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【实验技术方法】分子生物学技术(zt)分子生物学技术   真核细胞DNA的制备与定量|质粒DNA的碱裂解法提取与纯化|噬菌体DNA提取|DNA分子的限制性内切酶消化|DNA片段回收与纯化|目的基因的亚克隆|PCR|引物参数计算|PCR产物的克隆|DNA序列测定|Southern 杂交|PCR-SSCP|细胞凋亡|RNA操作中的一般要求|RNA的制备|mRNA的分离与纯化|RT-PCR|Northern Blot|RPA|ddPCR|原位杂交|原核表达|蛋白SDS电泳|Western|表达蛋白的分离与纯化|表达蛋白的生物学活性的检测|真核转染            真核细胞DNA的制备与定量 制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。一、试剂准备1TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0)。2TBS: 25mM Tris-HCl (pH 7.4); 200mM NaCl; 5mM KCl。3裂解缓冲液：250mM SDS; 使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。420% SDS 52mg/ml蛋白酶K 6Tris饱和酚（pH 8.0）、酚/氯仿（酚氯仿=11）、氯仿7无水乙醇、75%乙醇二、操作步骤（一）材料处理1新鲜或冰冻组织处理： 取组织块0.3-0.5cm3, 剪碎，加TE 0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。 将匀浆液转移到1.5ml离心管中。 加20% SDS 25 ml，蛋白酶K (2mg/ml) 25 ml，混匀。 60°C水浴1-3hr。2培养细胞处理： 将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。 离心4000g×5min，去除上清液。 加10倍体积的裂解缓冲液。 50-55°C水浴1-2hr。（二）DNA提取1. 加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。2. 离心5000g×10min，取上层水相到另一1.5ml离心管中。3. 加等体积饱和酚，混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。4. 加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。5. 加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。6. 加1/10体积的3M醋酸钠（pH 5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。7. 待絮状物出现后，离心5000g×5min，弃上清液。8. 沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g×3min ，弃上清液。9. 室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100ml TE溶解过夜。(三）DNA定量和电泳检测1.DNA定量：DNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，OD值为1相当于大约50g/ml双链DNA。如用1cm光径，用 H2O稀释DNA样品n倍并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA（mg/ml）=50×OD260读数×稀释倍数/1000。DNA纯品的OD260/OD280为1.8，故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。2.电泳检测：取1g基因组DNA用行0.8%琼脂糖凝胶上电泳，检测DNA的完整性，或多个样品的浓度是否相同。电泳结束后在点样孔附近应有单一的高分子量条带。三、注意事项1. 所有用品均需要高温高压，以灭活残余的DNA酶。2. 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。3. 用大口滴管或吸头操作，以尽量减少打断DNA的可能性。4. 用上述方法提取的DNA纯度可以满足一般实验（如Southern 杂交、PCR等）目的。如要求更高，可参考有关资料进行DNA纯化。-                质粒DNA的碱裂解法提取与纯化 细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。 一、试剂准备1. 溶液: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4。2. 溶液：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。3. 溶液：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4保存备用。4. