《生物化学》实验讲义.pdf

实验一蛋白质及氨基酸的颜色反应一、目的意义一、目的意义1、学习几种鉴定氨基酸与蛋白质的一般方法及其原理。2、学习和了解一些鉴定蛋白质的特殊颜色反应及其原理。二、实验原理二、实验原理1、双缩脲反应当尿素加热到 180左右时，2 分子尿素发生缩合放出1 分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性溶液中与铜离子结合生成复杂的紫红色化合物，这一呈色反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有多个与双缩脲相似的键，因此也具有双缩脲的颜色反应。借此可以鉴定蛋白质的存在或测定其含量。应当指出，双缩脲反应并非蛋白质的特异颜色反应，因为凡含有肽键的物质并不都是蛋白质。2、茚三酮反应蛋白质与茚三酮共热，产生蓝紫色化合物，此反应为一切蛋白质及-氨基酸（除脯氨酸和羟脯氨酸）所共有。含有氨基酸的其他化合物也呈此反应。该反应十分灵敏，1:1500000 浓度的氨基酸水溶液就能呈现反应。因此，此反应广泛用于氨基酸的定量测定。3、黄色反应含有苯环侧链的（特别是含酪氨酸）蛋白质溶液与硝酸共热时，呈黄色（硝基化合物），再加碱则变为橙黄色，此反应也称为黄蛋白反应。OHHONO2+NaOHOH+HNO3HONO2+H2O1ONOH三、仪器与试剂三、仪器与试剂1、试剂(1)蛋白质溶液：取10mL 鸡蛋清，用蒸馏水稀释至100mL，搅拌均匀后用纱布过滤得上清液。(2)0.3%色氨酸溶液、0.3%酪氨酸溶液、0.3%脯氨酸溶液、0.5%甘氨酸溶液、0.5%苯酚溶液。(3)0.1茚三酮乙醇溶液：称取0.1g 茚三酮，溶于 100mL 95乙醇。(4)10NaOH 溶液、1硫酸铜溶液、尿素、浓硝酸。2、仪器：试管及试管夹、酒精灯。四、操作方法四、操作方法1、双缩脲反应(1)取一支干燥试管，加入少量尿素，用微火加热使之熔化，待熔化的尿素开始变硬时停止加热。此时，尿素已缩合为双缩脲并放出氨气（可由气味辨别）。待试管冷却，加入约 1mL10NaOH 溶液，振荡使其溶解，再加入1 滴 1硫酸铜溶液。混匀后观察出现的粉红色。(2)另取 1 支试管，加入 1mL 蛋白质溶液，再加入 2mL 10NaOH 溶液摇匀，然后再加入2滴 1的硫酸铜溶液。摇匀观察其颜色变化。(3)注意事项加入的硫酸铜不可过量，否则会产生蓝色的氢氧化铜，从而掩盖了双缩脲反应的粉红色。(4)记载上述实验过程和结果，并解释现象。2、茚三酮反应(1)取 3 支试管，分别加入蛋白质溶液、0.3%脯氨酸溶液、0.5%甘氨酸溶液各 1mL，再加 0.5mL0.1茚三酮乙醇溶液，混匀后在小火上加热煮沸12min，放置冷却，观察颜色变化。(2)在滤纸的不同部位分别滴上一滴0.3%脯氨酸溶液、0.5%甘氨酸溶液，风干后再在原处滴一滴 0.1茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察斑点出现及其颜色。(3)记载上述实验过程和结果，并解释现象。3、黄色反应向 6 个试管中按下表加试剂，观察现象并记录。管 号材 料加入量（滴）浓硝酸（滴）现象逐滴加 10%NaOH 后现象1蛋白质溶液422指甲少许203450.3%色氨酸4460.3%酪氨酸44头发0.5%苯酚少许2044酒精灯加热煮沸2实验二蛋白质的沉淀反应蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶性盐类后，即自溶液中沉淀析出（浑浊现象），此现象叫蛋白质的沉淀反应。