离子交换层析 (2)精选PPT.ppt
关于离子交换层析(2)14.10.2022海南大学农学院wss1第1页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss2离子交换层析的概念离子交换层析的概念 离子交换层析是利用分离物（蛋白质）表面的离子交换层析是利用分离物（蛋白质）表面的荷电的荷电的离子或基团离子或基团与与带相反电荷带相反电荷的不溶性基质（离子交换剂）进的不溶性基质（离子交换剂）进行可逆的交换。行可逆的交换。更确切地，是先用蛋白质偶极离子置换基质官能更确切地，是先用蛋白质偶极离子置换基质官能团上的平衡离子（反离子），然后蛋白质本身又随着团上的平衡离子（反离子），然后蛋白质本身又随着平衡离子的比例的增加而被置换下来。根据蛋白质各平衡离子的比例的增加而被置换下来。根据蛋白质各组分所带电荷的性质及电荷量的差异，被置换的速度组分所带电荷的性质及电荷量的差异，被置换的速度不同而在层析过程中达到分离。不同而在层析过程中达到分离。第2页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss3内容提要内容提要第一节第一节 基本原理基本原理第二节第二节 离子交换剂的分类与性质离子交换剂的分类与性质第三节第三节 操作操作第四节第四节 应用应用第3页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss4第一节第一节基本原理基本原理1.1.离子交换剂离子交换剂2.2.交换反应交换反应3.3.原理原理4.4.离子交换剂与离子结合的关系离子交换剂与离子结合的关系5.5.两性电解质与离子交换剂的结合力两性电解质与离子交换剂的结合力第4页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss5 离子交换层析是在以离子交换层析是在以离子交换剂离子交换剂为固定相，为固定相，液体液体为流动相的系统中进为流动相的系统中进行的。行的。第5页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss6 纤维素纤维素O OCHCH2 2COOCOO一一NaNa+基质基质 电荷基团电荷基团 反离子反离子 羧甲基纤维素离子交换剂组成示意图羧甲基纤维素离子交换剂组成示意图1.1.离子交换剂离子交换剂 （1 1）离子交换剂）离子交换剂：即是通过化学键合的方：即是通过化学键合的方法向惰性支持物上连接可解离的化学基团后的法向惰性支持物上连接可解离的化学基团后的产物。产物。由由基质、电荷基团基质、电荷基团（或功能基团）和（或功能基团）和反反离子离子构成。构成。第6页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss7阴离子交换剂与阳离子交换剂的基本构成：阴离子交换剂与阳离子交换剂的基本构成：基质电荷基团反离子（反离子基团）基质电荷基团反离子（反离子基团）阴离子交换剂阴离子交换剂阳离子交换剂阳离子交换剂第7页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss8RA+B+RB+A+RA RA代表阳离子交换剂，它在溶液中代表阳离子交换剂，它在溶液中解离出来的阳离子解离出来的阳离子A A+与溶液中的阳离与溶液中的阳离子子B B+能发生可逆的交换反应。能发生可逆的交换反应。2.2.交换反应交换反应第8页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss9离子交换反应离子交换反应：R-A+B+R-B+A+平衡常数表示离子交换剂对溶液中不同离子的亲和平衡常数表示离子交换剂对溶液中不同离子的亲和力：力：A B AB RBRA+K =A=B KA B=RBRA+KA B=1RARBKA B 1RARBKA B1RB=RA第9页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss10 K KA AB B值反映离子交换剂对不同离子的值反映离子交换剂对不同离子的亲合亲合力或选择性的参数力或选择性的参数，称，称K KA AB B值为离子交换剂对值为离子交换剂对A A+和和B B+的的选择系数选择系数。第10页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss113.3.离子交换层析的原理离子交换层析的原理n利用蛋白质及欲分离的生物分子带电性质的差异利用蛋白质及欲分离的生物分子带电性质的差异为分离依据；为分离依据；n带电荷的蛋白质样品可以与离子交换剂的带正带电荷的蛋白质样品可以与离子交换剂的带正电荷或负电荷的基团结合；电荷或负电荷的基团结合；n蛋白质样品同离子交换剂的结合力取决于彼此间相蛋白质样品同离子交换剂的结合力取决于彼此间相反电荷基团的静电吸引力，反电荷基团的静电吸引力，pHpH影响这种吸引力；影响这种吸引力；n蛋白质的洗脱通过改变洗脱液的盐离子强度和蛋白质的洗脱通过改变洗脱液的盐离子强度和pHpH来来完成。