细菌的基因重组.ppt

关于细菌的基因重组现在学习的是第1页，共70页凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组基因重组（gene recombination）或或遗传重组遗传重组（genetic recombination），），简称简称重组重组。现在学习的是第2页，共70页作用：作用：重重组组可使生物体在未可使生物体在未发发生突生突变变的情况下，也能的情况下，也能产产生新生新遗传遗传型的个体。型的个体。现在学习的是第3页，共70页重重组组与与杂杂交的关系：交的关系：重重组组是分子水平上的一个概念，可以理解成是是分子水平上的一个概念，可以理解成是遗传遗传物物质质分子水平分子水平上的上的杂杂交交而一般所而一般所说说的的杂杂交交（hybridization）则则是是细细胞水平胞水平上的一个概念。上的一个概念。杂杂交中必然包含着重交中必然包含着重组组，而重而重组则组则不限于不限于杂杂交交这这一形式。一形式。真核微生物中的有性真核微生物中的有性杂杂交、准性交、准性杂杂交（交（parasexual hybridization）等及原核生物中的）等及原核生物中的转转化、化、转导转导、接合和原、接合和原生生质质体融合等都是基因重体融合等都是基因重组组在在细细胞水平上的反映。胞水平上的反映。现在学习的是第4页，共70页微生物中各种形式基因重组的比较重组范围重组范围供体和受体的关系供体和受体的关系整套染色体整套染色体局部杂合局部杂合高频率高频率低频率低频率部分染色体部分染色体个别或少数基因个别或少数基因细胞融合或细胞融合或联结联结性细胞性细胞真菌的有真菌的有性生殖性生殖体细胞体细胞真菌的准真菌的准性生殖性生殖细胞间暂时沟通细胞间暂时沟通细菌的接合细菌的接合性导性导细胞间细胞间不接触不接触吸收游离吸收游离DNA片段片段转化转化噬菌体携带噬菌体携带DNA转导转导由噬菌体提由噬菌体提供遗传物质供遗传物质完整完整噬菌体噬菌体溶源转变溶源转变噬菌体噬菌体DNA转染转染现在学习的是第5页，共70页基因重组的意义基因重组是杂交育种的理论基础。基因重组是杂交育种的理论基础。杂交育种的优点：杂交育种的优点：由于杂交育种选用了已知性状的供体菌和受体菌作为亲本，由于杂交育种选用了已知性状的供体菌和受体菌作为亲本，因此，不论在方向性还是自觉性方面，均比诱变育种前进了一因此，不论在方向性还是自觉性方面，均比诱变育种前进了一大步。大步。利用杂交育种往往还可以消除某一菌株在经过长期诱变处理后利用杂交育种往往还可以消除某一菌株在经过长期诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象，因此，它是一种重要的育种手段。所出现的产量上升缓慢的现象，因此，它是一种重要的育种手段。现在学习的是第6页，共70页基因重组的意义杂交育种的缺点：杂交育种的缺点：由于杂交育种的方法较复杂，工作进展较慢，还很难像诱变育由于杂交育种的方法较复杂，工作进展较慢，还很难像诱变育种技术那样得到普遍的推广和使用，尤其在原核生物的领域中，种技术那样得到普遍的推广和使用，尤其在原核生物的领域中，应用转化、转导或接合等重组技术来培育可应用于生产实践上应用转化、转导或接合等重组技术来培育可应用于生产实践上的高产菌株的例子还不多见。到了的高产菌株的例子还不多见。到了70年代后期，由于原生质体融年代后期，由于原生质体融合技术获得巨大的成功后，才使重组育种技术获得了飞速的发展。合技术获得巨大的成功后，才使重组育种技术获得了飞速的发展。现在学习的是第7页，共70页原核生物的基因重组原核生物的基因重组原核生物的基因重组形式很多，机制较原始。原核生物的基因重组形式很多，机制较原始。特点：特点：片段性，仅一小段片段性，仅一小段DNADNA序列参与重组；序列参与重组；单向性，即从供体菌向受体菌（或从供体基因组向单向性，即从供体菌向受体菌（或从供体基因组向受体基因组）作单方向转移；受体基因组）作单方向转移；转移机制独特而多样，如接合、转化和转导等。转移机制独特而多样，如接合、转化和转导等。现在学习的是第8页，共70页（一）接合（一）接合（conjugation，mating）供体菌供体菌（“雄性雄性”）通过通过性毛性毛与与受体菌受体菌（“雌性雌性”）直接接）直接接触，把触，把F F质粒质粒或其携带的不同长度的或其携带的不同长度的核基因组片段核基因组片段传递给后者，使传递给后者，使后者获得若干新遗传性状的现象，称为后者获得若干新遗传性状的现象，称为接合接合。