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4保存备用。5.苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）6.乙醇（无水乙醇、70%乙醇）7. 5×TBE：Tris 碱54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2?2H2O 4.65g，加ddH2O 至1000ml。15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4保存备用。8溴化乙锭（EB）：10mg/ml9.RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加热15min，分装后贮存于-20。10. 6×loading buffer（上样缓冲液）：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。11. 1% 琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖于三角烧瓶中，加100ml 0.5×TBE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60左右，加EB母液（10mg/ml）至终浓度0.5g/ml（注意：EB为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液0.5×TBE），即可上样。 二、操作步骤 1. 挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0ml LB（含相应抗生素）液体培养基中，37、250g振荡培养过夜（约12-14hr）。2.取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。3.将细菌沉淀重悬于100l预冷的溶液中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。4.加200l新鲜配制的溶液，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解（溶液为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。5.加入150l预冷的溶液，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3-5min。溶液为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。6.加入450l的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4离心12000g × 10min。7.小心移出上清于一新微量离心管中，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2-5min，4离心12000g×15min。8.1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1-2次，4离心8000g×7min，弃上清，将沉淀在室温下晾干。9.沉淀溶于20l TE（含RNase A 20g/ml），37水浴30min以降解RNA分子，-20保存备用。三、质粒DNA的电泳检测观察琼脂凝胶中DNA的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。该物质含有一个可以嵌入DNA的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致染料与DNA结合并呈现荧光，其荧光产率比游离染料溶液有所增加。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身则在302nm和366nm有光吸收。这两种情况下，被吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。因此，当凝胶中含有游离溴化乙锭时即可以检测到少量的DNA。取制备的质粒DNA 1-2l，加适当loading buffer混匀上样,采用 1-5V/cm的电压，使DNA分子从负极向正极移动至合适位置，取出凝胶置紫外灯下检测，摄片。四、注意事项 本裂解法小量制备质粒 DNA重复性好，一般无麻烦。若所提取质粒 DNA不能被限制性内切酶切割，可通过酚/氯仿再次抽提，以清除杂质来解决问题。-                噬菌体DNA提取 噬菌体是最早使用的克隆载体，噬菌体的基因组是一长度约为50kb的双链DNA分子，它在宿主细胞有两种生活途径，其一是裂解生长，环状DNA分子在细胞内多次复制，合成大量噬菌体基因产物，装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌再进行下一次感染；其二是溶源性生长，即感染细胞内噬菌体DNA整合到宿主菌染色体DNA中与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不裂解。平板培养时，裂解生长形成噬斑。液体培养时，裂解生长使菌液中宿主菌最后全部被裂解而释放出大量的噬菌体颗粒。