完成。第11页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss12 大分子依其与离子交换剂大分子依其与离子交换剂亲和力的不同亲和力的不同，而以不同牢度被吸附于离子交换剂上，通而以不同牢度被吸附于离子交换剂上，通过改变过改变离子强度离子强度或或(和和)pHpH使大分子再从离子使大分子再从离子交换剂上先后被洗脱下来。交换剂上先后被洗脱下来。第12页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss13混合样品带混合样品带负电荷，与负电荷，与阴离子交换阴离子交换剂结合。剂结合。样品样品 碱性碱性较弱，吸附力较弱，吸附力较弱，用低浓较弱，用低浓度盐洗脱。度盐洗脱。样品样品 碱性强，碱性强，与交换剂结合牢，与交换剂结合牢，解脱难。用高浓解脱难。用高浓度盐洗脱。度盐洗脱。各样品带电荷不同，与各样品带电荷不同，与离子交换剂的结合能力不离子交换剂的结合能力不同。依解离的难易的差异同。依解离的难易的差异，而达到分离。，而达到分离。第13页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss14离子交换层析示意图离子交换层析示意图第14页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss15What happens in ion exchange?Sampleapplicationand washElutionEquilibrationRegeneration-+-第15页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss16What happens in ion exchange?Equilibration+-anion exchange bead第16页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss17What happens in ion exchange?Sample applicationand wash-+-第17页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss18What happens in ion exchange?Elution-+-第18页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss19What happens in ion exchange?Regeneration-+第19页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss204.离子交换剂与离子结合的关系离子交换剂与离子结合的关系n强酸性离子交换剂、强碱性离子交换剂对各种强酸性离子交换剂、强碱性离子交换剂对各种反离子的结合与否以及结合力的强弱遵循一定反离子的结合与否以及结合力的强弱遵循一定的规律；并对样品选择离子交换剂、洗脱液离的规律；并对样品选择离子交换剂、洗脱液离子类型、子类型、pHpH状态都至关重要。状态都至关重要。n离子交换剂与各种水合离子的结合力是与离子离子交换剂与各种水合离子的结合力是与离子的电荷量成正比，与水合离子的半径的平方成的电荷量成正比，与水合离子的半径的平方成反比关系。反比关系。第20页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss21离子交换剂在溶液中与水合离子结合能力的趋势离子交换剂在溶液中与水合离子结合能力的趋势n结论：离子价数愈高，结合力愈大。结论：离子价数愈高，结合力愈大。n离子间电荷相同时，离子的原子序数愈高，水离子间电荷相同时，离子的原子序数愈高，水合离子半径愈小，结合力愈大。合离子半径愈小，结合力愈大。n故元素周期表中离子结合力的趋势的方向故元素周期表中离子结合力的趋势的方向为：从小至大。为：从小至大。(P71(P71表表5-1)5-1)第21页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss225.两性电解质与离子交换剂的结合力两性电解质与离子交换剂的结合力n蛋白质、酶、多肽、核苷酸及核酸等两性电解蛋白质、酶、多肽、核苷酸及核酸等两性电解质与离子交换剂的结合力取决于其质与离子交换剂的结合力取决于其本身的物理本身的物理化学性质化学性质和在和在特定特定pHpH条件下条件下呈现的呈现的离子状态离子状态。