通过接合而获得。通过接合而获得新遗传性状的受体细胞，就是新遗传性状的受体细胞，就是接合子接合子（conjugant）。）。现在学习的是第9页，共70页1946年，年，Joshua Lederberg 和和Edward L.Taturm细菌的多重营养缺陷型杂交实验细菌的多重营养缺陷型杂交实验通过细胞与细胞的直接接通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转触而产生的遗传信息的转移和重组过程移和重组过程现在学习的是第10页，共70页现在学习的是第11页，共70页中间平板上长出的原中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和间发生了遗传交换和重组所致！重组所致！现在学习的是第12页，共70页AB-过滤器U U型管实验型管实验现在学习的是第13页，共70页存在范围：存在范围：细菌：细菌：G 较为多见如较为多见如E.coli(大肠杆菌大肠杆菌)、Salmonella(沙门氏菌)、Shigella(志贺氏菌)、Serratia(粘质沙雷菌)、Vibrio(弧菌属)、Azotobacter(固氮菌)、Klebsiella(克雷白氏杆菌属)和和Pseudomonas(假单胞菌属)等最为常见等最为常见放线菌：放线菌：Streptomyces(链霉菌属)、Nocardia(诺卡氏菌属)接合还可发生在接合还可发生在不同属不同属的菌种之间，如的菌种之间，如E.coli与与Salmonella typhimurium之间或之间或S.typhimurium与与Shigella dysenteriae之间之间现在学习的是第14页，共70页大肠杆菌的接合机制大肠杆菌的接合机制接合作用是由一种被称为接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导因子的质粒介导F因子的分子量通常为因子的分子量通常为5107，上面有编码细菌产生性毛（，上面有编码细菌产生性毛（sex pili）及控制接合过程进行的及控制接合过程进行的20多个基因。多个基因。含有含有F因子的细胞：因子的细胞：“雄性雄性”菌株（菌株（F+），），其细胞表面有性毛其细胞表面有性毛不含不含F因子的细胞：因子的细胞：“雌性雌性”菌株（菌株（F-），），细胞表面没有性毛细胞表面没有性毛现在学习的是第15页，共70页F因子为附加体质粒因子为附加体质粒可脱离染色体在细胞内独立存在，可插入（整合）到染色体上可脱离染色体在细胞内独立存在，可插入（整合）到染色体上现在学习的是第16页，共70页F F因子的四种细胞形式因子的四种细胞形式a）F F-菌株菌株，不含不含F因子，没有性毛，但可以通过接合作用接因子，没有性毛，但可以通过接合作用接收收F因子而变成雄性菌株（因子而变成雄性菌株（F+）；）；b）F F+菌株菌株，F因子独立存在，细胞表面有性毛。因子独立存在，细胞表面有性毛。c）HfrHfr菌株菌株，F F因子插入到染色体因子插入到染色体DNADNA上上，细胞表面有性毛。，细胞表面有性毛。d）FF菌株菌株，Hfr菌株内的菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为因子，特称为F因子。因子。细胞细胞表面同样有性毛。表面同样有性毛。现在学习的是第17页，共70页现在学习的是第18页，共70页现在学习的是第19页，共70页接合的一般过程接合的一般过程接合时接合时F+细胞与细胞与F 细胞相遇，性菌毛与细胞相遇，性菌毛与F 细胞表面发生吸附而形成接合细胞表面发生吸附而形成接合管；管；F+细胞内，细胞内，F因子的一条因子的一条DNA单链在特定的位点上发生断裂；单链在特定的位点上发生断裂；断裂后的单链逐步解开，同时以另一条留存的环状单链做模板，通断裂后的单链逐步解开，同时以另一条留存的环状单链做模板，通过模板的滚动，一方面把解开的单链以过模板的滚动，一方面把解开的单链以5为先导通过性菌毛推入为先导通过性菌毛推入F 细胞中，另一方面，在供体细胞内以滚动的环状模板重新合成一细胞中，另一方面，在供体细胞内以滚动的环状模板重新合成一条互补的环状单链，以取代传递到条互补的环状单链，以取代传递到F 细胞中的那条单链。