经过改造的噬菌体克隆位点可插入几到几十kb的外源DNA。许多cDNA和基因组文库是以噬菌体作为克隆载体构建的。因此，在经文库筛选得到目的克隆后，我们常常需要利用噬菌体裂解生长的特点，培养获得大量的噬菌体颗粒，并提取噬菌体DNA来开展进一步的工作。一、试剂准备1. LB液体培养基：胰化蛋白胨（细菌培养用）10g，酵母提取物（细菌培养用）5g，NaCl 10g，加ddH2O 至1000ml，完全溶解，分装小瓶，15lbf/in2高压灭菌20min。2. 1.5%琼脂LB固体培养基: 称取1.5g琼脂粉放入300ml锥形瓶,加100mlLB，15 lbf/in2 高压灭菌20min，稍冷却，制备平皿。3. 20%麦芽糖：麦芽糖20g，加ddH2O 至100ml，0.22m滤膜过滤。4. SM液：NaCl 5.8g，MgSO4?7H2O 2g，1M Tris?CL（PH7.5）50ml，2%明胶 5ml，加ddH2O 至1000ml。15lbf/in2高压灭菌20min。5. RNase A 10mg/ml，TE配制，沸水浴15min，分装后贮存于-20。6DNase I 10mg/ml，TE配制，分装后贮存于-20。 7. PEG 80008. 10%SDS9EDTA: 0.5M pH8.03.苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）4.异丙醇5.无水乙醇、70%乙醇二、操作步骤1.噬菌体平板培养 用SM液10倍梯度稀释噬菌体原种。 取0.1ml各梯度稀释离心到一消毒微量离心管中，加0.2ml新鲜培养的宿主菌，加麦芽糖（0.2%），MgSO4（10mm），37温育20min，使噬菌体颗粒吸附于细菌。 取熔化（47）0.7%琼脂LB固体培养基3ml与上述管混匀，立即倒入预备（2-4天）的含凝固1.5%琼脂LB固体培养基的平板内，轻轻晃动平板使均匀分布。 37培养6-8hr后，观察噬斑形成。 用剪去部分头部的吸头挖取单个噬斑到0.5ml的SM液中，加0.05ml氯仿，震荡。37温育10min。 重复-，获得单个噬斑滴度。2.   噬菌体液体培养 取2ml新鲜培养的宿主菌，离心，0.4ml LB培养基重悬，加噬菌体0.1ml（新鲜获得的单个噬斑，依滴度使之与宿主菌比约1/500-1000）。 加麦芽糖（0.2%），MgSO4（10mM），37温育20min，使噬菌体颗粒吸附于细菌。 加到100ml LB液体培养基中，加麦芽糖（0.2%），MgSO4（10mM），37摇震培养9-12hr后可见裂解发生。 加0.1ml氯仿，37继续摇震培养10-20min。（二）噬菌体DNA提取1.将上述裂解液转移至离心管，离心8000g×10min，去细菌碎片，取上清液。2.加RNase A、DNaseI 至1g/ml， 37温育30min。3.加9.3g PEG 8000，5.8g NaCl，摇匀至溶解，冰浴1hr或4过夜。4.4离心10000g×20min，去上清液。5.加2ml SM液，充分洗溶管壁及沉淀，移到新微量离心管，加20l 10%SDS，20l 0.5M EDTA，6815min。6.加等体积苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），混匀，离心12000g×5min，取上层液到一新微量离心管，加等体积氯仿/异戊醇（24：1），混匀，离心12000g×5min。7.取上层液到一新微量离心管，加等体积异丙醇，混匀，-201hr，4离心12000g×10min，去上清液。8.1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1-2次，4离心8000g×7min，弃上清，将沉淀室温下晾干。9.沉淀溶于20l TE，-20保存备用。三、注意事项1.用于裂解的噬菌体、宿主菌为新鲜培养获得时，裂解好、裂解噬菌体收获量大。2.液体培养裂解时，如到培养时间时裂解尚未发生，可适当提高培养温度或加大摇震速度。3.RNase A 、DnaseI消化不全，DNA、RNA可粘走部分噬菌体。4.苯酚/氯仿抽提时，注意PEG、蛋白质等杂质污染，它们会影响限制性内切酶切割。-            DNA分子的限制性内切酶消化 限制性内切酶可特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的DNA序列位点上并在此切割双链DNA。绝大多数限制性内切酶识别长度为4、5或6个核苷酸且呈二重对称的特异序列，切割位点相对于二重对称轴的位置因酶而异。一些酶恰在对称轴处同时切割DNA双链而产生带平端的DNA片段，另一些酶则在对称轴两侧相对的位置上分别切断两条链，产生带有单链突出端（即粘端）的DNA片段。1个单位限制性内切酶是指在最适条件下，在50l体积1小时内完全切开1g噬菌体DNA所需的酶量。不同的限制性内切酶生产厂家往往推荐使用截然不同的反应条件，甚至对同一种酶也如此。但是，几乎所有的生产厂家都对其生产的酶制剂优化过反应条件，因此购买的内切酶说明书上均有其识别序列和切割位点，同时提供有酶切缓冲液（buffer，10×、5×）和最适条件，使得酶切反应变得日益简单。一、限制性内切酶对DNA消化的一般方案1.限制性内切酶反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。