n当当pHpI,pHpI,带正电荷，被阳离子交换剂吸附。带正电荷，被阳离子交换剂吸附。npHpI,pHpI,带负电荷，被阴离子交换剂吸附。带负电荷，被阴离子交换剂吸附。npIpI离离pHpH愈远，分离物所带电荷越强，越容易被愈远，分离物所带电荷越强，越容易被离子交换剂吸附，吸附力强，越难解吸附。离子交换剂吸附，吸附力强，越难解吸附。第22页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss23内容提要内容提要第一节第一节 基本原理基本原理第二节第二节 离子交换剂的分类与性质离子交换剂的分类与性质第三节第三节 操作操作第四节第四节 应用应用第23页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss24第二节第二节 离子交换剂的分类与性质离子交换剂的分类与性质n离子交换剂的基本要求：离子交换剂的基本要求：1.1.高度的不溶性；高度的不溶性；2.2.多孔的结构，巨大的表面积；多孔的结构，巨大的表面积；3.3.丰富的交换基团；丰富的交换基团；4.4.稳定的物理化学性质。稳定的物理化学性质。第24页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss25一、分类一、分类A.阳离子交换剂是在不溶阳离子交换剂是在不溶性载体上性载体上,结合有中性结合有中性pHpH下带负电荷的官能团下带负电荷的官能团（羧甲基或磺丙基基团）（羧甲基或磺丙基基团）。这类树脂适合于分离。这类树脂适合于分离等电点在中性以上的蛋等电点在中性以上的蛋白质。白质。n三角形代表负电荷的官能三角形代表负电荷的官能团，释放的反离子带正电团，释放的反离子带正电荷。荷。+-+-第25页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss26阴离子交换剂带正电荷阴离子交换剂带正电荷官能团，反离子带负电官能团，反离子带负电荷。荷。B.B.阴离子交换剂的官能阴离子交换剂的官能团（二乙氨乙基团（二乙氨乙基DEAEDEAE或季氨碱或季氨碱QAEQAE）树脂在）树脂在中性中性pHpH条件带正电荷。条件带正电荷。释放的反离子带负电荷，释放的反离子带负电荷，在中性在中性pHpH时能与酸性时能与酸性蛋白质相互作用。蛋白质相互作用。+_+_第26页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss27离子交换树脂的基本类型离子交换树脂的基本类型阳离子交换剂阳离子交换剂强酸性强酸性 弱酸性弱酸性阴离子阴离子强碱性强碱性交换剂交换剂弱碱性弱碱性交换基团交换基团磺酸基磺酸基羧酸基羧酸基季铵基季铵基伯、仲铵基伯、仲铵基交换离子交换离子-SO-SO3 3H H-COOH-COOH-NH-NH3 3-NHR-NHR、-NH-NH2 2工作范围工作范围（pHpH）1 114147 714140 012120 07 7水解稳定性水解稳定性稳定稳定易水解易水解稳定稳定易水解易水解离子吸附速离子吸附速度度 大大H H 型小型小 大大OHOH型小型小第27页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss28请记住：请记住：n阳离子交换剂本身带酸性基团，在其阳离子交换剂本身带酸性基团，在其pKpK以上荷负以上荷负电。电。n阳离子分为：阳离子分为：强酸性、中强酸性、弱酸性强酸性、中强酸性、弱酸性n阴离子交换剂本身带碱性基团，在其阴离子交换剂本身带碱性基团，在其pKpK以下以下荷正电。荷正电。n阴离子分为：阴离子分为：强碱性、中强碱性、弱碱性强碱性、中强碱性、弱碱性第28页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss291.1.疏水性离子交换剂疏水性离子交换剂n疏水性离子交换剂中的基质是人工合成的、疏水性离子交换剂中的基质是人工合成的、与水结合力较小的物质，称为树脂。其基质与水结合力较小的物质，称为树脂。其基质的化学本质是苯乙烯和二乙烯苯合成呈网状的化学本质是苯乙烯和二乙烯苯合成呈网状的聚合体，引入不同的电荷基团。的聚合体，引入不同的电荷基团。第29页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss30疏水性离子交换剂具有如下特性而被广泛应用：疏水性离子交换剂具有如下特性而被广泛应用：n 大量的活性基团大量的活性基团 n 较高的交换容量较高的交换容量n 良好的机械强度良好的机械强度n 稳定的物理化学性质稳定的物理化学性质n 均匀的球形颗粒、型号齐全以及丰富的产均匀的球形颗粒、型号齐全以及丰富的产品品第30页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss312.2.