细胞培养的基本原理与技术.ppt

关于细胞培养的基本原理与关于细胞培养的基本原理与技术技术现在学习的是第1页，共46页第一章第一章 细胞培养的基本原理与技术细胞培养的基本原理与技术 n n体外培养的概念 n n细胞培养的一般过程 n n细胞培养的无菌环境 n n常用培养器皿及清洗消毒现在学习的是第2页，共46页细胞培养意义细胞培养意义现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培值。比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培值。比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培值。比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。基因工程乙肝疫苗很多是以养来实现的。基因工程乙肝疫苗很多是以养来实现的。基因工程乙肝疫苗很多是以养来实现的。基因工程乙肝疫苗很多是以CHOCHO细胞作为载体；细胞细胞作为载体；细胞细胞作为载体；细胞细胞作为载体；细胞工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。养。养。养。现在学习的是第3页，共46页第一节第一节 体外培养的概念体外培养的概念 n n 一、基本概念 体外培养（in vitro culture），就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。现在学习的是第4页，共46页n n组织培养：是指从生物体内取出活的组织（多指组织块）组织培养：是指从生物体内取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法。在体外进行培养的方法。n n细胞培养：是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外细胞培养：是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。进行培养的方法。n n 器官培养：是指从生物体内取出的器官（一般是胚胎器器官培养：是指从生物体内取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。n n现在学习的是第5页，共46页胎肾的培养植物组织的培养培养的hela细胞现在学习的是第6页，共46页人类胚胎干细胞培育出立体视网膜组织培养中的上皮细胞 现在学习的是第7页，共46页n n二、体内、外细胞的差异和分化n n1.差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中，易发生如下变化：n n分化现象减弱n n形态功能趋于单一化n n发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系现在学习的是第8页，共46页细胞在体内组织条件的状态体外培养的细胞现在学习的是第9页，共46页n n2.2.分化：分化：n n体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的改变，细胞分化的表现和在体内不同境的改变，细胞分化的表现和在体内不同n n细胞是否表现分化细胞是否表现分化,关键在于是否存在使细胞分化关键在于是否存在使细胞分化的条件的条件n nFriendFriend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，作用下可以合成血红蛋白，n n血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构血管状结构现在学习的是第10页，共46页现在学习的是第11页，共46页第二节第二节 细胞培养的一般过程细胞培养的一般过程 n n准备工作 n n取材 n n培养 n n冻存及复苏 n n常用仪器设备 现在学习的是第12页，共46页n n一、准备工作n n n n准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试。现在学习的是第13页，共46页n n二、取材 n n在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中。分离等）后接入培养器血中。n n如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。出的组织细胞的首次培养称为原代培养。现在学习的是第14页，共46页现在学习的是第15页，共46页n n各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。现在学习的是第16页，共46页n n三、培养三、培养 n n将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中n n组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。n n细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。现在学习的是第17页，共46页n n培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。n n现在学习的是第18页，共46页n n细胞状态现在学习的是第19页，共46页n n原代培养一般有一段原代培养一般有一段潜伏期潜伏期（数小时到数十天不（数小时到数十天不等）等）n n在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。n n过了潜伏期后细胞进入过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期旺盛的分裂生长期。细胞长。细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一一代代”现在学习的是第20页，共46页现在学习的是第21页，共46页n n四、冻存及复苏四、冻存及复苏n n为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度的温度196196，n n方法：将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中现在学习的是第22页，共46页现在学习的是第23页，共46页n n五、常用仪器设备 n n无菌室,超净工作台,三重纯水蒸馏器,抽气泵,压力蒸气消毒器,电热恒温培养箱,培养器具，CO2培养箱,恒温水浴锅,倒置显微镜,离心机,无菌过滤器,洗刷装置,细胞计数板等等。