2.20l体积反应体系如下：   DNA           0.2-1 g  10×酶切buffer       2.0 l  限制性内切酶       1-2 u（单位）  加ddH2O         至 20 l限制性内切酶最后加入，轻轻混匀，稍加离心，放置于最适温度水浴并按所需的时间温育，一般为37水浴消化1hr。3.用于回收酶切片段时，反应总体积可达50-200l，各反应组分需相应增加。4.多种酶消化时若缓冲液条件相同，可同时加入；否则，先做低温或低盐的酶消化，再做高温或高盐的酶消化。5.酶切结束时，加入0.5M EDTA（pH 8.0）使终浓度达10mM，以终止反应。或将反应管在65水浴放置10min以灭活限制性内切酶活性。6.如消化反应体积过大，电泳时加样孔盛不下，可加以浓缩：终止反应后，加入0.6体积的5M乙酸铵（或1/10体积3M NaAc）和2倍体积无水乙醇，在冰上放置5min，然后于4离心12000g× 5min。倾去含大部分蛋白质的上清液。于室温晾干DNA沉淀后溶于适量TE中（pH 7.6）。7.如要纯化消化后的DNA，可用等体积酚/氯仿（11）和氯仿各抽提一次，再用乙醇沉淀。二、电泳检测取质粒酶切产物适量，加适当loading buffer混匀上样，以未经酶切的质粒或/和酶切的空载体（如有）作对照，采用 1-5V/cm的电压，使DNA分子从负极向正极移动，至合适位置取出置紫外灯下检测，摄片。 三、注意事项1. 浓缩的限制性内切酶可在使用前以1×限制酶缓冲液稀释，切勿用水稀释以免酶变性。2. 购买的限制性内切酶多保存于50%甘油中，于-20是稳定的。进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后即混匀，再从-20冰箱中取出酶，立即放置于冰上。每次取酶时都应更换一个无菌吸头，以免酶被污染。加酶的操作尽可能快，用完后立即将酶放回-20冰箱。3.尽量减少反应体积，但要确保酶体积不超过反应总体积的10%，否则酶活性将受到甘油的抑制。4.通常延长时间可使所需的酶量减少，在切割大量DNA时可用。在消化过程中可取少量反应液进行微量凝胶电泳以检测消化进程。5.注意星号酶切活力。-                DNA片段回收与纯化质粒、噬菌体等经酶切，电泳；PCR产物经电泳后，常常需要对一些DNA电泳片段进行回收和纯化，用于亚克隆、探针标记等。DNA回收和纯化常用方法有压碎法、低融点琼脂糖法、冻融法等，也有现成的试剂盒供应。一、冻融法1. 紫外灯下仔细切下含待回收DNA的胶条，将切下的胶条（小于0.6g）捣碎，置于1.5ml离心管中；2. 加入等体积的Tris-HCl饱和酚（pH 7.6），振荡混匀；3. -20放置5-10min；4. 4离心10000g×5min，上层液转移置另一离心管中；5. 加入1/4体积H2O于含胶的离心管中，振荡混匀；6. -20，放置5-10min；7. 4离心10000g×5min，合并上清液；8. 用等体积酚/氯仿、氯仿分别抽提一次，取上清；9. 加入1/10体积3M NaAc（pH 5.2）、2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀；10. -20，静置30min；11. 4离心13000g×10min，弃上清，75%乙醇洗沉淀1-2次，晾干；12. 加适量H2O或TE溶解沉淀。二、DNA回收试剂盒（QIAquick Gel Extraction Kit Protocol）1.   紫外灯下仔细切下含待回收DNA的凝胶，置1.5ml离心管中，称重。2.   加入Buffer QG（每100mg凝胶加Buffer QG 300l），置50水浴10min。3.   若回收片段小于500bp或大于4kb，则需加入异丙醇（每100mg凝胶加异丙醇100l），混匀。4.   将小柱放在2ml收集管上，将上述溶液加于柱上。5.   4离心13000g×1min，弃去收集管中液体。6.   加入500l Buffer QG于柱上，4离心13000g×1min，弃去收集管中液体。7.   加入750l Buffer PE于柱上，4离心13000g×1min，弃去收集管中液体。8.   4离心13000g×1min。弃去收集管。9.   将柱放于一新1.5ml离心管上，加50l EB于柱上。放置1min，4离心13000g×1min。10. 取5l 回收DNA电泳检测。三、 注意事项紫外灯下切下含待回收DNA的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜，使用无DNA污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA的污染。-                目的基因的亚克隆所谓亚克隆就是对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等。亚克隆的基本过程包括：(1)目的DNA片段和载体的制备；(2)目的DNA片段和载体的连接；(3)连接产物的转化；(4)重组子筛选。 一、试剂准备1LB液体培养基：胰化蛋白胨（细菌培养用）10g，酵母提取物（细菌培养用） 5g，NaCl 10g，加ddH2O 至1000ml，完全溶解，分装小瓶，15lbf/in2高压灭菌20min。21.5%琼脂LB固体培养基: 称取1.5g琼脂粉放入300ml锥形瓶,加100ml LB，15 lbf/in2 高压灭菌20min，稍冷却，制备平皿。