亲水性离子交换剂亲水性离子交换剂 亲水性离子交换剂的基质是一类天然的亲水性离子交换剂的基质是一类天然的或人工合成的、与水结合力较大的物质。或人工合成的、与水结合力较大的物质。有：有：纤维素纤维素Sephacel、交联葡聚糖交联葡聚糖 Sephadex 交联琼脂糖交联琼脂糖 Sepharose第31页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss321 1）纤维素）纤维素SephacelSephacel离子交换剂离子交换剂n基本结构基本结构:以微晶纤维素为基质，化学方法引入电荷基团，以微晶纤维素为基质，化学方法引入电荷基团，构成各种阳离子、阴离子交换剂构成各种阳离子、阴离子交换剂;示弱阴离子树脂的结构示弱阴离子树脂的结构（DEAE-Sephacel）Beaded Cellulose-O-CH2-CH2N+-H-Cl-CH2CH3CH2CH3第32页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss33第33页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss342)2)交联葡聚糖交联葡聚糖SephadexSephadex离子交换剂离子交换剂n以交联葡聚糖以交联葡聚糖G G2525和和G G5050为基质，化学法引入为基质，化学法引入电荷基团构成各种阴离子、阳离子交换剂电荷基团构成各种阴离子、阳离子交换剂。（DEAE-Sephadex、QAE-Sephadex）。）。nDEAE-Sephadex-O-CH2-CH2-N+-H-Cl-QAE-Sephadex-O-CH2-CH2-N+-CH2-CH(OH)-CH3-Cl-CH2CH3CH2CH3CH2CH3CH2CH3第34页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss35第35页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss363)3)琼脂糖琼脂糖SepharoseSepharose离子交换剂离子交换剂n以交联琼脂糖以交联琼脂糖CL-6BCL-6B为基质，化学法引入电荷为基质，化学法引入电荷基团构成阳离子交换剂基团构成阳离子交换剂 CMCM Sepharose CL-Sepharose CL-6B6B和阴离子交换剂和阴离子交换剂 DEAE-Sepharose CL-6BDEAE-Sepharose CL-6B。nCM(Sepharose Cl-6B)-O-CH2-C-02Na+nDEAE-Sepharose Cl-6B-O-CH2-CH2-N+-H-Cl-CH2-CH3CH2-CH3第36页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss37亲水性离子交换剂的结构亲水性离子交换剂的结构n琼脂糖离子交换剂的基琼脂糖离子交换剂的基本结构以交联琼脂糖本结构以交联琼脂糖CLCL6B Sepharose 6B Sepharose 为基为基质。其网孔的大小通过质。其网孔的大小通过交联剂的比例调节，适交联剂的比例调节，适合分离各种不同分子量合分离各种不同分子量的物质。的物质。第37页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss38Scanning electron micrograph of an agarose gelMagnification x 50,000Ref:Anders S.Medin,PhD Thesis,Uppsala University 1995第38页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss39二、离子交换剂的性质二、离子交换剂的性质1.1.颜色与形状颜色与形状2.2.交联度交联度3.3.吸水量或膨胀度吸水量或膨胀度4.4.交换容量交换容量5.5.稳定性稳定性6.6.比重比重7.7.流速流速第39页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss40离子交换剂的性质离子交换剂的性质1.1.颜色与形状颜色与形状2.2.交联度交联度:离子交换剂的基质的交联度根据适用的要求，离子交换剂的基质的交联度根据适用的要求，调节交联剂在基质中的比例或百分浓度而制成各种（筛调节交联剂在基质中的比例或百分浓度而制成各种（筛孔）型号的交换剂。孔）型号的交换剂。3.3.吸水量与膨胀度：吸水量与膨胀度：是指离子交换剂在水溶液中吸取的是指离子交换剂在水溶液中吸取的体积，即筛孔中所占的体积（体积，即筛孔中所占的体积（ViVi）。