基，直接在平板上识别两识别两类菌落类菌落，从而把组成型突变株选择出来。，从而把组成型突变株选择出来。第40页，本讲稿共63页41 限量诱导物恒化培养法限量诱导物恒化培养法 控控制制低低于于诱诱导导浓浓度度的的诱诱导导物物作作碳碳源源进进行行恒恒化化连连续续培培养养。诱诱导导型型菌菌株株生生长长极极弱弱，而而变变异异株株由由于于能能产产分分解解底底物物的的酶酶，则则能能分分解解底底物物而而得得以以生生长长。通通过过连连续续不不断断加加入入新新鲜鲜基基质质，野野生生型型就就会会被被“洗洗出出”，组组成成型型突突变变株株就就被被不不断断“浓浓缩缩”，最后达到能分离的浓度。，最后达到能分离的浓度。第41页，本讲稿共63页42 循环培养法循环培养法 不含诱导物培养基不含诱导物培养基 含诱导物培养基含诱导物培养基 (普通碳源或氮源）普通碳源或氮源）（诱导物作唯一碳源或氮源）（诱导物作唯一碳源或氮源）两两菌菌都都能能生生长长，但但组组成成型型突突变变株株已已能能合合成成特特定定的酶，亲株不能的酶，亲株不能变变异异株株调调整整期期短短，亲亲株株调调整整期期长长，短短时时间间培培养养后后，变异株所占比例增大变异株所占比例增大 反反复复循循环环培培养养几几次次后后，变变异异株株所所占占比比例例逐逐渐渐提高，然后进行分离提高，然后进行分离 第42页，本讲稿共63页鉴别性培养基的利用鉴别性培养基的利用 将将诱诱变变孢孢子子悬悬液液涂涂布布在在甘甘油油作作唯唯一一碳碳源源的的平平板板上上，培养后长出菌落。培养后长出菌落。然然 后后 在在 菌菌 落落 上上 喷喷 上上 O-硝硝 基基 苯苯 酚酚-D-半半 乳乳 糖糖 苷苷（ONPG），组成型成黄色，诱导型呈白色。），组成型成黄色，诱导型呈白色。原因：原因：组成型突变株在没有诱导底物存在时仍能产生组成型突变株在没有诱导底物存在时仍能产生-半乳糖苷酶，将无色试剂水解，放出半乳糖苷酶，将无色试剂水解，放出O-O-硝基苯酚，硝基苯酚，因而很容易挑选。因而很容易挑选。第43页，本讲稿共63页44 筛选筛选 经经诱诱变变剂剂处处理理后后的的菌菌体体移移接接到到含含有有诱诱导导能能力力低低，但但能能作作为为良良好好碳碳源源的的诱诱导导物物的的培培养养基基中中培培养养，突突变变体能良好生长，野生型不能生长。体能良好生长，野生型不能生长。例例如如：利利用用苯苯-半半乳乳糖糖（PGPG）筛筛选选-半半乳乳糖苷酶组成型突变株。糖苷酶组成型突变株。第44页，本讲稿共63页二、营养缺陷型在代谢调节育种中的应用二、营养缺陷型在代谢调节育种中的应用（一）在初级代谢调节育种中的应用（一）在初级代谢调节育种中的应用1.在直线式生物合成途径中在直线式生物合成途径中第45页，本讲稿共63页（利用营养缺陷型突变株进行氨基酸发酵必须限制所要求的氨基酸量，这样就将反馈作用物浓度利用营养缺陷型突变株进行氨基酸发酵必须限制所要求的氨基酸量，这样就将反馈作用物浓度控制在反馈机制的浓度之下控制在反馈机制的浓度之下）谷氨酸谷氨酸N-乙酰乙酰-谷氨酰磷酸谷氨酰磷酸N-乙酰谷氨酸半缩醛乙酰谷氨酸半缩醛N-乙酰鸟氨酸乙酰鸟氨酸鸟氨酸鸟氨酸瓜氨酸瓜氨酸精氨酸精氨酸N-乙酰谷氨酸乙酰谷氨酸-反馈 抑制谷氨酸棒状杆菌（瓜氨酸缺陷型）的鸟氨酸发酵代谢控制机制谷氨酸棒状杆菌（瓜氨酸缺陷型）的鸟氨酸发酵代谢控制机制-第46页，本讲稿共63页2.