2022年生物化学2.docx
精选学习资料 - - - - - - - - - 临床执业医师考试辅导生物化学重组 DNA 技术第十三单元本单元考点 1. 重组 DNA技术的概述1重组 DNA技术相关的概念2基因工程的基本原理 2. 基因工程与医学1疾病相关基因的发觉2生物制药3基因诊断4基因治疗5遗传病的防治重组 DNA是指不同来源的DNA分子通过末端共价连接形成重新组合的DNA的过程；第一节概述一、相关的概念一 DNA克隆 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合称克隆；猎取同一拷贝的过程称为克隆化,即无性繁衍；应用酶学的方法,在体外将各种来源的遗传物质同源的或异源的、原核的或真核的、自然的或人工的 DNA与载体 DNA连接,合成具有自我复制才能的DNA分子 复制子 ,继而通过转化或转染宿主细胞,挑选出含有目的基因的转化子细胞,再进行扩增、提取获得大量同一 DNA分子的过程,也称基因克隆或重组 DNA；实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程,又称重组 DNA工艺学；二限制性核酸内切酶是识别 DNA的特异序列,并在识别位点或其四周切割双链DNA的一类内切酶；限制性核酸内切酶可以把 DNA切成长度不同的片段,是重组 DNA中重要的工具酶；如 Bam H三目的基因 应用 DNA重组技术的目的：别离、猎取某一感爱好的基因或 DNA序列；获得感爱好基因的表达产物蛋白质；这些感爱好的基因或 DNA序列就是目的基因；即纯化的特定基因靶基因；四基因载体第1页名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页,共 8 页精选学习资料 - - - - - - - - - 临床执业医师考试辅导 生物化学游离的外源 DNA是不能复制的,需将外源基因连接到有自我复制及表达才能的 DNA分子上；基因载体：为携带目的基因,实现其无性繁衍或表达的有意义的蛋白质所采纳的一些 DNA分子；在重组 DNA中常用的载体包括质粒 DNA、噬菌体 DNA、柯斯质粒载体粘粒、病毒 DNA和人工染色体等类型；载体分为克隆载体和表达载体为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体 ；表达载体 ；为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为二、基因工程基本原理一目的基因的猎取目的基因主要有以下几种来源：1.cDNA 文库以 mRNA做模板通过反转录的方式获得的 DNA；2. 基因组 DNA文库用限制性内切酶切割组织或细胞染色体,得到所需 DNA基因片断；3. 聚合酶链式反应PCR用体外快速扩增方法得到所需目的基因；4. 化学合成法已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列用 DNA合成仪合成；二克隆载体的挑选克隆载体的 挑选的标准 ；第2页名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页,共 8 页精选学习资料 - - - - - - - - - 临床执业医师考试辅导 生物化学2. 平端连接；限制性内切酶切割产生的平端、粘端补齐或切平形成的平端；3. 同聚物加尾连接；在末端转移酶的作用下,在 DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端,再进行粘端连接；4. 人工接头连接；由平端加上新的酶切位点,再用限制酶切除产生粘性末端,而进行粘端连接；四重组体 DNA导入受体菌 1. 受体菌条件1安全宿主菌；2限制酶和重组酶缺陷；3处于感受态；在 0- 4下用氯化钙处理增加细胞膜的通透性成为感受态细胞；第3页名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页,共 8 页精选学习资料 - - - - - - - - - 临床执业医师考试辅导 生物化学2. 导入方式：转化、转染和感染；通过自动猎取或人为地供应外源 真核细胞主动摄取或被动导入外源 细胞的过程；五重组体的挑选DNA,使细菌或培育的受体细胞获得新的遗传表型,称为转化作用；DNA片段而获得新的表型的过程称为转染；即将表达载体导入真核外源重组 DNA导入宿主细胞后,首要任务是要挑选含有目的基因的转化菌并加以扩增；1. 