肿瘤分子生物学.doc

肿瘤（tumor）是一类疾病的总称，它们的基本特征是细胞增殖与凋亡失控，扩张性增生形成新生物。肿瘤可分为良性肿瘤（良性肿瘤（benignbenign tumortumor）和恶性肿瘤（）和恶性肿瘤（malignantmalignant tumortumor）。良性肿瘤生长缓慢，虽可增长至相当大的体积，但仍保留正常细胞的某些特性，通常在瘤体外有完整的包膜，手术切除后患者预后良好。绝大多数良性肿瘤基本上是无害的，不引起或很少引起宿主损伤。恶性肿瘤统称为癌症（cancer），它不同于良性肿瘤的最重要的特性是能侵袭周围组织，疾病晚期癌细胞发生远端转移，破坏受侵袭的脏器，最终使机体衰亡，但如能在侵袭转移前切除癌瘤，一般预后明显改善。2、癌细胞的恶性生物学特征（1）失去了对中止细胞增殖信号和细胞分化信号的反应，并可传出自主的细胞生长、增失去了对中止细胞增殖信号和细胞分化信号的反应，并可传出自主的细胞生长、增殖信号。殖信号。（2）逃避了细胞凋亡和衰老，是细胞永生。逃避了细胞凋亡和衰老，是细胞永生。当正常细胞受到严重损伤和营养缺乏时，就发生凋亡并自动解体；而癌细胞并不一定会发生凋亡。体外培养的正常细胞，即使没有受到损伤，约分裂 50 后也会自动停止分裂，最终细胞死亡（细胞衰老）；而癌细胞能无限制地增殖，获得了永生化。这可能与调控细胞凋亡基因的缺陷和端粒酶恢复活性相关。（3）失去细胞的区域性限制，具有了侵袭和转移能力。失去细胞的区域性限制，具有了侵袭和转移能力。例如在体外培养的正常细胞中增殖至彼此接触时，就停止生长和分裂（结出抑制），故细胞呈单层生长，而癌细胞失去了接触抑制，继续分裂而呈多层重叠生长；同时癌细胞表面的识别能力和黏着性发生了改变，使癌细胞不能像不同的正常组织细胞那样保持彼此分开，而能侵入临近组织。（4）自主的血管生成能力自主的血管生成能力，这保证了肿瘤体积增大后和新形成转移肿瘤的血液供应，以维持癌细胞生长和增殖之所需。上述这些癌细胞的恶性特性，使它们能在没有增殖信号的情况下，自主地无限制增殖，当达到一定的体积时就可能侵袭邻近组织，癌细胞还可能脱落进入血液和淋巴液，发生远端转移并扩增，最终导致宿主死亡。3、癌的单克隆起源和异质性除少数例外，癌是原始的、单个癌细胞增殖的后代，除少数例外，癌是原始的、单个癌细胞增殖的后代，即癌为单克隆起源单克隆起源。这一观点已被普遍接受，部分是依据来自 X 染色体上基因表达的观察。妇女有两条 X 染色体，在卵裂的后期其中一条 X 染色体随机失活，如一位基因杂合子的妇女患癌，若是多克隆起源多克隆起源，癌细胞则可能有两种等位基因表达的产物；若是单克隆起源，则癌细胞仅有一种等位基因表达产物，而研究结果证实了癌为单克隆起源。由于与 DNA 修复和细胞分裂等一系列相关基因的缺陷，使癌细胞基因组和染色体的稳定性下降，于是在肿瘤演进过程中，就可能不断产生新的癌细胞干系，它们彼此间免疫系统和治疗等因子作用下，如不能被全部杀灭，就可能选择了恶性程度更高的癌细胞干系，它们继续重复突变、扩增和选择的过程，给治疗带来困难。二、癌基因癌基因是正常细胞基因即原癌基因（原癌基因（proto-oncogeneproto-oncogene）的一种转化形式。它编码具有显性转化性质的调节蛋白，即改变了的单拷贝序列能转化整个细胞，而另一正常序列不能阻断这种转化能力。1.原癌基因的蛋白质产物（1）生长因子 growthgrowth factorfactor生长因子刺激静止期或生长因子刺激静止期或 G0G0 期细胞进入细胞周期期细胞进入细胞周期。