在分支式生物合成途径中在分支式生物合成途径中-协同反馈抑制天冬氨酸天冬氨酸天冬氨酰磷酸天冬氨酰磷酸天冬氨酸半缩酸醛天冬氨酸半缩酸醛高丝氨酸高丝氨酸苏氨酸苏氨酸赖氨酸赖氨酸天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶-谷氨酸棒状杆菌（高丝氨酸缺陷型）的谷氨酸棒状杆菌（高丝氨酸缺陷型）的L-L-赖氨酸发酵代谢控制机制赖氨酸发酵代谢控制机制第47页，本讲稿共63页分支途径分支途径肌苷酸发酵肌苷酸发酵（IMPIMP合成途径的代谢调控）合成途径的代谢调控）调控理论的实践应用调控理论的实践应用第48页，本讲稿共63页（二）在次级代谢调节育种中的应用（二）在次级代谢调节育种中的应用（自学）（自学）三、渗漏缺陷型在代谢调节育种中的应用。三、渗漏缺陷型在代谢调节育种中的应用。渗漏缺陷型是一种特殊的营养缺陷型，是遗传性代谢障碍不完全渗漏缺陷型是一种特殊的营养缺陷型，是遗传性代谢障碍不完全的突变型。其特点是酶活力下降而不完全丧失，并能在基本培养基上的突变型。其特点是酶活力下降而不完全丧失，并能在基本培养基上少量生长。获得渗漏型的方法是把大量营养缺陷型菌株接种在基本培少量生长。获得渗漏型的方法是把大量营养缺陷型菌株接种在基本培养基平板上，挑选生长特别慢而菌落小的即可。养基平板上，挑选生长特别慢而菌落小的即可。可以利用渗漏缺陷型既能少量地合成代谢终产物，又不造成反可以利用渗漏缺陷型既能少量地合成代谢终产物，又不造成反馈抑制的现象。筛选抗反馈调节突变株，其原理类似于营养缺陷型，馈抑制的现象。筛选抗反馈调节突变株，其原理类似于营养缺陷型，只是不必添加限量的缺陷营养屋。只是不必添加限量的缺陷营养屋。第49页，本讲稿共63页四、抗反馈调节突变株的选育四、抗反馈调节突变株的选育(一一)反馈调节和抗反馈调节突变反馈调节和抗反馈调节突变 1.1.反馈调节反馈调节 是指当合成代谢途径的终产物或分支代谢途径的是指当合成代谢途径的终产物或分支代谢途径的终产物过量积累时，抑制合成代谢途径的关键酶（往终产物过量积累时，抑制合成代谢途径的关键酶（往往是代谢途径或分支代谢途径第一步的酶）的活力或往是代谢途径或分支代谢途径第一步的酶）的活力或相关酶的合成。反馈调节分为反馈抑制和反馈阻遏。相关酶的合成。反馈调节分为反馈抑制和反馈阻遏。第50页，本讲稿共63页51 反馈抑制是指合成代谢途径终产物过量积累时对该途径反馈抑制是指合成代谢途径终产物过量积累时对该途径前端某些关键酶酶活性的抑制作用。前端某些关键酶酶活性的抑制作用。反馈阻遏是指微生物合成代谢中高浓度终产物对该途反馈阻遏是指微生物合成代谢中高浓度终产物对该途径上酶合成的抑制作用。径上酶合成的抑制作用。反馈抑制直接以产物浓度控制关键酶的活性，从而控制反馈抑制直接以产物浓度控制关键酶的活性，从而控制整个代谢途径，具有快速、有效、经济和直接的特点。整个代谢途径，具有快速、有效、经济和直接的特点。反馈阻遏作用是胞内产物过量后终止酶合成的一种机制，反馈阻遏作用是胞内产物过量后终止酶合成的一种机制，与反馈抑制相比，反应较慢，并且往往影响代谢途径中与反馈抑制相比，反应较慢，并且往往影响代谢途径中所有酶（整个操纵子）的合成。所有酶（整个操纵子）的合成。第51页，本讲稿共63页52 2.2.抗反馈调节突变抗反馈调节突变 是指解除了反馈调节的突变株，包括抗反馈抑制是指解除了反馈调节的突变株，包括抗反馈抑制突变和抗反馈阻遏突变。突变和抗反馈阻遏突变。抗反馈抑制突变是指解除了反馈抑制的突变株。（抗反馈抑制突变是指解除了反馈抑制的突变株。（调节调节中心发生结构改变，无法与效应物结合中心发生结构改变，无法与效应物结合）抗反馈阻遏突变是指解除了反馈阻遏的突变株。（抗反馈阻遏突变是指解除了反馈阻遏的突变株。（调调节基因突变或操纵基因突变节基因突变或操纵基因突变）第52页，本讲稿共63页53 3.3.抗反馈调节突变株的筛选抗反馈调节突变株的筛选 筛选抗结构类似物突变株筛选抗结构类