直接挑选法1抗药性标记挑选是挑选重组体最常用的方法；R如重组体携带某种抗药性标志基因,生存并形成菌落,据此可挑选出转化菌；2标志补救只有含这种抗药基因转化的细菌才能在含有该抗生素的培育板上转化或转染的外源基因表达产物可补偿基因缺陷性宿主菌的性状,可以利用养分突变菌株进行挑选；3分子杂交法 用与外源 DNA互补的放射性核素标记探针与重组子 DNA进行杂交挑选；原位杂交：将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交,称为原位杂交；使用 DNA或 RNA探针检测与其互补的另一条链在细菌或其他真核细胞中的位置；Southern 印迹：将待测核酸样品结合在硝酸纤维素膜上,再与溶液中的探针杂交；含有目的基因的 重组 DNA与探针结合而被放射性核素标记；2. 免疫学方法挑选：利用特异抗体与目的基因的表达产物作为抗原之间相互作用进行挑选,不是直接鉴定靶基因；可 分为免疫化学方法及酶免检测分析等；免疫学方法特异性强、灵敏度高,特别相宜于挑选无任何挑选标志的基因；重组 DNA技术操作过程可形象归纳为：分别离目的基因 切限制酶切目的基因与载体第4页名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页,共 8 页精选学习资料 - - - - - - - - - 临床执业医师考试辅导 生物化学接拼接重组体 转转入受体菌 筛挑选重组体六、克隆基因的表达 克隆的目的基因在受体细胞表达出具有生物活性蛋白质；该过程需要正确的基因转录、有效地蛋白质翻译和适当的转录、翻译后加工的过程；这些过程在不同 的表达体系中是不一样的；基因工程依据宿主细胞性质的不同,分为原核表达体系和真核表达体系两大类；其次节 基因工程与医学一、疾病基因的发觉 重组 DNA技术的应用使分子遗传学家有可能依据基因定位,而不是它的功能来克隆一个基因；依据克隆基因的定位和性质所供应的线索,可进一步确定克隆的基因在分子遗传病中的作用；因此,一个疾病相关基因的发觉不仅可导致新的遗传病的发觉,而且对遗传病的诊断和治疗都是极有价值的；二、进展新药物 利用基因工程技术生产有应用价值的药物；如重组疫苗,如乙肝疫苗等；基因工程肽类药物：各种干扰素、细胞介素、生长激素、表皮生长因子、胰岛素等；基因工程抗体；第5页名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页,共 8 页精选学习资料 - - - - - - - - - 临床执业医师考试辅导 生物化学三、 DNA诊断基因诊断人类大多数疾病的发生都与基因有关；基因变异是疾病发生的重要缘由；基因变异包括内源基因的变异基因结构突变、基因表达反常和外源基因的入侵；利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法,直接检测基因结构及其表达水平是否正常,从而对 疾病做出诊断的方法；基因诊断的特点是：针对性强、灵敏度高、适用范畴广、可以做到早期诊断；四、基因治疗 早期是指用正常的基因整合入细胞基因组,以校正和置换致病基因的一种治疗方法；目前广义上来讲是指 将某种遗传物质转移到患者细胞内,使其在体内发挥作用,以到达治疗疾病目的 的方法 ；基因治疗的基本方法有：1. 基因矫正；将致病基因的突变碱基序列订正,正常部分保留；2. 基因置换；用正常的基因导入到功能有缺陷的细胞内,矫正或置换致病基因,使细胞内的 DNA完全复原正常状态；3. 基因增补；将正常基因导入病变细胞或其他细胞,目的基因的表达产物能补偿缺陷细胞的功能或使原有的某些功第6页名师归纳总结 - - - - - - -第 6 页,共 8 页精选学习资料 - - - - - - - - - 临床执业医师考试辅导 生物化学能得以加强；4. 基因失活；利用反义技术针对性的封闭某些基因使之有害的表达受到抑制；五、遗传病的防治 1. 产前诊断；2. 携带者测试；3. 症候前诊断；4. 遗传病易患性；练习题1. 关于基因工程的表达错误的选项是 A. 也称基因克隆 B. 只有质粒 DNA能被用作载体 C.需要供体 DNA D.重组 DNA转化或转染宿主细胞 E. 重组 DNA需进一步纯化、传代和扩增【答疑编号 911130101】【答案】 B 2. 有关抱负质粒载体的特点正确的选项是 A. 为线性单链 DNA B. 含有多种限制酶的单一位点 C.含有同一限制酶的多个位点 D.其复制受宿主菌掌握 E. 不含耐药基因【答疑编号 911130102】【答案】 C 3. 重组 DNA的连接方式不包括 A. 粘性末端连接 B. 平头末端连接 C.粘性末端与平头末端连接 D.DNA连接子技术 E.DNA适配子技术【答疑编号 911130103】【答案】 C 4. 基因治疗的基本方法不包括 A. 基因突变 B. 基因校正 C.基因置换 D.基因增补 E. 基因失活第7页名师归纳总结 - - - - - - -第 7 页,共 8 页精选学习资料 - - - - - - - - - 临床执业医师考试辅导 生物化学【答疑编号 911130104】【答案】 A第8页名师归纳总结 - - - - - - -第 8 页,共 8 页