这种细胞中的那条单链。这种DNA复制机制称为滚环模型（复制机制称为滚环模型（rolling circle model）；）；在在F 细胞中，以外来的供体细胞中，以外来的供体DNA线状单链为模板合成一条互补单链，线状单链为模板合成一条互补单链，并随之恢复成环状双链并随之恢复成环状双链F因子。因子。至此，原来的至此，原来的F 菌株变成了菌株变成了F+菌株。原来的供体仍为菌株。原来的供体仍为F+菌株。菌株。现在学习的是第20页，共70页（二）转导（二）转导（transduction）通过通过病毒病毒（defective phage）的媒介，把供体细胞的小片的媒介，把供体细胞的小片段段DNADNA携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为部分遗传性状的现象，称为转导转导。获得新遗传性状的受体细胞，。获得新遗传性状的受体细胞，就称就称转导子转导子（transductant）。）。现在学习的是第21页，共70页由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式：由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式：一个细胞的一个细胞的DNADNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中 能将一个细菌宿主的部分染色体或质粒能将一个细菌宿主的部分染色体或质粒DNA带带到另一个细菌的噬菌体称为到另一个细菌的噬菌体称为转导噬菌体转导噬菌体。现在学习的是第22页，共70页细菌转导的二种类型：细菌转导的二种类型：普遍性转导普遍性转导局限性转导局限性转导流产普遍转导流产普遍转导完全普遍转导完全普遍转导现在学习的是第23页，共70页1.1.普遍转导普遍转导（generalized transduction）通过极少数通过极少数完全缺陷噬菌体完全缺陷噬菌体对对供体菌供体菌任何小片段任何小片段DNADNA进行进行“误包误包”，而将其遗传性状传递给，而将其遗传性状传递给受体菌受体菌的现象，的现象，称为称为普遍转导普遍转导。一般用温和噬菌体作为普遍转导的媒介。一般用温和噬菌体作为普遍转导的媒介。现在学习的是第24页，共70页（1 1）完全普遍转导完全普遍转导 简称简称普遍转导普遍转导或或完全转导完全转导（complete transduction）。经转导噬菌体的媒介而获得了供体菌经转导噬菌体的媒介而获得了供体菌DNADNA片段的受体菌，片段的受体菌，外源外源DNADNA在其内进行在其内进行交换、整合和复制交换、整合和复制，使其成为一个遗传，使其成为一个遗传性状稳定的重组体，称作性状稳定的重组体，称作普遍转导子普遍转导子，这种现象就称普遍转导。，这种现象就称普遍转导。现在学习的是第25页，共70页Salmonella typhimurium（鼠伤寒沙门氏菌）鼠伤寒沙门氏菌）的野生菌株的野生菌株Salmonella typhimurium（鼠伤寒沙门氏菌）鼠伤寒沙门氏菌）的营养缺陷型突变株的营养缺陷型突变株P22P22嗜菌体嗜菌体供体菌供体菌受体菌受体菌现在学习的是第26页，共70页转导模型供体菌供体菌受体菌受体菌转导媒介转导媒介噬菌体噬菌体误包误包转导颗粒转导颗粒普遍转导子普遍转导子双双交交换换同源配对同源配对1010-6-61010-8-8现在学习的是第27页，共70页现在学习的是第28页，共70页过程：过程：（1）P22在供体菌内增殖时，宿主的核染色体组断裂，待噬菌体在供体菌内增殖时，宿主的核染色体组断裂，待噬菌体成熟与包装之际，极少数（成熟与包装之际，极少数（10 6 10 8）噬菌体的衣壳将与噬菌）噬菌体的衣壳将与噬菌体头部核心大小相似的一段供体体头部核心大小相似的一段供体DNA片段误包入其中，形成了一个完片段误包入其中，形成了一个完全不含噬菌体自身全不含噬菌体自身DNA的缺陷噬菌体。的缺陷噬菌体。（2）供体菌裂解时，如把少量裂解物与大量受体菌群体相混，这种完）供体菌裂解时，如把少量裂解物与大量受体菌群体相混，这种完全缺陷噬菌体就会将这一外源全缺陷噬菌体就会将这一外源DNA片段导入受体细胞内。片段导入受体细胞内。