吸水量与膨胀）。吸水量与膨胀度受基质的性质、离子强度、度受基质的性质、离子强度、pHpH、电荷基团及交联、电荷基团及交联度的影响。度的影响。4.4.交换容量：交换容量：离子交换剂与溶液中离子或离子化合物进行离子交换剂与溶液中离子或离子化合物进行交换的能力。交换的能力。第40页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss41离子交换剂的膨胀度与离子强度离子交换剂的膨胀度与离子强度的关系的关系1 1）在相同离子强度的条件时）在相同离子强度的条件时,膨胀度随着基质的交联度膨胀度随着基质的交联度的增加而降低。的增加而降低。2 2）在相同离子强度的条件时，强酸、强）在相同离子强度的条件时，强酸、强碱型的离子交换剂的膨胀度大，弱酸、碱型的离子交换剂的膨胀度大，弱酸、弱碱的膨胀度小。说明前者的解离度弱碱的膨胀度小。说明前者的解离度达最大，带电荷基团之间的排斥力大，达最大，带电荷基团之间的排斥力大，结果膨胀度亦大。结果膨胀度亦大。第41页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss42pHpH对离子交换剂膨胀度的影响对离子交换剂膨胀度的影响弱阳离子交换剂的膨弱阳离子交换剂的膨胀度随着胀度随着pHpH的增高而的增高而增大增大弱阴离子交换剂的膨胀弱阴离子交换剂的膨胀度随着度随着pHpH的降低而增大的降低而增大弱离子交换剂在其弱离子交换剂在其近近pKpK值时的值时的pHpH中膨胀中膨胀度最小度最小交联度大的或带强电荷基交联度大的或带强电荷基团的离子交换剂，其膨胀团的离子交换剂，其膨胀度基本与度基本与pHpH的变化无关的变化无关第42页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss43离子交换剂的性质离子交换剂的性质1.1.颜色与形状颜色与形状2.2.交联度交联度:离子交换剂的基质的交联度根据适用的要求，离子交换剂的基质的交联度根据适用的要求，调节交联剂在基质中的比例或百分浓度而制成各种（筛调节交联剂在基质中的比例或百分浓度而制成各种（筛孔）型号的交换剂。孔）型号的交换剂。3.3.吸水量与膨胀度：吸水量与膨胀度：是指离子交换剂在水溶液中吸取的是指离子交换剂在水溶液中吸取的体积，即筛孔中所占的体积（体积，即筛孔中所占的体积（ViVi）。吸水量与膨胀度）。吸水量与膨胀度受基质的性质、离子强度、受基质的性质、离子强度、pHpH、电荷基团及交联度、电荷基团及交联度的影响。的影响。4.4.交换容量：交换容量：离子交换剂与溶液中离子或离子化合物离子交换剂与溶液中离子或离子化合物进行交换的能力。进行交换的能力。第43页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss44交换容量的影响因素交换容量的影响因素n筛孔：筛孔：筛孔的直径与分离物的分子量大小密筛孔的直径与分离物的分子量大小密切相关。切相关。(表表 P76)P76)n离子强度：离子强度：离子强度的增加引起对交换剂上离子强度的增加引起对交换剂上结合蛋白质位点的竞争，而降低交换容量，结合蛋白质位点的竞争，而降低交换容量，在解离中便利用逐渐加大离子强度的原理。在解离中便利用逐渐加大离子强度的原理。第44页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss45pHpH与交换容量的关系与交换容量的关系弱阴离子弱阴离子交换剂的交交换剂的交换容量是随换容量是随着着pHpH的下的下降而增大降而增大弱阳离子弱阳离子交换剂的交换容量是随着交换剂的交换容量是随着pHpH的上的上升而增大升而增大强阴离子与强阳离子交换剂的交换容量基强阴离子与强阳离子交换剂的交换容量基本与本与pHpH变化无关，因其完全呈解离状态，始终变化无关，因其完全呈解离状态，始终很高很高第45页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss46交换容量的影响因素交换容量的影响因素n若加样量超过树脂的容量，宝贵的活性会随着未吸若加样量超过树脂的容量，宝贵的活性会随着未吸附的物料一起流失；若树脂过量，会大大减少活性附的物料一起流失；若树脂过量，会大大减少活性物质的回收。测定实验：物质的回收。测定实验：第46页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss47注注 意意n交换容量包含样品中的总蛋白量，而非仅交换容量包含样品中的总蛋白量，而非仅仅是活性蛋白。仅是活性蛋白。n各种蛋白样品与树脂的交换容量是不同的，各种蛋白样品与树脂的交换容量是不同的，应分别测定。应分别测定。n放大实验时，应适当留一定的结合空间，放大实验时，应适当留一定的结合空间，并使之在最小量。