（一）蛋白质的盐析作用（一）蛋白质的盐析作用一、目的意义一、目的意义了解盐析法及可逆沉淀的原理，学习用盐析法沉淀分离蛋白质。二、实验原理二、实验原理盐析现象是指般蛋白质在高浓度盐溶液中溶解度下降，故向其溶液中加入中性盐至一定浓度时，蛋白质即自溶液中沉淀析出。盐析作用与两种因素有关：蛋白质分子被浓盐脱水；分子所带电荷被中和。盐溶现象为低盐浓度可使蛋白质的溶解度增加，实验时要加足够量的盐。蛋白质的盐析作用是可逆过程，用盐析方法沉淀蛋白质时，较少引起蛋白质变性，经透析或用水稀释时又可溶解。三、仪器与试剂三、仪器与试剂1、试剂 蛋白质溶液：取 10mL 鸡蛋清，用蒸馏水稀释至 100mL，搅拌均匀后用纱布过滤得上清液。饱和硫酸铵溶液；10%氢氧化钠溶液；1%硫酸铜溶液。四、操作方法四、操作方法1、取蛋白质溶液约 2mL 于试管中，加入过量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置 3 分钟则析出沉淀。（二）重金属盐类沉淀蛋白质（二）重金属盐类沉淀蛋白质一、目的意义一、目的意义了解重金属盐类沉淀法的原理，学习用重金属盐类沉淀法沉淀分离蛋白质。二、实验原理二、实验原理溶液 pH 在蛋白质等电点以上时，重金属盐类（如Pb2+、Cu2+、Hg2+及 Ag+等）易与蛋白质结合成不溶性盐而沉淀。重金属盐类沉淀蛋白质通常比较完全，故常用重金属盐除去液体中的蛋白质。但应注意，在使用某些重金属盐（如硫酸铜或醋酸铅）沉淀蛋白质时，不可过量，否则将引起沉淀再溶解，此时的溶解为生成憎水胶体的缘故。三、仪器与试剂三、仪器与试剂31、试剂 蛋白质溶液（与双缩脲反应相同）；5%CuSO4溶液；3%AgNO3溶液。四、操作方法四、操作方法1、取试管 2 支各加蛋白质溶液 1mL。2、向各管分别滴加 23 滴加 5CuSO4溶液、3AgNO3溶液，观察各管所生成的沉淀。3、在硫酸铜产生蛋白质沉淀的试管中，倒掉大部分沉淀，留少量沉淀，继续加入 5CuSO4溶液，观察沉淀的溶解。（三）有机酸沉淀蛋白质（三）有机酸沉淀蛋白质一、目的意义一、目的意义了解有机酸沉淀法的原理，学习用有机酸沉淀法沉淀分离蛋白质。二、实验原理二、实验原理生物碱是植物中具有显著生理作用的一类含氮的碱性物质。凡能使生物碱沉淀，或能与生物碱作用产生颜色反应的物质，称为生物碱试剂。如鞣酸、苦味酸和磷钨酸等。当蛋白质溶液 pH 值低于其等电点时，蛋白质为阳离子，能与生物碱试剂的阴离子结合成不溶性盐而沉淀。溶液中的蛋白亦能被有机酸沉淀，其中以三氯醋酸的作用最为灵敏而且特异，因此广泛地被用于沉淀蛋白质，为首选沉淀剂，只能沉淀蛋白质，不能沉淀其水解产物，加热可除去。三、仪器与试剂三、仪器与试剂1、试剂 蛋白质溶液（与双缩脲反应相同）；5%三氯醋酸溶液；5%单宁酸溶液。四、操作方法四、操作方法1、取蛋白质溶液 1mL 于试管中，加数滴三氯醋酸溶液，观察现象。2、取蛋白质溶液 1mL 于试管中，加数滴单宁酸溶液，观察现象。4实验三实验三氨基酸的纸层析氨基酸的纸层析一、目的意义一、目的意义1、了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。2、学习纸层析的操作技术，分离鉴定未知样品的氨基酸成分。二、实验原理二、实验原理纸层析法属于分配层析法的一种，是以滤纸作为惰性支持物。滤纸纤维上分布大量的亲水性羟基，因此能吸附水作为固定相，通常把有机溶剂作为流动相。将样品在滤纸上（此点称为原点），用有机溶剂进行展层时，样品中的各种溶质即在两相溶剂中不断进行分配。由于各种溶质在两相溶剂中的分配系数不同，因而不同溶质随流动相移动的速率不等，于是从点样的一端向另一端展开时，样品中不同溶质被分离开来，形成距原点距离不等的层析点。