（3）在这种情况下，由于一个受体细胞只感染了一个完全缺陷噬菌体，）在这种情况下，由于一个受体细胞只感染了一个完全缺陷噬菌体，故受体细胞不会发生往常的溶原化，也不显示其免疫性，更不会裂解和故受体细胞不会发生往常的溶原化，也不显示其免疫性，更不会裂解和产生正常的噬菌体；而由于导入的外源产生正常的噬菌体；而由于导入的外源DNA片段可与受体细胞核染片段可与受体细胞核染色体组上的同源区段配对，在通过双交换而整合到受体菌染色体色体组上的同源区段配对，在通过双交换而整合到受体菌染色体组中，所以使后者成为一个遗传性状稳定的转导子。组中，所以使后者成为一个遗传性状稳定的转导子。现在学习的是第29页，共70页S.typhimurium的的P22P22噬菌体噬菌体、E.coli的的P1P1噬菌体噬菌体、Bacillus subtilis的的PBS1PBS1和和SP10SP10等噬菌体等噬菌体都能进行都能进行完全普遍转导完全普遍转导。供体菌供体菌转导媒介转导媒介噬菌体噬菌体受体菌受体菌现在学习的是第30页，共70页（2 2）流产普遍转导流产普遍转导 简称简称流产转导流产转导（abortive transduction）。经转导噬。经转导噬菌体的媒介而获得了供体菌菌体的媒介而获得了供体菌DNADNA片段的受体菌，外源片段的受体菌，外源DNADNA在在其内既其内既不进行交换、整合和复制不进行交换、整合和复制，也不迅速消失，而仅进，也不迅速消失，而仅进行转录、转译和性状表达，这种现象就称流产转导。行转录、转译和性状表达，这种现象就称流产转导。现在学习的是第31页，共70页受体菌受体菌外源外源DNADNA细胞分裂细胞分裂外源基因经转录、转译而形成的外源基因经转录、转译而形成的少量酶少量酶获得外源获得外源DNADNA获得少量酶获得少量酶不不断断稀稀释释现在学习的是第32页，共70页特点：在选择培养基平板上形成微小菌落特点：在选择培养基平板上形成微小菌落DNA不能复制，因此群体中仅一个细胞含有不能复制，因此群体中仅一个细胞含有DNA，而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。现在学习的是第33页，共70页普遍性转导的三种后果：普遍性转导的三种后果：进入受体的外源进入受体的外源DNA通过与通过与细胞染色体的重组交换而形细胞染色体的重组交换而形成稳定的成稳定的转导子转导子。流产转导流产转导（abortive transduction）转导转导DNA不能进行重组和复制，但其不能进行重组和复制，但其携带的基因可经过转录而得到表达。携带的基因可经过转录而得到表达。特点：在选择培养基平板上形成微小菌落特点：在选择培养基平板上形成微小菌落外源外源DNA被降解，转导失败。被降解，转导失败。DNA不能复制，因此群体中仅一个细胞含有不能复制，因此群体中仅一个细胞含有DNA，而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。现在学习的是第34页，共70页2.2.局限转导局限转导（specialized transduction，restricted transduction）指通过指通过部分缺陷的温和噬菌体部分缺陷的温和噬菌体把把供体菌供体菌的少数的少数特定特定基因基因携带到携带到受体菌受体菌中，并与后者的基因组整合、重组，中，并与后者的基因组整合、重组，形成转导子的现象。形成转导子的现象。最初于最初于19541954年在年在E.coliK12中发现。中发现。现在学习的是第35页，共70页特点：特点：只只局限于传递供体菌核染色体上的局限于传递供体菌核染色体上的个别特定基因个别特定基因，一般为一般为噬菌体整合位点两侧的基因；噬菌体整合位点两侧的基因；该特定基因由该特定基因由部分缺陷的温和噬菌体部分缺陷的温和噬菌体携带；携带；缺陷噬菌体的形成方式是由于它在脱离宿主染色体过程缺陷噬菌体的形成方式是由于它在脱离宿主染色体过程中，发生低频率（中，发生低频率（1010-5-5）“误切误切”（不正常切离，（不正常切离，abnormal excesion）或由于双重溶源菌的或由于双重溶源菌的裂解裂解而形成；而形成；局局限转导噬菌体的产生要通过限转导噬菌体的产生要通过UVUV等因素对溶源菌的等因素对溶源菌的诱导诱导并引起并引起裂解后才产生。裂解后才产生。