并使之在最小量。第47页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss48最佳上样最佳上样pHpH的选择的选择pH 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 9.0+S S S S S S4,3060min摇匀，充分结合摇匀，充分结合 -在低的在低的pHpH时，蛋白质未结合，上清有活性，随着时，蛋白质未结合，上清有活性，随着pHpH的上的上升，蛋白质与树脂结合愈多，直至完全结合升，蛋白质与树脂结合愈多，直至完全结合 ，上清中，上清中再检测不到活性。再检测不到活性。+离心，检测上清的活性离心，检测上清的活性最佳上样时最佳上样时高于缓冲高于缓冲液一个液一个pHpH第48页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss495 5 稳定性：稳定性：都具有理化稳定性。都具有理化稳定性。6 6 比重：比重：7 7 流速：流速：第49页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss50内容提要内容提要第一节第一节 基本原理基本原理第二节第二节 离子交换剂的分类与性质离子交换剂的分类与性质第三节第三节 操作操作第四节第四节 应用应用第50页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss51第三节第三节 操操 作作一、离子交换剂的选择、处理与转型一、离子交换剂的选择、处理与转型二、缓冲液的选择二、缓冲液的选择三、分离物质的交换三、分离物质的交换四、程序四、程序第51页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss52一、离子交换剂的选择、处理与转型一、离子交换剂的选择、处理与转型被分离物质带正电荷，选择阳离子交换剂；被分离物质带正电荷，选择阳离子交换剂；被分离物质带负电荷，选择阴离子交换剂；被分离物质带负电荷，选择阴离子交换剂；被分离物质为两性离子，依据其在稳定的被分离物质为两性离子，依据其在稳定的pHpH范围内范围内所带电荷选择交换剂。所带电荷选择交换剂。阴离子交换剂结合带阴离子交换剂结合带 阳离子交换剂结合带阳离子交换剂结合带 负电荷负电荷的蛋白质的蛋白质 正电荷的蛋白质正电荷的蛋白质第52页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss53n对于已知对于已知pIpI的物质：的物质：在高于其等电点的在高于其等电点的pHpH，用，用阴离子交换剂；在低于其等电点的阴离子交换剂；在低于其等电点的pHpH，用阳离，用阳离子交换剂。子交换剂。n对于未知对于未知pIpI的物质：的物质：可参照电泳的结果，在中可参照电泳的结果，在中性或偏碱性的条件下进行电泳，向阳极移动较快性或偏碱性的条件下进行电泳，向阳极移动较快的物质，在同样条件下可被阴离子交换剂吸附；的物质，在同样条件下可被阴离子交换剂吸附；向阴极移动或向阳极移动较慢的，可被阳离子交向阴极移动或向阳极移动较慢的，可被阳离子交换剂吸附。换剂吸附。第53页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss54离子交换剂的选择的原则离子交换剂的选择的原则分离生物大分子一般采用亲水性基质。具有可人工控分离生物大分子一般采用亲水性基质。具有可人工控制的分子筛，及较多的可交换的基团；制的分子筛，及较多的可交换的基团；分离酶、核酸、蛋白质等采用弱性的离子交换剂。其交换分离酶、核酸、蛋白质等采用弱性的离子交换剂。其交换容量大，亲水性，对生物样品的稳定性好，易发生结合；容量大，亲水性，对生物样品的稳定性好，易发生结合；洗脱液的洗脱液的pHpH与被分离物的与被分离物的pIpI至少相差一个至少相差一个pHpH值，才能将值，才能将各种成份分开。各种成份分开。pHpIpHpI一个单位时选择阴离子交换剂；一个单位时选择阴离子交换剂；pHpIpHpI一个单位时选择阳离子交换剂。一个单位时选择阳离子交换剂。第54页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss55离子交换剂的选择的原则离子交换剂的选择的原则 例：例：。npIpI5.25.2的物质在不同的的物质在不同的pHpH条件下带电荷性质、带条件下带电荷性质、带净电荷量不同，而能分别净电荷量不同，而能分别与阳离子、阴离子交换剂与阳离子、阴离子交换剂结合。结合。n实验上选择阴离子，因为实验上选择阴离子，因为从从pH6.2pH6.28.58.5条件温和。条件温和。