样品被分离后在纸层析图谱上的位置，是用比移值Rf 来表示的在一定条件下（如温度、展层剂的组成、层析纸质量等不变），某物质的 Rf 值是一个常数，借此可作定性分析依据。三、仪器与试剂三、仪器与试剂1、试剂(1)氨基酸标准溶液：1%的甘氨酸、脯氨酸。(2)混合氨基酸溶液：将 1%的甘氨酸、脯氨酸也按 1%浓度制成混合溶液。(3)展层剂：将20 毫升的正丁醇和 5 毫升的冰醋酸放入分液漏斗中，与15 毫升水混合，充分振荡，静止后分层，放出下层水层后备用。(4)显色剂：0.1%茚三酮正丁醇溶液。2、仪器层析缸（12*12CM 规格，垂直型）、层析滤纸（新华一号滤纸，事先裁成11*11CM规格）、电吹风（学生自带，每组一个）、三角板、铅笔和干纸巾（学生自带，每组一套）、毛细管。四、操作方法四、操作方法1、准备滤纸：三个点，每隔2CM 画一个“+”，用铅笔连起描成一条直线。每个“+”点距离滤纸底端 2CM。2、点样：每个样品用毛细管点3 次，每次点完后用电吹风吹干。一个样品用一支毛细管。3、饱和平衡：在缸底部玻璃突起的一侧加入10-15ml 展层剂，另一侧先不加；让滤纸都放先放到未加展层剂的干燥一侧，然后盖上盖子平衡饱和20 分钟。（可写试验报告，简单讲课）4、开始层析：稍微拿出滤纸，再在干燥的一侧也加入10-15ml 展层剂，然后让滤纸分别在该侧开始层析。55、结束层析：等到展层剂上升到距离滤纸上端3cm 左右，就拿出滤纸，用铅笔划线描出液体的上边界，然后用电吹风吹干。6、茚三酮显色：把滤纸放在桌面上，整张纸用滴管滴加满茚三酮溶液，再用热风吹干，直到有结果出现。7、计算 RF 值：用铅笔描出每个氨基酸的区域，测量距离计算甘氨酸和脯氨酸的Rf 值。（每个组需将该滤纸夹在组长的实验报告中，并注明是第几组）五、结果计算五、结果计算1、用铅笔将层析结果轮廓和中心点描出来，计算各种氨基酸的Rf 值。2、分析混合样品中未知氨基酸的组分。六、作业题六、作业题1、若展开剂高于点样线，对最终的层析结果有何影响？2、点样时，样品浓度太高或斑点之间间距过小，对最终的层析结果有何影响？6实验四牛奶中酪蛋白的制备一、目的意义一、目的意义1、学习从牛奶中制备酪蛋白的原理和方法。2、掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法。二、实验原理二、实验原理牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为3.5g/100mL。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，不溶于水、醇、有机溶剂，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH 调至 4.7 时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。三、仪器与试剂三、仪器与试剂1、试剂(1)95%乙醇；(2)无水乙醚；(3)0.2mol/L pH4.7 醋酸醋酸钠缓冲液：先配A 液与 B 液，A 液：0.2mol/L 醋酸钠溶液，称 NaAC3H2O 54.44g，定容至 2000mL；B 液：0.2mol/L 醋酸溶液，称纯醋酸（含量大于99.8%）12.0g 定容至 1000mL；取 A 液 1770mL，B 液 1230mL 混合即得 pH4.7 的醋酸醋酸钠缓冲液3000mL。(4)乙醇乙醚混合液：乙醇:乙醚=1:1（V/V）。