3IPTG、X-Gal40.1M MgCl2 ：15 lbf/in2高压灭菌20min，0冰浴备用。50.1M CaCl2（以20%甘油水溶液配制）：15 lbf/in2高压灭菌20min，0冰浴备用。6限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶。二、目的DNA片段和载体的制备选择适宜的限制性核酸内切酶，消化已知目的DNA和载体，获得线性DNA，用于重组。根据目的DNA和载体的具体情况，选择一种或者两种适当的限制酶切割，分别产生对称性粘性末端（用一种限制性内切酶进行消化而产生带有互补突出端）、不对称粘性末端（用两种不同的限制性内切酶进行消化而产生带有非互补突出端）、平端。在亚克隆时，首选不对称相容末端连接，次选对称性粘性相容性末端连接，由于平末端连接效率较低，通常很少采用。但有时目的片段的末端与载体不匹配 ，一般先将不匹配末端补平，然后再以平末端连接。（实验操作同前述） 三、利用T4 DNA连接酶进行目的DNA片段和载体的体外连接（一）连接要求和结果 外源DNA片段末端性质     连接要求         连接结果 不对称粘性末端     两种限制酶消化后，需纯化载体以提高连接效率     载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；非重组克隆的背景较低；外源DNA可以定向插入到载体中。 对称性粘性末端     线形载体DNA常需磷酸酶脱磷处理     载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；外源DNA会以两个方向插入到载体中。 平端     要求高浓度的DNA和连接酶     载体与外源DNA连接处的限制酶切位点消失；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；非重组克隆的背景较高 。 带有相同末端(平端或粘端)的外源DNA片段必须克隆到具有匹配末端的线性质粒载体中,但是在连接反应时,外源DNA和质粒都可能发生环化,也有可能形成串联寡聚物。因此，必须仔细调整连接反应中两个DNA 的浓度，以便使“正确”连接产物的数量达到最佳水平，此外还常常使用碱性磷酸酶去除5磷酸基团以抑制载体DNA的自身环化。利用T4 DNA连接酶进行目的DNA片段和载体的体外连接反应，也就是在双链DNA 5磷酸和相邻的3羟基之间形成新的共价键。如载体的两条链都带有5磷酸（未脱磷），可形成4个新的磷酸二酯键；如载体DNA已脱磷，则只能形成2个新的磷酸二酯键，此时产生的重组DNA带有两个单链缺口，在导入感受态细胞后可被修复。（二）T4 DNA连接酶对目的DNA片段和载体连接的一般方案1连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。210l体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子（一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为11-15），补足ddH2O 至8l。3轻轻混匀，稍加离心，56水浴5min后，迅速转入冰浴。4加入含ATP的10×Buffer 1l，T4 DNA连接酶合适单位， 用ddH2O 补至10l，稍加离心，在适当温度（一般14-16水浴）连接8-14hr。四、连接产物的转化1.感受态细胞的制备 保存于-70的DH5（或其他菌种）用接种环划菌于1.5%琼脂平板上，37恒温倒置培养至单菌落出现（约14-16 hr）。 挑取单菌落，接种于2.0ml LB液体培养基中，37恒温，250g振荡培养过夜（约12hr）。 取0.5ml 过夜培养液，接种于100ml LB液体培养基中，37振荡培养2-2.5hr，至OD600为0.4-0.5时，放置于4冰箱冷却1-2hr。（注：以下操作均应在冰浴中进行。） 将培养液分入两个50ml离心管中，4离心，4000g×10min，弃去上清，用冰浴的0.1M MgCl2 25ml悬浮30min。 4离心,4000g×10min，弃去上清，加入冰浴的0.1M CaCl2-甘油溶液1ml悬浮。 以100l/管分装入1.5ml离心管中，-70冻存备用。注：此法制备感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒DNA产生5×106-2×107个菌落，这样的转化效率足以满足所有在质粒中进行的常规克隆的需要，制备的感受态细胞可贮存于-70，但保存时间过长会使转化效率在一定程度上受到影响，一般三个月以内转化效率无多大改变。2. 连接产物的转化 取100l贮存于-70钙化菌，冰浴化开； 加入适量连接产物（一般不超过10l，轻轻混匀，冰浴20min； 于42热休克90s，迅速转移至冰浴中，继续冰浴2-3min； 加入LB液体培养基200l，于37缓摇孵育45min； 将培养物适量涂于1.5%琼脂LB平板（根据质粒性质添加抗生素或/和X-Gal/IPTG），待胶表面没有液体流动时，37温箱倒置培养12-16hr。五、重组子的筛选根据载体的遗传特征筛选重组子，如-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为-互补。