不影响生物样品活性；不影响生物样品活性；选择阳离子时，选择阳离子时，pHpH从从4.24.23.03.0，条件极端，可能使，条件极端，可能使样品失去活性。样品失去活性。第55页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss562.2.离子交换剂的处理、再生和转型离子交换剂的处理、再生和转型目的：目的：要求其带上使用时所期望的离子或基团。要求其带上使用时所期望的离子或基团。处理步骤：处理步骤：先用水浸泡至充分膨胀即可进行处理。先用水浸泡至充分膨胀即可进行处理。除细颗粒除细颗粒 酸碱浸泡酸碱浸泡 水洗涤水洗涤 碱或酸处理碱或酸处理 水洗涤水洗涤 缓冲液平衡缓冲液平衡 再生：再生：通过酸碱反复处理或借助转型处理完成。通过酸碱反复处理或借助转型处理完成。转型：转型：指离子交换剂由一种反离子转到另一种反指离子交换剂由一种反离子转到另一种反离子的过程，转型后的离子交换剂会按使用要离子的过程，转型后的离子交换剂会按使用要求带上一定种类的离子或基团。求带上一定种类的离子或基团。除杂质：除杂质：P84 P84 表表5-95-9第56页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss57 为为什什么么金金属属离离子子(Na(Na+、K K+等等)可可以以吸吸附附在在H-H-型型强强酸酸型型阳阳离离子子交交换换柱柱上上，而而后后又又可可以以用用HClHCl来再生强酸型阳离子交换柱来再生强酸型阳离子交换柱?亲和力大小不仅与离子性质有关，而且与其浓亲和力大小不仅与离子性质有关，而且与其浓度有关。前者根据一价金属离子的亲和力顺序度有关。前者根据一价金属离子的亲和力顺序不难理解，而后者是采用不难理解，而后者是采用高浓度高浓度HClHCl来再生强酸来再生强酸型阳离子交换柱。型阳离子交换柱。第57页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss58二、缓冲液的选择二、缓冲液的选择 离子交换剂吸附被分离物的量与缓冲液的离子交换剂吸附被分离物的量与缓冲液的pHpH值和值和离子浓度有密切关系。离子浓度有密切关系。起始缓冲液：起始缓冲液：pHpH值一般比有效成分的值一般比有效成分的pIpI值高一个单位值高一个单位或低一个单位，离子强度为或低一个单位，离子强度为0.10.1。洗脱液：洗脱液：离子强度和离子强度和pHpH值应使有效成分从离子交换值应使有效成分从离子交换剂上解离下来。一般离子强度要比起始缓冲液高，剂上解离下来。一般离子强度要比起始缓冲液高，pHpH值是随着离子交换剂性质变化而变化。值是随着离子交换剂性质变化而变化。第58页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss59三、交换三、交换n动态法动态法-柱层析法：交换效率高，应用广泛。适合于柱层析法：交换效率高，应用广泛。适合于制备、纯化及分析。适用于实验室、科研，教学以及模制备、纯化及分析。适用于实验室、科研，教学以及模型的建立；型的建立；n静态法静态法-可以大容器：盆、缸、桶、罐等操作。样品液与可以大容器：盆、缸、桶、罐等操作。样品液与交换剂进行混合、搅拌、吸附，滤去上清液，再解吸附，浓交换剂进行混合、搅拌、吸附，滤去上清液，再解吸附，浓缩。适合工厂，生产车间，产品的中试。其操作方便，设备缩。适合工厂，生产车间，产品的中试。其操作方便，设备简陋，快速定性等优势。简陋，快速定性等优势。第59页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss60四、程四、程 序序填装柱子填装柱子 柱子平衡柱子平衡 加入样品加入样品开始洗脱开始洗脱 分步收集分步收集 定性检测定性检测合并峰值合并峰值 浓缩样品浓缩样品 除去盐离子除去盐离子定量分析定量分析 计算回收率及纯化倍数计算回收率及纯化倍数 再生再生 第60页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss61离子交换剂层析装置（梯度洗脱配置）离子交换剂层析装置（梯度洗脱配置）第61页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss621.装柱与加样量装柱与加样量样品的准备样品的准备n样品应与起始缓冲液有相同的样品应与起始缓冲液有相同的pHpH和离子强度，和离子强度，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。n样品的不溶物应在透析后或凝胶过滤前以离心样品的不溶物应在透析后或凝胶过滤前以离心法除去。法除去。2.2.