(5)10%醋酸溶液2、仪器：新鲜牛奶；台式离心机、抽滤装置、精密pH 试纸、恒温水浴锅、烧杯、温度计、50ml 大离心管。四、操作方法四、操作方法1、酪蛋白的粗提20mL 牛奶加热至 40，在搅拌下慢慢加入预热至40（实验前水浴锅提前预热到43）、pH4.7 的醋酸缓冲液 20mL，对照精密 pH 试纸用 10%醋酸溶液调 pH 至 4.7（肉眼可见絮状物质如果牛奶与缓冲液混合后，絮状沉淀出现不充分，需要加入较多的醋酸溶液，否则离心后没有分层）。将上述悬浮液冷却至室温。离心10 分钟（3000r/min）。弃去清液，得酪蛋白粗制品。2、酪蛋白的纯化(1)加入 40ml 蒸馏水搅拌洗涤沉淀，直接抽滤（事先检查真空泵是否已加满水）。(2)在沉淀中加入 30mL 乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤（注意不要沾壁）。用乙醇乙醚混合液洗沉淀1 次（不要更换滤纸），最后用乙醚洗沉淀1 次，抽干。(3)将沉淀摊开在干燥滤纸上，电炉上烘干，得酪蛋白纯品。7(4)准确称重，计算含量和得率。五、结果计算五、结果计算X m100V式中：X酪蛋白含量，g/100 mL 牛乳；V量取牛奶的体积，mL；m收获酪蛋白的质量，g。六、注意事项六、注意事项1、由于本法是应用等电点沉淀法来制备蛋白质，故调节牛奶液的等电点一定要准确。最好用酸度计测定。2、精制过程用乙醚是挥发性、有毒的有机溶剂，最好在通风橱内操作。3、目前市面上出售的牛奶是经加工的奶制品，不是纯净牛奶，所以计算时应按产品的相应指标计算。七、作业题七、作业题1、试验中，分别加入乙醇、乙醚洗涤沉淀的作用是什么？2、试验中，你觉得影响最终酪蛋白纯度和得率的因素可能会有哪些？请简单分析8实验五酵母 RNA 的提取一、目的意义一、目的意义掌握稀碱法提取 RNA 的原理和方法，学会抽滤操作。二、实验原理二、实验原理酵母细胞富含核酸，且核酸主要是 RNA，含量为干菌体的 2.67%10.0%，而 DNA 含量较少，仅为 0.03%0.516%。为此提取 RNA 多以酵母为原料。工业上制备RNA 多选用低成本、适于大规模操作的稀碱法或浓盐法。这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备单核苷酸的原料，其工艺比较简单。稀碱法是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀 RNA 或调 pH2.5 利用等电点沉淀。提取的RNA 有不同程度的降解。浓盐法是用高浓度盐溶液处理，同时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。三、仪器与试剂三、仪器与试剂1、试剂 0.2%氢氧化钠溶液；酸性乙醇溶液：30mL 乙醇加 0.3mL HCl；95%乙醇；乙醚；2、仪器：酵母粉、量筒、抽滤瓶、布氏漏斗、台式离心机、天平等。四、操作方法四、操作方法1、研磨：称取 3g 干酵母粉于研钵中（如果是10 个组，称取 30 克，大研钵中磨，再分装给各个组），加入30mL（10 个组，是 300 mL）0.2%NaOH 溶液中，加入少量石英砂，研磨均匀 10min。2、沸水提取：将酵母匀浆转入100mL 小烧杯中沸水浴（提前打开水浴锅，加热到95 度）加热 20 分钟，不断搅拌。冷却后移到离心管，4000r/min 离心 10 分钟后，沉淀弃去沉淀弃去，将上清上清液液移到小烧杯中，慢慢倾入20mL 酸性乙醇，边加边搅。静置 10min。3、离心：待 RNA 完全沉淀，移到离心管，4000r/min 离心 5 分钟。