这一有丝分裂应答需要两个生长因子互补群之间的协同作用。第一互补群是第一互补群是“感受性因子感受性因子”（competencecompetence factorsfactors），如，如 PDGFPDGF、FGFFGF 或表皮生长因子（或表皮生长因子（epidermalepidermal growthgrowth factorfactor，EGFEGF），它们刺激静止期细胞进入细胞周期的 G1 期。第二互补群是第二互补群是“进行性因子进行性因子”（progressionprogression factorsfactors），如胰岛素样生长因子如胰岛素样生长因子 1 1（insulin-likeinsulin-like growthgrowth factorfactor 1 1，IGF1IGF1），保证细胞开始 DNA 合成。所以，某种生长因子的不适宜表达除了导致对细胞分化的阻断之外，还会导致对细胞生长的不断刺激。（2）生长因子受体 growthgrowth factorfactor receptorreceptor一般来说，生长因子能识别与之相应的生长因子受体肿瘤抑制基因的发现从 1969 年起，Harris 等用体细胞杂交的方法研究肿瘤。他们发现，小鼠的恶性肿瘤细胞与正常小鼠细胞杂交后，产生的杂种细胞失去了恶性表型；接种到适当的宿主体内后不再长瘤。正常细胞中存在肿瘤抑制基因，可以抑制肿瘤细胞的恶性表型。1.RB1RB1 蛋白是一种磷酸化蛋白一种磷酸化蛋白，它能与它能与 DNADNA 结合结合；另外，还有一个 GGAAGTGA 元件，对 TP53 的作用敏感，受它的调节。RB1RB1 蛋白在蛋白在 60%60%以上已研究过的人类肿瘤中失活，以上已研究过的人类肿瘤中失活，50%癌症是由于发生了点突变。肿瘤类型除视网膜母细胞瘤外，包括骨肉瘤、乳腺癌、小细胞肺癌、前列腺癌、膀胱癌等。RB1 蛋白的功能在于维持基因组的完整性。它很可能是通过其多重生物学活性的效能而抑制肿瘤形成的。2.TP53TP53 基因是迄今发现的与人类肿瘤相关性最高的基因，几乎在所有种类的肿瘤中，在 80%以上的肿瘤组织中发现了 TP53 基因的突变。TP53 蛋白是细胞核内的一种序列特异性转录因子。TP53 诱导细胞凋亡。这样，TP53 防止了携带广泛性 DNA 损伤的细胞通过克隆性生长而导致肿瘤。1910 年，Rous 将鸡肉瘤组织的无细胞滤液注射到健康鸡的体内，结果诱发了健康鸡长出肉瘤，从而发现了现在被称为 RousRous 肉瘤病毒（肉瘤病毒（RousRous sarcomasarcoma virusvirus，RSVRSV）的一种 RNA 急性致癌病毒。然而，这一发现在肿瘤研究中长期遭到漠视。20 世纪 60 年代开始，病毒与肿瘤的关系日益受到重视；Rous 终于在 1966 年获诺贝尔医学生理学奖，时年 85 岁。microRNA（miRNA）是一类大小约 22 个核苷酸的非编码小分子 RNA，它们能通过与靶 mRNA的 3UTR（非编码区）完全互补导致 mRNA 降解，或不完全互补结合阻断 mRNA 翻译。以 miRNA为基础的 RNA 干扰（RNAi）技术让科学家们掌握了一种人为控制基因表达的手段，也因此RNAi 发现者获得 2006 年诺奖。许多研究表明利用 miRNAs，能靶向治疗癌症，或者作为癌症早期诊断生物靶标。RNAi 药物相对于传统的小分子药物以及其他生物类药物（如蛋白类药物、疫苗等）有自己独特的优势7-8：（1 1）RNAiRNAi 药物具有高特异性和高效性药物具有高特异性和高效性。