由-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。六、注意事项1.   目的DNA片段制备、回收、纯化时，应避免外来DNA污染。2. 不同厂家生产的T4 DNA连接酶反应条件稍有不同，但其产品说明书上均有最适反应条件，包括对不同末端性质DNA分子连接的T4 DNA连接酶的用量、作用温度、时间等。同时提供有连接酶缓冲液（10×、5×、2×），其中多已含有要求浓度的ATP，应避免高温放置和反复冻融使其分解。2.   连接产物的转化：细菌细胞经特殊试剂处理后在适当的条件下具有接收外源DNA的能力，因此可将上述连接产物通过热刺激或电脉冲转化感受态细胞，当细菌大量增殖的同时，导入的重组DNA也得到增殖。3.   制备感受态细胞所用离心管、培养瓶最好经酸碱处理或使用新的，15 lbf/in2高压灭菌20min。5. 白色菌落中重组质粒内插入片段是否是目的片段需通过鉴定。聚合酶链式反应（PCR） 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93-94）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72将单核苷酸从引物的3端开始掺入，以目的基因为模板从53方向延伸，合成DNA的新互补链。PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途：(1) 生成双链DNA中的特异序列作为探针；(2) 由少量mRNA生成 cDNA文库；(3) 从cDNA中克隆某些基因；(4) 生成大量DNA以进行序列测定；(5) 突变的分析；(6) 染色体步移；(7) RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。一、试剂准备1. DNA模版2对应目的基因的特异引物310×PCR Buffer 42mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM5Taq酶二、操作步骤 1在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。  10×PCR buffer       5 l  dNTP mix （2mM）       4 l 引物1（10pM）       2 l  引物2（10pM）       2 l  Taq酶 （2U/l）       1 l  DNA模板（50ng-1g/l）   1 l  加ddH2O至           50 l视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。2 调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93 40s 58 30s 72 60s，循环30-35次，最后在72 保温7min。3 结束反应，PCR产物放置于4待电泳检测或-20长期保存。4PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100l氯仿进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10l电泳检测。三、PCR反应体系的组成与反应条件的优化PCR反应体系由反应缓冲液（10×PCR Buffer）、脱氧核苷三磷酸底物（dNTPmix）、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA模板）五部分组成。各个组份都能影响PCR结果的好坏。1 反应缓冲液：一般随Taq DNA聚合酶供应。标准缓冲液含：50mM KCl，10mM Tris-HCl（pH8.3室温），1.5mM MgCl2。Mg2+的浓度对反应的特异性及产量有着显著影响。浓度过高，使反应特异性降低；浓度过低，使产物减少。在各种单核苷酸浓度为200M时，Mg2+为1.5mM较合适。若样品中含EDTA或其它螯合物，可适当增加Mg2+的浓度。在高浓度DNA及dNTP条件下进行反应时，也必须相应调节Mg2+的浓度。据经验，一般以1.5-2mM（终浓度）较好。2 dNTP ：高浓度dNTP易产生错误掺入，过高则可能不扩增；但浓度过低，将降低反应产物的产量。PCR中常用终浓度为50-400M的dNTP。四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同，如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时（偏高或偏低），就会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。此外，dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。因此，dNTP的浓度直接影响到反应中起重要作用的Mg2+浓度。3 Taq DNA聚合酶酶：在100l反应体系中，一般加入2-4U的酶量，足以达到每min延伸1000-4000个核苷酸的掺入速度。酶量过多将导致产生非特异性产物。但是，不同的公司或不同批次的产品常有很大的差异，由于酶的浓度对PCR反应影响极大，因此应当作预试验或使用厂家推荐的浓度。当降低反应体积时（如20l或50l），一般酶的用量仍不小于2U，否则反应效率将降低。4 引物：引物是决