4、洗涤、抽滤：弃去上清液弃去上清液，加入30ml 95%乙醇洗涤沉淀并搅拌后，转移至布氏漏斗抽滤，继而再用 20ml 无水乙醚洗涤，洗涤时可用细玻璃棒小心搅动沉淀。沉淀在空气中干燥。5、称重计算：称量所得RNA 粗品的重量。五、结果计算五、结果计算X m100V式中：XRNA 粗品含量，g/100g 酵母；V酵母的质量，g；m收获 RNA粗品的质量，g。六、作业题六、作业题1、RNA 的含量测定还有其它方法吗？试举例简单说明2、沸水浴的作用是什么？9实验六糖的呈色反应和定性鉴定（一）（一）FehlingFehling 试验试验一、目的意义一、目的意义了解鉴定还原糖的方法及其原理。二、实验原理二、实验原理费林试剂是含有硫酸铜和酒石酸钾钠的氢氧化钠溶液。硫酸铜与碱溶液混合加热，则生成黑色的氧化铜沉淀。若同时有还原糖存在，则产生黄色或砖红色的氧化亚铜沉淀。为了防止铜离子和碱反应生成氢氧化铜或碱性碳酸铜沉淀，Fehling 试剂中加入酒石酸钾钠，它与 Cu2形成的酒石酸钾钠络合铜离子是可溶性的络离子，该反应是可逆的。平衡后溶液内保持一定浓度的氢氧化铜。费林试剂是一种弱的氧化剂，它不与酮和芳香醛发生反应。三、仪器与试剂三、仪器与试剂1、试剂甲：称取 34.5g 硫酸铜溶于 500mL 蒸馏水中。2、试剂乙：称取 125g NaOH 137g 酒石酸钾钠溶于 500mL 蒸馏水中，贮存于具橡皮塞玻璃瓶中。临用前，将试剂甲和试剂乙等量混合成Fehling 试剂。3、1%葡萄糖溶液；1%蔗糖溶液；1%淀粉溶液（先配好）。四、操作方法四、操作方法取试管，编号，各加入Fehling 试剂 1mL。摇匀后，分别加入4 滴待测糖溶液，置沸水浴中加热 23min，取出冷却，观察沉淀和颜色变化。（二）（二）BenedictBenedict 试验（班氏试验）试验（班氏试验）一、目的意义一、目的意义了解鉴定还原糖的方法及其原理。二、实验原理二、实验原理Benedict 试剂是 Fehling 试剂的改良。Benedict 试剂利用柠檬酸作为 Cu2+的络合剂，其碱性较 Fehling 试剂弱，灵敏度高，干扰因素少。三、仪器与试剂三、仪器与试剂1、Benedict 试剂（班氏试剂）：将 170g 柠檬酸钠和 100g 无水碳酸钠溶于 800mL 水中；另将17g 硫酸铜溶于 100mL 热水中。将硫酸铜溶液缓缓倾入柠檬酸钠碳酸钠溶液中，边加边搅，最后定容至 1000mL。该试剂可长期使用。2、1%葡萄糖溶液；1%蔗糖溶液；1%淀粉溶液。四、操作方法四、操作方法取试管，编号，分别加入 2mL Benedict 试剂和 4 滴待测糖溶液，沸水浴中加热5 分钟，取出后冷却，观察各管中的颜色变化。五、作业题：五、作业题：1、除这两个试验方法外，还有其它何种办法鉴别还原糖和非还原糖？请简述10实验七淀粉的提取和性质实验一、目的意义一、目的意义1、熟悉淀粉与碘的呈色反应。2、了解淀粉的提取方法和水解条件及产物。二、实验原理二、实验原理1、淀粉的提取淀粉是一种重要的多糖，是一种相对分子量很大的天然高分子化合物，广泛分布于植物界，谷类、果实、种子、块茎中含量丰富。工业用的淀粉主要从玉米、甘薯、马铃薯中制取。淀粉是一种白色粉末，不溶于冷水，在热水里淀粉颗粒会膨胀，有一部分淀粉溶解在水里，另一部分悬浮在水里，形成胶状淀粉糊。2、淀粉与碘的显色反应直链淀粉遇碘呈蓝色，支链淀粉遇碘呈紫红色，糊精遇碘呈蓝紫、紫、橙等颜色。这些显色反应的灵敏度很高，可用作鉴别淀粉的定量和定性的方法，也可用它来分析碘的含量。淀粉和碘的显色反应除了吸附原因外，主要是由于生成包合物的缘故。