siRNA 的干扰效应具有高度的序列特异性，任一碱基错配都会导致 RNAi 效应丧失，因此 RNAi 药物具有很强的靶向性。理论上RNAi可以抑制各种疾病相关基因的表达，也就是说只要明确了各种疾病的RNAi靶点，RNAi药物可以治疗各种疾病。（2）RNAi 药物与其他生物类药物相比，由于分子量小，由于分子量小，RNAiRNAi 药物药物无免疫原性无免疫原性。（3 3）RNAiRNAi 药物设计便利性药物设计便利性，RNAi 药物设计的唯一要求是合成与药物靶点基因mRNA 完全配对的长度大约 20 个碱基的 siRNA 分子，这种便利性大大降低了新药的开发成本，同时有利于研究 RNAi 药物安全性和有效性。1.1 基于肿瘤信号传导途径的 RNAi 治疗药物研究1.2 细胞周期1.3 细胞凋亡1.4 细胞衰老肿瘤信号传导通路是多个因子构成的复杂网络体系，在肿瘤的发生、发展过程中起着重要作用，一些关键基因的变化可以使某条通路处于非常活跃的状态，也可使通路受阻 应用 RNAi 技术的肿瘤模型研究已经找到了一些肿瘤信号传导通路中的关键基因，在肿瘤的形成过程中改变较多的通路有 PTK、MAPK、PC、HGF/SF Met、I3K、Smad、HIF 等NF-kappaNF-kappa B B 是一种重要的转录因子，调控细胞因子、生长因子及细胞粘附分子等的基因表达，与细胞信号转导密切相关。靶向 kappa B P65 的 RNAi研究 8 显示，kappa B P65 表达的下调引起胰腺癌BxPC-3 和 PANC-1 细胞中 Bcl-2 及 procaspase-3蛋白表达下调，Bax 蛋白表达上调，明显降低细胞活力，增大细胞凋亡率。体内抗肿瘤实验中同样能抑制裸鼠移植模型的肿瘤细胞增殖。在在 APCAPC 通路通路，WntWnt 配体结合到受体活化一个叫 Dsh 的中间蛋白，Dsh 通过抑制 GSK 3 的降解使 连环蛋白(catenin)不被降解，在结肠癌中通常缺少 Wnt 信号配体或存在 APC 突变体 catenin 首先在胞质中积累，然后被转移到核仁，在核仁它与转录辅助因子结合激活许多基因的表达 丝氨酸/苏氨酸激酶、酪蛋白激酶或 GSK3 导致的磷酸化使 catenin 的表达水平很低 用脂质体介导的 siRNA 来抑制 catenin 的表达，能抑制直肠癌细胞的增殖21 APC 能影响包括 c Myc 致癌基因在内的许多特殊基因的表达，在对乳腺癌模型的体内、外研究中发现用抗 c Myc 的 siRNA 能使肿瘤细胞的增殖受到抑制22 1982 年，美国科学家 R.A.Weinberg 等人从膀胱癌细胞中克隆得到第一个人类癌基因，由于它和之前发现的鼠肉瘤病毒基因 c-ras 高度同源，故而被命名为 ras 基因（rat sarcoma）。Ras 基因在进化中高度保守，广泛存在于各种真核生物细胞中。哺乳动物的 Ras 蛋白家族有三个成员，分别是 H-ras、K-ras 和N-ras。由于 Ras 蛋白的相对分子量是 21 kDa，故又被称为 p21。Ras 蛋白定位于细胞膜内侧，为 GTP/GDP结合蛋白，通过 GTP 与 GDP 的相互转化来调节信号通路的传递；之后，人们又发现了 Ras 的直接效应因子 Raf-110，这就将 Ras 和 ERK/MAPK 信号通路联系起来。Ras 信号通路构成一个复杂的网络。