现在学习的是第36页，共70页局局限限转转导导低频转导低频转导高频转导高频转导根据转导子出现频率的高低分类根据转导子出现频率的高低分类现在学习的是第37页，共70页温和噬菌体感染温和噬菌体感染整合到细菌染色体的特定位点上整合到细菌染色体的特定位点上宿主细胞发生溶源化宿主细胞发生溶源化溶源菌因诱导而发生裂解时，在前噬溶源菌因诱导而发生裂解时，在前噬菌体二侧的少数宿主基因因偶尔发生菌体二侧的少数宿主基因因偶尔发生的不正常切割而连在噬菌体的不正常切割而连在噬菌体DNA上上部分缺陷的温和噬菌体部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中现在学习的是第38页，共70页缺陷噬菌体在宿主细胞内能够象正常的缺陷噬菌体在宿主细胞内能够象正常的DNADNA分子一样进行复制、分子一样进行复制、包装，提供所需要的裂解功能，形成包装，提供所需要的裂解功能，形成转导颗粒转导颗粒。但没有正常噬菌体的但没有正常噬菌体的溶源性和增殖能力溶源性和增殖能力，感染受体细胞后，感染受体细胞后，通过通过DNADNA整合进宿主染色体而形成稳定的整合进宿主染色体而形成稳定的转导子转导子。E.coli的的嗜菌体嗜菌体和和8080嗜菌体嗜菌体具有局限转导的能力。具有局限转导的能力。现在学习的是第39页，共70页比较项目比较项目普遍性转导普遍性转导局限性转导局限性转导转导的基因转导的基因供体染色体或染色供体染色体或染色体外的任何基因体外的任何基因供体染色体上与原噬菌体紧供体染色体上与原噬菌体紧密连锁的少数几个个别基因密连锁的少数几个个别基因噬菌体寄生噬菌体寄生的位置的位置不结合在寄主染色不结合在寄主染色体特定位置上体特定位置上结合在寄主染色体特定位置结合在寄主染色体特定位置上上获得转导噬获得转导噬菌体的方法菌体的方法通过敏感菌的裂解通过敏感菌的裂解或容源菌的诱导或容源菌的诱导紫外线诱导容源菌紫外线诱导容源菌转导子的区转导子的区别别一般稳定，非溶原一般稳定，非溶原性（不表现出任何性（不表现出任何噬菌体的性状，包噬菌体的性状，包括免疫性）括免疫性）一般不稳定，呈缺陷溶原性一般不稳定，呈缺陷溶原性（对同源噬菌体具有免疫性，（对同源噬菌体具有免疫性，但不表现出其它噬菌体的性但不表现出其它噬菌体的性状）状）普遍性转导和局限性转导的比较普遍性转导和局限性转导的比较现在学习的是第40页，共70页受体菌受体菌（recipient cell，receptor）直接吸收直接吸收供体菌供体菌（donor cell）的的DNA片段而获得后者部分遗传性状的现片段而获得后者部分遗传性状的现象，称为转化或转化作用。象，称为转化或转化作用。通过转化方式而形成的杂种后代，称通过转化方式而形成的杂种后代，称转化子转化子（transformant）。（三）转化（三）转化（transformation）1.1.定义定义现在学习的是第41页，共70页原核生物原核生物Streptococcus pneumoniae（肺炎链球菌）、肺炎链球菌）、Haemophilus（嗜血杆菌属）、嗜血杆菌属）、Bacillus（芽孢杆菌属）、芽孢杆菌属）、Neisseria（奈瑟氏球菌属）、奈瑟氏球菌属）、Rhizobium（根瘤菌属）、根瘤菌属）、Staphylococcus（葡萄球菌属）、葡萄球菌属）、Pseudomonas（假单胞菌属）、假单胞菌属）、Xanthomonas（黄单胞菌属）等。黄单胞菌属）等。2.2.转化微生物的种类转化微生物的种类现在学习的是第42页，共70页真核微生物真核微生物Saccharomy cescerevisiae（酿酒酵母）、酿酒酵母）、Neu-rosporacrassa（粗糙脉孢菌）、粗糙脉孢菌）、Aspergillusniger（黑曲霉）等。黑曲霉）等。现在学习的是第43页，共70页 受体受体细胞要胞要处于感受于感受态.感受感受态：competence，受体，受体细胞能从胞能从环境吸取外源境吸取外源DNA片片段并段并实现其其转化的一种生理状化的一种生理状态供体供体DNA片段片段（转化因子）化因子）大小适宜，分子量一般大小适宜，分子量一般为1 107 D 左右左右 菌株菌株间的的亲缘关系密切关系密切3 3、转化发生的条件、转化发生的条件现在学习的是第44页，共70页感受态感受态（competence）感受态感受态是指受体细胞最易接受外源是指受体细胞最易接受外源DNADNA片段并能实片段并能实现转化的一种生理状态。现转化的一种生理状态。研究发现，能发生转化的受体细胞都处于感受态。研究发现，能发生转化的受体细胞都处于感受态。