直链淀粉是由 -葡萄糖分子缩合而成螺旋状的长长的螺旋体，每个葡萄糖单元都仍有羟基暴露在螺旋外。碘分子跟这些羟基作用，使碘分子嵌入淀粉螺旋体的轴心部位。碘跟淀粉的这种作用叫做包合作用，生成物叫做包合物。淀粉跟碘生成的包合物的颜色，跟淀粉的聚合度或相对分子质量有关。在一定的聚合度或相对分子质量范围内，随聚合度或相对分子质量的增加，包合物的颜色的变化由无色、橙色、淡红、紫色到蓝色。例如，直链淀粉的聚合度是200980 或相对分子质量范围是32 000160 000 时，包合物的颜色是蓝色。分支很多的支链淀粉，在支链上的直链平均聚合度 2028，这样形成的包合物是紫色的。糊精的聚合度更低，显棕红色、红色、淡红色等。表 21淀粉的聚合度和生成碘包合物的颜色葡萄糖单位的聚合度包合物的颜色3.8无色7.4淡红12.9红18.3棕红20.229.334.7 以上蓝色紫色蓝紫色淀粉跟碘生成的包合物不稳定，易被乙醇、氢氧化钠和热等作用，使颜色褪去，而只在pH=4 时最稳定，所以它的显色反应在微酸性溶液里最明显。3、淀粉的水解淀粉进入人体后，一部分淀粉受唾液中淀粉酶的催化作用，发生水解反应，生成麦芽糖；余下的淀粉在小肠里胰脏分泌出的淀粉酶的作用下，继续进行水解，生成麦芽糖。麦芽糖在11肠液中麦芽糖酶催化下，水解为人体可吸收的葡萄糖，供人体组织的营养需要。反应过程为：（C6H12O5）m(C6H10O5)nC12H22O11C6H12O6淀粉糊精麦芽糖葡萄糖三、仪器与试剂三、仪器与试剂1、试剂(1)乙醇、0.1淀粉液（1mL1%淀粉溶液加 5 mL 蒸馏水）、10NaOH 溶液、20H2SO4溶液、10Na2CO3溶液。(2)2%碘液：将碘化钾 20g 及碘 10g 溶于 100mL 水中。使用前稀释 10 倍。(3)班氏（Benedict）试剂：见糖的呈色反应实验。2、仪器：生马铃薯、组织捣碎机、纱布、布氏漏斗、抽滤瓶、水浴锅、试管夹、量筒、烧杯、白瓷板、试管。四、操作方法四、操作方法1、淀粉的提取（演示，实验不再做）生马铃薯去皮，切碎，称取50g，加少量水，捣碎匀浆，用四层纱布过滤，除去粗颗粒，滤液中淀粉很快沉淀，然后用水多次洗涤淀粉，再抽滤后滤饼放在表面上风干即可。2、淀粉与碘的反应(1)取少量自制淀粉于白瓷板孔内，加碘液两滴，观察颜色。(2)取试管一支，加入 0.1的淀粉液 6mL，碘液两滴，摇匀，观察颜色变化。另取试管两支，将前述淀粉液均分为三等份并编号做如下实验：1 号管在酒精灯上加热，观察颜色变化。然后冷却，又观察颜色变化。2 号管加入 10NaOH 溶液几滴，观察颜色变化3 号管加入乙醇 4mL，观察颜色变化。记载上述实验过程和结果，并解释现象。3、淀粉的水解(1)在试管 1 中加入少量淀粉和 4mL 水，在试管 2 中加入 0.5g 淀粉和 4mL 20%的硫酸溶液。分别加热试管煮沸 34min。(2)把试管 2 中的一部分溶液倒入试管3 中，留作下一步实验用。(3)向试管 1 和试管 2 中加入几滴碘溶液，观察现象。(4)向试管 3 中滴入 20%Na2CO3溶液，中和溶液中的硫酸，把溶液调呈弱碱性，使溶液的 pH 值约为 910（直到 CO2气泡冒完为止）。再加入 2mL 班氏试剂，加热煮沸后观察现象。记载上述实验过程和结果，并解释现象。六、作业题：六、作业题：1、在加热的过程中，为什么碘与淀粉会呈现不同的颜色反应？12实验八油脂氧化酸败的定性检验及定量测定一、目的意义一、目的意义1、进一步掌握油脂氧化酸败的机理。2、学会油脂氧化酸败的定性检验及酸值测定的操作技术。二、实验原理二、实验原理油脂氧化酸败的过程是极复杂的化学变化过程，对食品质量影响很大。