简单地说，被生长因子激活的酪氨酸激酶受体 RTKs 以直接或间接的方式结合 GRB2（growth factor receptor-bound protein 2）。GRB2 与受体 RTK 结合后招募鸟苷酸交换因子 SOS 蛋白定位在与 Ras 相邻的细胞膜上。这样，SOS 与 Ras 形成复合体后，GTP 取代 GDP 与Ras 结合，Ras 被激活；而当 GTP 被水解成 GDP 后，Ras 失活。Ras 蛋白被激活后，产生一系列级联放大反应。首先，它招募细胞浆内的 Raf1 蛋白至细胞膜上。之后，Raf 激酶磷酸化 MAPK 激酶（MAPKK，又称 MEK），再由 MEK 激活 ERK1/2（extracellular signal regulated kinase，又称 MAPK）。ERK 被激活后，转至细胞核内并直接激活转录因子，产生相应的生物学效应。需要特别指出的是，Raf 的激活并不完全依赖于 Ras，ERK 也能被除 Ras 之外的其它蛋白激活。这表明信号通路级联反应中的每一个信号蛋白都可能被多个上游蛋白所控制，而它们也可以有多个下游的靶蛋白，从而形成一个极其复杂的网络调控结构。Ras 信号致癌的机理。在超过 60%的人类恶性黑色素瘤中，都发现了 B-raf 的激活突变，这种突变还存在于一些直肠癌以及甲状腺和肺部的肿瘤中。B-raf 突变后，在某些情况下与 C-raf 形成异源二聚体，随后持续地激活下游的 ERK 信号，并最终激活蛋白激酶 mTOR。肿瘤细胞中也存在不涉及 Ras 本身的突变而又持续激活 Ras 的情况。NF1 基因是最早被发现的肿瘤抑制基因之一，它是一个 GAP 蛋白（GTPase-activating protein）。NF1 基因缺失突变后，由于 GTP 水解的减少而导致 GTP 结合形式的Ras 蛋白的积累，从而提高 Ras 的活性。除此之外，降低 miRNA let-7 的表达使靶基因 Ras mRNA 增加，也能提高 Ras 的活性。这里所提到的这些蛋白成分都是未来很好的药物靶点分子。20%的人类肿瘤在 Ras 上有激活突变位点 大部分突变发生在 KRas(约 85%)在对人类胰脏癌的研究中，病毒介导的 RNAi 可以用于抗 KRasv12 活性mTOR（mammalian target of rapamycin）是一类丝/苏氨酸激酶。1991 年，人们在酵母中发现了雷帕霉素（rapamycin）的作用靶点，取名为 TOR7。与酵母相比，哺乳动物的 TOR蛋白在进化和功能上高度保守，也就相应地称为 mTOR8。mTOR 蛋白的 C 末端具有激酶活性，它是细胞生长和增殖的关键调节分子，它是细胞生长和增殖的关键调节分子，可接收生长因子、营养、能量等多种信号，并通并通过过PI3K/AKTPI3K/AKT 或或 Ras/ERKRas/ERK 信号通路来发挥作用，而对信号通路来发挥作用，而对 mTORmTOR 信号通路的抑制可以使细胞停滞信号通路的抑制可以使细胞停滞在在G1G1 期而触发细胞凋亡。期而触发细胞凋亡。起初，p53 被误认为是癌基因，直到上个世纪 90 年代，人们才认识到引起肿瘤形成或细胞癌变的 p53 蛋白是 p53 基因的突变产物。野生型 p53 基因是一种重要的抑癌基因，它是细胞生长周期中的负调节因子，在细胞周期调控、DNA 损伤修复、细胞分化、凋亡和衰老等许多过程中发挥了重要的生物学功能，因而被誉为“细胞卫士”（如图 6）。2)p53 信号通路P53 是一种转录因子，处于多种凋亡通路的连接点位置，在 50%的肿瘤细胞中是失活的 p53 基因受多种信号因子的调控。