感受态细胞感受态细胞（competent cell）具有摄取外源具有摄取外源DNADNA能能力的细胞。力的细胞。现在学习的是第45页，共70页自然感受态自然感受态是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌自身的基因控制；是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌自身的基因控制；人工感受态人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNADNA的能力，或的能力，或人为地将人为地将DNADNA导入细胞内。导入细胞内。（该过程与细菌自身的遗传控制无关！）（该过程与细菌自身的遗传控制无关！）现在学习的是第46页，共70页 感受态感受态感受态受遗传控制，但也存在个体差异。感受态受遗传控制，但也存在个体差异。感受态出现的时间不同；感受态出现的时间不同；出现时间：只在细菌生长的某一时期出现；不同菌种的感受态出现时间：只在细菌生长的某一时期出现；不同菌种的感受态出现在不同生长时期出现在不同生长时期Streptococcus pneumoniae（肺炎链球菌）的感受态出现在（肺炎链球菌）的感受态出现在生长曲线中的指数期的中期，生长曲线中的指数期的中期，Bacillus（芽胞杆菌属）的一些种则往往出现在指数期末及稳定）的一些种则往往出现在指数期末及稳定期的初期。期的初期。现在学习的是第47页，共70页 感受态感受态感受态细胞的比例：当处于感受态高峰时，群体中呈感受态的细胞感受态细胞的比例：当处于感受态高峰时，群体中呈感受态的细胞因菌种而不同因菌种而不同.Bacillus subtilis不超过不超过1015%Streptococcus pneumonia和和Haemophilus influenzae（流感嗜血杆（流感嗜血杆菌）达到菌）达到100%感受态由细胞的遗传性决定，但同时也受环境因子的影响：感受态由细胞的遗传性决定，但同时也受环境因子的影响：cAMP、Ca2+等最明显。如用等最明显。如用CaCl2 处理处理E.coli可以诱发其产生感受态。可以诱发其产生感受态。转化转化DNA的最低浓度：在群体中含有的最低浓度：在群体中含有15%感受态细胞时，感受态细胞时，0.1 gDNA/ml细胞悬液即可有效发生转化细胞悬液即可有效发生转化现在学习的是第48页，共70页调节感受态的一类特异蛋白称调节感受态的一类特异蛋白称感受态因子感受态因子。膜相关膜相关DNADNA结合蛋白结合蛋白（membrane-associated DNA binding protein）细胞壁细胞壁自溶素自溶素（autolysin）几个核酸酶几个核酸酶现在学习的是第49页，共70页转化因子转化因子（transforming principle）转化因子转化因子的本质是离体的的本质是离体的DNADNA片段。一般只有片段。一般只有1515kbkb左右。左右。在不同的微生物中，转化因子的形式不同。在不同的微生物中，转化因子的形式不同。良好的转化因子有良好的转化因子有dsDNAdsDNA（最宜于细胞表面结合）、最宜于细胞表面结合）、ssDNAssDNA和和质质粒粒DNADNA，通常不能与核染色体组发生重组。通常不能与核染色体组发生重组。现在学习的是第50页，共70页转化的频率通常为转化的频率通常为0.10.11.01.0，最高为，最高为2020。能发生。能发生转化的最低转化的最低DNADNA浓度极低，为化学方法无法测出的浓度极低，为化学方法无法测出的1101105 5 gmL（即即1101101111gmL）。）。现在学习的是第51页，共70页自然遗传转化自然遗传转化（natural genetic transformation）人工转化人工转化（artificial transformation）4 4、转化的类型、转化的类型根据感受态建立的方式，可以分为：现在学习的是第52页，共70页5.5.转化过程转化过程（1）自然遗传转化（简称自然转化）自然遗传转化（简称自然转化）1928年，年，Griffith发现肺炎链球菌（发现肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的转化现象，的转化现象，转化过程研究得较深入的就是这种转化过程研究得较深入的就是这种G G细菌。细菌。