酸败的油脂中某些分解产物对人体有害，例如环氧丙醛。过氧化物是油脂自动氧化的主要初级产物，过氧化物可进一步分解，生成低级的醛、酮和羧酸，通过油脂中过氧化物、醛类的检出，可定性判断油脂是否已发生酸败。环氧丙醛在酸败的油脂中不呈游离状态，而是成为缩醛。在盐酸作用下，环氧丙醛逐渐释出，释出的游离环氧丙醛与间苯三酚发生缩合反应，生成红色的凝聚物（环氧丙醛-间苯三酚凝聚物），由红色凝聚物的生成可判断油脂已发生酸败。酸值是评定油品酸败程度的指标之一，它是指中和1g 油脂中游离脂肪酸所消耗的氢氧化钾的质量(mg)。油脂中游离的脂肪酸与氢氧化钾发生中和反应，从氢氧化钾标准溶液消耗量计算出油脂的酸值。反应如下：RCOOHKOH RCOOKH2O三、仪器与试剂三、仪器与试剂1、试剂 0.1间苯三酚乙醚溶液；浓盐酸；中性乙醚乙醇混合液(体积比为 21)，临用前用 0.1 mol/L 氢氧化钾溶液中和至酚酞指示剂呈中性；酚酞指示剂：1乙醇溶液；0.1000mol/L 氢氧化钾标准溶液；花生油(新鲜与不新鲜样品各 1 种)。2、仪器：恒温水浴、锥形瓶、试管及试管架、量筒、25mL 比色管、滴定管、容量瓶。四、操作方法四、操作方法 油脂氧化酸败的定性检验1、间苯三酚乙醚溶液法（克莱斯氏环氧丙醛反应）13取试样 2mL 于试管中，加入浓盐酸 2mL，用橡皮塞塞好管口，剧烈振荡10s 左右，再加0.1间苯三酚乙醚溶液2mL,加塞剧烈振荡 10s 左右，使酸层分离。观察下层溶液颜色。结果表示：下层呈桃红色或红色表示油脂已酸败，下层呈浅粉红色或黄色表示未酸败。油脂酸值的测定精密称取 3g 试样置于锥形瓶中，加入 30mL 中性乙醚乙醇混合液，摇匀使油脂溶解（必要时可置热水中，温热使其溶解，冷至室温）。加入酚酞指示剂23 滴，用0.1mol/L 氢氧化钾标准溶液滴定至初现微红色，且30 秒内不褪色为终点。记下消耗0.1mol/L 氢氧化钾溶液的用量。五、结果计算五、结果计算X=V C 56.11m式中：X试样的酸值（以氢氧化钾计），mg/g；V试样消耗氢氧化钾标准溶液体积，mL；C氢氧化钾标准溶液实际浓度，mol/L；m试样质量，g；56.11与 1.0mL 氢氧化钾标准溶液相当的氢氧化钾毫克数。六、注意事项六、注意事项1、间苯三酚乙醚法试验、酸值测定，切忌明火。2、酸值测定中，如油样色泽深，可减少试样用量或适当增加混合溶剂的用量；如因色深判断终点困难，可改换指示剂，用碱性蓝6B、百里酚酞做指示剂或用酚酞试纸作外指示。3、测定蓖蔴油酸度时，只用中性乙醇而不用混合溶剂。4、光线会促进空气对试剂的氧化，应注意避光存放试剂；14实验九维生素 C 的定量测定一、目的意义一、目的意义掌握 2，6二氯靛酚法测定维生素C 的原理和方法。二、实验原理二、实验原理维生素 C 又称抗坏血酸，还原型抗坏血酸能还原染料2，6二氯靛酚钠盐，本身则氧化成脱氢抗坏血酸。在酸性溶液中，2，6二氯靛酚钠离子呈红色，被还原后变为无色。三、仪器与试剂三、仪器与试剂1、试剂(1)2%草酸溶液；(2)0.001N 2，6二氯靛酚钠溶液：称取碳酸氢钠52mg 溶解在 200mL 热蒸馏水中，然后称取2，6二氯靛酚 50mg 溶解在上述碳酸氢钠溶液中。冷却定容至250mL，过滤至棕色瓶内，保存在冰箱中。每次使用前，用标准抗坏血酸标定其滴定度。2、仪器：匀浆机、小锥形瓶、酸式滴定管、研钵、容量瓶、移液管、小离心管等。四、操作方法四、操作方法1、样液的制备及滴定称取 100g 青椒匀浆，取（x/8，x 代表匀浆体积数，约为50；8 代表组数）mL 青椒匀浆液移入 50mL 容量瓶中，用 2%草酸溶液定容摇匀。