例如：当细胞中的 DNA 损伤或细胞增殖异常时，p53 基因被激活，导致细胞周期停滞并启动 DNA 修复机制，使损伤的 DNA 得以修复。然而，当 DNA 损伤过度而无法被修复时，作为转录因子的 p53 还可进一步激活下游促凋亡基因的转录，诱导细胞凋亡并杀死有 DNA 损伤的细胞。不然，这些 DNA 损伤的细胞就可能逐渐脱离正常的调控，有可能最终形成肿瘤。虽然正常状态下 p53 的 mRNA 水平很高，而且有大量蛋白质合成，但 p53 蛋白容易降解，所以正常细胞内 p53 蛋白水平很低。蛋白的泛素化（ubiquitination）修饰是细胞内蛋白代谢过程中的最普通的降解方式，p53 蛋白的降解也是通过泛素化来实现的。MDM2 是一种特异性针对 p53 的泛素化 E3 连接酶，它可直接与 p53 蛋白结合来促进 p53 蛋白的泛素化降解，并在细胞内 p53 蛋白动态平衡中发挥关键的作用。MDM2 本身也可被 p53 蛋白激活，因此 MDM2 是p53 通路中重要的负反馈调节因子（negative feedback regulator）。3)p53 与肿瘤p53 基因敲除小鼠虽然可以产生后代，但其生长发育过程中会出现高频率的自发性肿瘤，这提示 p53 蛋白与肿瘤之间存在密切的关系。事实上，目前 TP53 基因是与人类肿瘤的相关性最高的基因，与 50%以上的人类恶性肿瘤有关，而且现正已在超过 51 种人类肿瘤病例中发现 TP53 基因的异常表达和功能失活。TP53 基因突变是其功能失活的主要原因，而最常见的突变方式是点突变。此外，某些点突变改变了 p53 的空间构象，影响了 p53 蛋白与 MDM2 和 p300 等蛋白的相互作用。另一些点突变发生在 p53 的核定位信号区，使 p53 无法进入细胞核发挥转录激活的功能。目前看来，在肿瘤形成的复杂网络和调控体系中，p53 是最主要的因素。有人认为 p53 是很好的肿瘤诊断标志物，可以作为癌症早期诊断的重要指标。认识到 p53 基因的重要作用后，全世界数以千计的分子生物学家正在抛开原来的课题转而研究 p53，希望以此作为攻克癌症的突破口。科学家相信，利用 p53 基因发现并治疗癌症的前景非常广阔。除了基因治疗，研究人员正在筛选可以影响 p53 基因上下游调控的小分子化合物。罗氏制药公司开发的一种名为 nutlins 的小分子化合物，能够干扰 p53 和 MDM2 之间的调控关系，有望成为一种有效的抗癌药物。在子宫癌，E6 的致癌功能是通过灭活 p53 而起作用，然后本身失活，最终被降解 在人乳头瘤病毒18 阳性子宫癌细胞中，siRNA 抑制 E6 的表达能诱导细胞死亡30 在许多肿瘤细胞的凋亡中发现有 Caspase 的活化。目前也已经发现一系列新的与 Caspase有关的诱导凋亡的方法来治疗肿瘤，对大部分肿瘤有实际意义，并可望在恶性肿瘤的治疗方面取得新的突破。Bcl-2 被认为是细胞凋亡蛋白家族中最重要的调控蛋白，和 Bcl-2，Bax，Bad，Bak 等共同组成了 Bet-2 蛋白家族。Bcl-2 家族分为两大类:一类是抗凋亡蛋白,主要包括 Bcl-2、Bcl-xL 和 Bcl-w 等;另一类是促凋亡蛋白,主要包括 Bax、Bak、Bid、Bim 和 Bad 等。细胞凋亡的失调是导致肿瘤发生的因素之一，Bcl 2 基因具有抑制细胞凋亡的功能 在人前列腺肿瘤小鼠模型中，抗 Bcl 2 的 siRNA 具有很强的抗肿瘤活性23