现在学习的是第53页，共70页目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力进行自然转化，需要二方面必要的条件：进行自然转化，需要二方面必要的条件：建立了感受态的受体细胞建立了感受态的受体细胞外源游离外源游离DNA分子分子现在学习的是第54页，共70页转化的过程 以以S.Pneumonia strr（肺炎链球菌抗链霉素菌株）为例，大致可分（肺炎链球菌抗链霉素菌株）为例，大致可分为六阶段：为六阶段：吸附：吸附：双链双链DNA片段与细胞表面的特定位点（主要在新形成细胞壁的片段与细胞表面的特定位点（主要在新形成细胞壁的赤道区）结合，此时，细胞膜上的胆碱可促进这一过程。在吸附过赤道区）结合，此时，细胞膜上的胆碱可促进这一过程。在吸附过程的前阶段，如外界加入程的前阶段，如外界加入DNA酶，就会减少转化子的产生。稍后，酶，就会减少转化子的产生。稍后，DNA酶即无影响，说明此时该转化因子已进入细胞；酶即无影响，说明此时该转化因子已进入细胞；切割：切割：在吸附位点上的在吸附位点上的DNA被核酸内切酶分解，形成平均分子量为被核酸内切酶分解，形成平均分子量为45106的的DNA片段；片段；入胞入胞：DNA双链中的一条单链被膜上的另一种核酸酶切除，另一条单双链中的一条单链被膜上的另一种核酸酶切除，另一条单链逐步进入细胞，这是一个耗能的过程。分子量小于链逐步进入细胞，这是一个耗能的过程。分子量小于5105的的DNA片段片段不能进入细胞。这时如用低浓度溶菌酶处理，因它提高了细胞壁的不能进入细胞。这时如用低浓度溶菌酶处理，因它提高了细胞壁的通透性，故可提高转化频率；通透性，故可提高转化频率；现在学习的是第55页，共70页转化的过程重组：重组：来自供体菌的单链来自供体菌的单链DNA片段在细胞内与受体细胞核染色体片段在细胞内与受体细胞核染色体组上的同源区配对，接着受体染色体组上的相应单链片段被切除，组上的同源区配对，接着受体染色体组上的相应单链片段被切除，并被外来的单链并被外来的单链DNA交换、整合和取代，于是形成了一个杂合交换、整合和取代，于是形成了一个杂合DNA区段（区段（heterozygous region）。在这一过程中，有核酸酶、）。在这一过程中，有核酸酶、DNA聚聚合酶和合酶和DNA连接酶的参与；连接酶的参与；复制：复制：受体菌的染色体组进行复制，杂合区段分离成两个，其中之一获得受体菌的染色体组进行复制，杂合区段分离成两个，其中之一获得了供体菌的转化基因，另一个未获供体基因；了供体菌的转化基因，另一个未获供体基因；转化子形成：转化子形成：当细胞发生分裂后，一个子细胞含供体基因，这就是转当细胞发生分裂后，一个子细胞含供体基因，这就是转化子；另一个细胞与原始受体菌一样。化子；另一个细胞与原始受体菌一样。现在学习的是第56页，共70页枯草芽孢杆菌的自然转化过程（革兰氏阳性菌的转化模型）枯草芽孢杆菌的自然转化过程（革兰氏阳性菌的转化模型）现在学习的是第57页，共70页strR，存在抗链霉素的基因标记存在抗链霉素的基因标记strS，有链霉素敏感型基因标记有链霉素敏感型基因标记现在学习的是第58页，共70页自然转化过程的特点：自然转化过程的特点：a）对核酸酶敏感；对核酸酶敏感；c）转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化（DNA）供体菌和受体菌之间的亲源关系；供体菌和受体菌之间的亲源关系；d）通常情况下质粒的自然转化效率要低得多；通常情况下质粒的自然转化效率要低得多；b）不需要活的不需要活的DNA给体细胞；给体细胞；现在学习的是第59页，共70页提高质粒的自然转化效率的二种方法：提高质粒的自然转化效率的二种方法：1）使质粒形成多聚体，这样进入细胞后重新组合成有）使质粒形成多聚体，这样进入细胞后重新组合成有 活性的质粒的几率大大提高；活性的质粒的几率大大提高；2）在质粒上插入受体菌染色体的部分片段，或将质粒转化进含）在质粒上插入受体菌染色体的部分片段，或将质粒转化进含有与该质粒具有同源区段的质粒的受体菌有与该质粒具有同源区段的质粒的受体菌重组获救重组获救。现在学习的是第60页，共70页（2）人工转化）人工转化用用CaCl2处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。手段，是基因工程的奠基石和基础技术。