每次量取20mL 提取液放入锥形瓶内，用2，6二氯酚靛酚钠溶液进行滴定呈现淡粉红色，并在1530 秒内不褪色，滴定过程必须迅速，不要超过 2 分钟。平行试验进行 2 次，记录消耗 2，6二氯酚靛酚钠溶液的用量。2、滴定滴定管装入，滴定至提取液，另取 10mL 2%草酸按上法作空白对照试验，记录消耗2，6二氯酚靛酚钠溶液的用量。五、结果计算五、结果计算M=(VA-VB)C0.088100/（DW）式中：M100g 样品中含抗坏血酸的质量，mg；VA滴定样品管时所用去染料体积数，mL；VB滴定时空白管时所用去染料体积数，mL；C提取液总毫升数，mL；D滴定时所取的样品的提取液毫升数，mL；W被检样品的重量，g；0.0880.001N 2，6二氯酚靛酚钠溶液 1mL 相当于 0.088mgVC。15实验十酶的特性实验一、目的意义一、目的意义1、加深对酶所具有特性的认识。2、了解淀粉酶、过氧化物酶的作用二、实验原理二、实验原理淀粉和蔗糖缺乏自由醛基，故无还原性。在淀粉酶的作用下，淀粉很容易水解生成麦芽糖。麦芽糖是还原性糖，可使班氏试剂中二价铜离子还原成一价亚铜，生成砖红色的氧化亚铜沉淀。但淀粉酶不能催化蔗糖水解生成具有还原性的葡萄糖或果糖，而蔗糖本身不具有还原性，故不能与班氏试剂产生砖红色沉淀。过氧化物酶能催化过氧化物释放出新生氧以氧化某些酚类和胺类物质，例如可氧化溶于水中的焦性没食子酸生成不溶于水的焦性没食子橙（橙红色）。三、仪器与试剂三、仪器与试剂1、试剂(1)1%蔗糖溶液；(2)1%淀粉溶液（需新鲜配制）：称取可溶性淀粉1g，加5mL 蒸馏水，调成糊状，再加入80以上蒸馏水使其溶解，最后定容至100mL。(3)唾液淀粉酶溶液：用水漱口两次（可安排一个学生用矿泉水请洗涤口腔，取得），口腔含水做咀嚼运动，促进唾液分泌，收集后用两层纱布过滤，取滤液 5mL 用蒸馏水稀释 10 倍，混匀备用；(4)煮沸淀粉酶溶液：取10mL 淀粉酶溶液，在沸水中煮沸20 分钟使淀粉酶变性失活。(5)班氏（Benedict）试剂；(6)缓冲液 A 0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液：称取35.62g 磷酸氢二钠溶于 1000mL 蒸馏水中；缓冲液 B 0.1mol/L 柠檬酸溶液：称取 19.21g 无水柠檬酸溶于 1000mL 蒸馏水中；缓冲液pH6.8(7)1%焦性没食子酸水溶液：称取 1g 焦性没食子酸，用少量蒸馏水溶解，然后定容至 100mL。(8)2%过氧化氢溶液。(9)白菜梗提取液：称取白菜梗约5g，切成细块，置于研钵中加蒸馏水约15mL，研磨成浆，经纱布过滤后滤液备用。2、仪器160.2mol/L 磷酸氢二钠（mL）7.720.1mol/L 柠檬酸（mL）2.28试管及试管架、滴管、水浴锅、天平、试管、漏斗、滴管、剪刀等。四、操作方法四、操作方法1、淀粉酶的专一性取 3 支试管编号，按下表操作。管号123pH6.8 缓冲液（滴）2020201%淀粉溶液（滴）101001%蔗糖溶液（滴）002唾液淀粉酶溶液（滴）505煮沸淀粉酶溶液（滴）050混匀后置于 37水浴保温 10 分钟，然后向各管中加入班氏试剂20 滴，放入沸水中煮沸，观察并分析结果。2、过氧化物酶作用试验取 4 支试管编号，按下表操作。管号12341%焦性没食子酸（mL）22222%过氧化氢溶液蒸馏水白菜梗提取液煮沸的白菜梗提取液（mL）2022（mL）2000（mL）0220（mL）0002摇匀后观察并记录各管颜色变化。五、注意事项五、注意事项1、操作过程中严格防止试剂污染。2 2、严格按照顺序加试剂。17