现在学习的是第24页，共46页现在学习的是第25页，共46页第三节第三节 细胞培养的无菌环境细胞培养的无菌环境n n无菌室 n n 超净工作台 现在学习的是第26页，共46页n n无菌室n n无菌室的结构：一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。无菌室的消毒和防污染：为保持无菌状态，经常消毒是必要的，通常采用，每天用紫外照射，每周甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸和每月新洁尔灭擦拭地面现在学习的是第27页，共46页现在学习的是第28页，共46页表：我国无菌室的级别 空空气气洁洁净净度级别度级别0.5m0.5m的的微微粒粒数数个个/m/m3 35m5m的的微微粒粒数数个个/m/m3 3沉沉降降菌菌（90mm90mm皿皿，沉沉 降降0.5h0.5h）菌落）菌落/皿皿浮浮 游游菌菌个个/m m3 31001001 1万万1010万万35003500350000350000350000035000000 020002000200002000011331010551001005005003030万级万级105000010500000 060000600001515返回现在学习的是第29页，共46页n n二、超净工作台 超净台的使用与保养：超净台的平均风速保持在0.32-0.48米/秒为宜，过大、过小均不利于保持净化度；n n使用前最好开启超净台内紫外灯照射1030分钟n n使用完毕后要用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净，以保证超净台无菌。还要定期用福尔马林熏蒸超净台。现在学习的是第30页，共46页n n风向：水平和垂直风向：水平和垂直现在学习的是第31页，共46页n n生物安全柜现在学习的是第32页，共46页第四节第四节 常用培养器皿及清洗消毒常用培养器皿及清洗消毒 n n清洗 n n消毒和灭菌 现在学习的是第33页，共46页n n一、清洗 离体条件下，有害物质直接同细胞接触，细胞对任何有害物质十分敏感，极少残留物都可以对细胞产生毒副作用。因此，新的或重新使用的器皿都必须认真清洗，达到不含任何残留物的要求。现在学习的是第34页，共46页n n（一）玻璃器皿的清洗（一）玻璃器皿的清洗 一般经过浸泡、刷洗、一般经过浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四个步骤。浸酸、和清洗四个步骤。n n 1.浸泡:新的或用过的玻璃器皿要先用清水浸泡，软新的或用过的玻璃器皿要先用清水浸泡，软化和溶解附着物。新玻璃器皿使用前得先用自来水化和溶解附着物。新玻璃器皿使用前得先用自来水简单刷洗，然后用简单刷洗，然后用5 5盐酸浸泡过夜；用过的玻璃盐酸浸泡过夜；用过的玻璃器皿往往附有大量蛋白质和油脂，干涸后不易刷洗器皿往往附有大量蛋白质和油脂，干涸后不易刷洗掉，故用后应立即浸入清水中备刷洗。掉，故用后应立即浸入清水中备刷洗。现在学习的是第35页，共46页n n2.刷洗:将浸泡后的玻璃器皿放到洗涤剂水中，用软毛刷反复刷洗。不要留死角，并防止破坏器皿表面的光洁度。将刷洗干净的玻璃器皿洗净、晾干，备浸酸。现在学习的是第36页，共46页n n3.浸酸:浸酸是将上述器皿浸泡到清洁液中，又称酸液，通过酸液的强氧化作用清除器皿表面的可能残留物质。浸酸不应少于六小时，一般过夜或更长。放取器皿要小心。现在学习的是第37页，共46页n n4.冲洗:刷洗和浸酸后的器皿都必须用水充分冲洗，浸酸后器皿是否冲洗的干净，直接影响到细胞培养的成败。手工洗涤浸酸后的器皿，每件器皿至少要反复“注水倒空”15次以上，最后用重蒸水浸洗23次，晾干或烘干后包装备用。现在学习的是第38页，共46页n n（二）橡胶制品清洗（二）橡胶制品清洗 n n新的橡胶制品洗涤方法：新的橡胶制品洗涤方法：0.5mol/L NaOH0.5mol/L NaOH煮沸煮沸1515分钟，分钟，流水冲洗，流水冲洗，0.5mol/L HCl0.5mol/L HCl煮沸煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮分钟，流水冲洗，自来水煮沸沸2 2次，蒸馏水煮沸2020分钟，分钟，5050烤干备用。现在学习的是第39页，共46页n n（三）塑料制品的清洗 塑料制品特点：质软、易出现划痕；耐腐蚀能力强、但不耐热。清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水过夜，用纱布或棉签和50清洗液刷洗，流水冲洗，晾干，浸于清洁液1515分钟，流水冲洗（15152020遍）,蒸馏水浸洗三次，双蒸水泡蒸馏水浸洗三次，双蒸水泡2424小时，晾干备用。小时，晾干备用。现在学习的是第40页，共46页n n（四）包装（四）包装:对细胞培养用品进行消毒前，要进行严密包装，以便于消毒和贮存。常用的包装材料：牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、较大培养皿等，近几年用铝箔包装，非常方便，适用。培养皿、注射器、金属器械等用牛皮纸包装后再装入饭盒内，较大的器皿可以进行局部包扎。现在学习的是第41页，共46页二、消毒和灭菌二、消毒和灭菌 n n（一）物理消毒法（一）物理消毒法 1.1.紫外线消毒紫外线消毒:紫外线是一种低能量的电磁辐紫外线是一种低能量的电磁辐射，可杀死多种微生物。革兰阴性菌最为敏感，射，可杀死多种微生物。革兰阴性菌最为敏感，其次是阳性菌，再次为芽孢，真菌孢子的抵抗其次是阳性菌，再次为芽孢，真菌孢子的抵抗力最强。紫外线的直接作用是通过破坏微生物力最强。紫外线的直接作用是通过破坏微生物的核酸及蛋白质等而使其灭活，间接作用是通的核酸及蛋白质等而使其灭活，间接作用是通过紫外线照射产生的臭氧杀死微生物。直接照过紫外线照射产生的臭氧杀死微生物。直接照射培养室消毒，用法简单，效果好。射培养室消毒，用法简单，效果好。现在学习的是第42页，共46页n n2.2.高温湿热灭菌高温湿热灭菌:压力蒸汽灭菌是最常用的高温湿热压力蒸汽灭菌是最常用的高温湿热灭菌方法。对生物材料有良好的穿透力，能造成蛋灭菌方法。对生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡。布类、物、璃器皿、白质变性凝固而使微生物死亡。布类、物、璃器皿、属器皿、胶和某些培养液都可以用这方法灭菌。属器皿、胶和某些培养液都可以用这方法灭菌。现在学习的是第43页，共46页n n3.高温干热消毒:干热灭菌主要是将电热烤箱内物品加热到160以上，并保持90120分钟，杀死细菌和芽孢，达到灭菌目的。主要用于灭菌玻璃器皿（如体积较大的烧杯、培养瓶）、金属器皿以及不能与蒸汽接触的物品（如粉剂、油剂）。现在学习的是第44页，共46页n n（二）化学消毒：新洁而灭，其0.1水溶液可对器械、皮肤、操作表面进行擦拭和浸泡消毒。84泡腾片现在学习的是第45页，共46页14.10.202214.10.2022感感谢谢大大家家观观看看现在学习的是第46页，共46页