洗脱洗脱原则：原则：增加离子强度、改变增加离子强度、改变pHpH值值方式：方式：n梯度洗脱（梯度洗脱（Gradient elutionGradient elution）n阶段洗脱阶段洗脱(Stepwise elution)(Stepwise elution)第62页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss63 第63页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss64离子强度的线性梯度洗脱曲线离子强度的线性梯度洗脱曲线p86p86盐浓度盐浓度吸收曲线吸收曲线第64页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss65离子强度非线性梯度离子强度非线性梯度(阶梯式洗脱曲线阶梯式洗脱曲线)第65页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss66影响梯度洗脱速率变化的因素影响梯度洗脱速率变化的因素A A：当：当C CA A、C CB B 的浓度确定后，的浓度确定后，总体积总体积V V越小，梯度速率越小，梯度速率变化越快。变化越快。ABB B：当体积：当体积V V确定时，确定时，C CB BC CA A差值差值越大，梯度速率变化越快。越大，梯度速率变化越快。0.50.40.30.20.10.50.40.30.20.1Vt1 Vt2第66页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss67n比较线性梯度与阶梯式比较线性梯度与阶梯式梯度洗脱显示：梯度洗脱显示：n在样品组分、柱子规格、在样品组分、柱子规格、缓冲液成份、洗脱速度缓冲液成份、洗脱速度相似的条件时，其分辨相似的条件时，其分辨率有差异。但并未表现率有差异。但并未表现明显优势。明显优势。n依据实验经验，当分离依据实验经验，当分离物各组分差异较小时，物各组分差异较小时，选用线性梯度；差异选用线性梯度；差异较大则选用阶梯式梯较大则选用阶梯式梯度，以减小体积和节度，以减小体积和节省时间。省时间。第67页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss68A.C.A.C.相同条件的线性梯度相同条件的线性梯度A.A.流速流速8 8毫升毫升/小时，小时，C C为为 2020毫升毫升/小时；小时；B B与与A A的流速相同，离子梯度不同的流速相同，离子梯度不同结果：三者显示分辨率不同的结结果：三者显示分辨率不同的结果果线性梯度、洗脱速线性梯度、洗脱速度与分辨率度与分辨率第68页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss69梯度图的分析梯度图的分析 n当缓冲液的当缓冲液的pHpIpHpI（样品）时，（样品）时，样品带负电荷，结合到阴离子样品带负电荷，结合到阴离子交换剂，解吸附时，将交换剂，解吸附时，将pHpH下降，下降，越来越靠近越来越靠近pIpI，直至其，直至其pIpI、甚、甚至至pHpI,pHpI,样品电荷由样品电荷由 0 0 。样品解离。样品解离。A A为阴为阴离子交换剂。离子交换剂。pHpH从从10107.57.5，变化。变化。n当缓冲液的当缓冲液的pHpIpHpI（样品）时，（样品）时，样品带正电荷，结合到阳离子样品带正电荷，结合到阳离子交换剂，解吸附时，将交换剂，解吸附时，将pHpH上升，上升，越来越靠近越来越靠近pIpI，直至其，直至其pIpI、甚、甚至至pH pI,pH pI,样品电荷由样品电荷由 0 0 。样品解离。样品解离。B B为阳离为阳离子交换剂。子交换剂。pHpH从从4.54.58.98.9变化。变化。AB第69页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss70内容提要内容提要第一节第一节 基本原理基本原理第二节第二节 离子交换剂的分类与性质离子交换剂的分类与性质第三节第三节 操作操作第四节第四节 应用应用第70页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss71去离子水的制备去离子水的制备自来水自来水过滤过滤 R-SOR-SO3 3H H柱柱 RN(CHRN(CH3 3)3 3OHOH柱柱去离子水去离子水 混合柱混合柱 RN(CHRN(CH3 3)3 3OHOH柱柱1.1.水处理水处理第71页，讲稿共85张，创作于星期二14.10.2022海南大学农学院wss72 交交换换柱柱的的填填充充树树脂脂一一般般采采用用强强酸酸型型阳阳离离子子交交换换树树脂脂和和强强碱碱型阴离子交换树脂，如型阴离子交换树脂，如0017(7320017(732#)和和2017(7172017(717#)；由由于于交交换换容容量量不不同同，实实验验中中通通常常采采用用一一根根阳阳离离子子交交换换柱柱和二根