不是由细菌自身的基因所控制；不是由细菌自身的基因所控制；用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源种可以摄取外源DNA的的“人工感受态人工感受态”。质粒的转化效率高；质粒的转化效率高；现在学习的是第61页，共70页可可转化的形状化的形状荚膜多糖的合成膜多糖的合成专一性一性酶的合成的合成专一性蛋白一性蛋白质的合成的合成抗抗药性性现在学习的是第62页，共70页（四（四）原生质体融合原生质体融合（protoplast fusion）通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定的重组子体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定的重组子的过程，称为的过程，称为原生质体融合原生质体融合。由此法获得的重组子，由此法获得的重组子，成为成为融合子融合子（fusant）。）。现在学习的是第63页，共70页适用范围：适用范围：各种生物细胞都能进行原生质体融合，包括各种原核各种生物细胞都能进行原生质体融合，包括各种原核生物、真核微生物以及高等动植物和人体的不同细胞。生物、真核微生物以及高等动植物和人体的不同细胞。意义：意义：70年代后发展的一种育种新技术，继转化、转导和接合之年代后发展的一种育种新技术，继转化、转导和接合之后一种更有效的转移遗传物质的手段。原生质体融合不仅能在不后一种更有效的转移遗传物质的手段。原生质体融合不仅能在不同菌株或种间进行，还能做到属间、科间甚至更远缘的微生物或同菌株或种间进行，还能做到属间、科间甚至更远缘的微生物或高等生物细胞间的融合。高等生物细胞间的融合。发展点：发展点：有关原生质体融合的遗传机制，尚未研究清楚，目前还在探有关原生质体融合的遗传机制，尚未研究清楚，目前还在探索中。索中。现在学习的是第64页，共70页选择两个有特殊价值的并带有选择性遗传标记的细胞作为亲本选择两个有特殊价值的并带有选择性遗传标记的细胞作为亲本脱壁酶脱壁酶细菌或放线菌可用细菌或放线菌可用溶菌酶溶菌酶或或青霉素青霉素处理，处理，真菌可用真菌可用蜗牛酶蜗牛酶或其他相应的或其他相应的脱壁酶脱壁酶等等离心聚集离心聚集在高渗溶液中稀释在高渗溶液中稀释加入促融合剂或电脉冲加入促融合剂或电脉冲各种选择性培养基各种选择性培养基原生质体融合的主要步骤是：原生质体融合的主要步骤是：选择亲株选择亲株 制备原生质体制备原生质体原生质体融合原生质体融合 原生质体原生质体 再生再生 筛选优良性状的融合重组筛选优良性状的融合重组子子现在学习的是第65页，共70页原生质体融合的重组频率已大于原生质体融合的重组频率已大于1010-1-1（而诱变育种一般仅（而诱变育种一般仅为为1010-6-6）；）；同种的不同同种的不同菌株间菌株间或或种间种间进行融合，进行融合，属间、科间属间、科间甚至更远缘的微生物或高等生物细胞间的融合，甚至更远缘的微生物或高等生物细胞间的融合，以期达到生产性状更为优良的新物种以期达到生产性状更为优良的新物种。现在学习的是第66页，共70页l原生质体融合的优点：原生质体融合的优点：可以提高重组率可以提高重组率 双亲可以少带标记或不带标记双亲可以少带标记或不带标记 可进行多亲本融合可进行多亲本融合 有利于不同种间、属间微生物的杂交有利于不同种间、属间微生物的杂交 通过原生质体融合提高产量通过原生质体融合提高产量 现在学习的是第67页，共70页二、真核微生物的基因重组二、真核微生物的基因重组有性杂交有性杂交准性杂交准性杂交原生质体融合原生质体融合遗传转化遗传转化现在学习的是第68页，共70页（一）有性杂交（一）有性杂交（sexual hybridization）杂交杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重组方式。是在细胞水平上发生的一种遗传重组方式。有有性杂交性杂交，一般指不同遗传型的两性细胞间发生的接合和随之，一般指不同遗传型的两性细胞间发生的接合和随之进行的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种育种技术。进行的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种育种技术。现在学习的是第69页，共70页感感谢谢大大家家观观看看现在学习的是第70页，共70页