蛋白质的共价结构精选PPT.ppt

关于蛋白质的共价结构关于蛋白质的共价结构第1页，讲稿共109张，创作于星期三蛋白质蛋白质n n蛋白质是氨基酸以蛋白质是氨基酸以肽键肽键连接在一起连接在一起的线性序列。的线性序列。n n具有游离的具有游离的氨基氨基和游离的和游离的羧基羧基第2页，讲稿共109张，创作于星期三蛋白质通论n n蛋白质的化学组成与分类蛋白质的化学组成与分类n n蛋白质的分子性状与大小蛋白质的分子性状与大小n n蛋白质构象和结构的组织层次蛋白质构象和结构的组织层次n n蛋白质功能的多样性蛋白质功能的多样性第3页，讲稿共109张，创作于星期三第4页，讲稿共109张，创作于星期三凯氏定氮原理凯氏定氮原理n n蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。质含量。第5页，讲稿共109张，创作于星期三第6页，讲稿共109张，创作于星期三第7页，讲稿共109张，创作于星期三蛋白质的分子量蛋白质的分子量n n蛋白质相对分子质量变化极大。蛋白质相对分子质量变化极大。n n单体蛋白质：一条多肽链构成（肌红蛋白和溶菌单体蛋白质：一条多肽链构成（肌红蛋白和溶菌酶）酶）n n寡聚蛋白质或多聚蛋白质：两条或多条多肽链寡聚蛋白质或多聚蛋白质：两条或多条多肽链构成。每条多肽链称为亚基或亚单位，亚基间构成。每条多肽链称为亚基或亚单位，亚基间通过非共价键结合通过非共价键结合第8页，讲稿共109张，创作于星期三蛋白质的构象蛋白质的构象n n蛋白质的三维结构被称为蛋白质的构象蛋白质的三维结构被称为蛋白质的构象n n构型：具有相同结构式的立体异构体中取代基的构型：具有相同结构式的立体异构体中取代基的空间取向，没有共价键的断裂，不同的构型不能空间取向，没有共价键的断裂，不同的构型不能互变。互变。n n构象：具有相同结构式和相同构型的的分子在空构象：具有相同结构式和相同构型的的分子在空间可能的多种形态，构象形态间的变化不涉及共间可能的多种形态，构象形态间的变化不涉及共价键的断裂。价键的断裂。第9页，讲稿共109张，创作于星期三 1952年丹麦人年丹麦人Linderstrom-LangLinderstrom-Lang最早提出蛋白质的结最早提出蛋白质的结构可以分成四个层次构可以分成四个层次:primary structureprimary structure 一级结构：一级结构：一级结构：一级结构：氨基酸序列氨基酸序列secondary structure secondary structure 二二级结构：级结构：螺旋，螺旋，折叠折叠折叠折叠tertiary structuretertiary structure 三三级结构：级结构：级结构：级结构：所有原子空间位置所有原子空间位置所有原子空间位置所有原子空间位置 quanternary structure 四四级结构：级结构：蛋白质多聚体蛋白质多聚体 1969年正式将一级结构定义为氨基酸序列年正式将一级结构定义为氨基酸序列 介介于二级结构和三级结构之间还存在超二级结构（二级于二级结构和三级结构之间还存在超二级结构（二级结构的组合）和结构域（在空间上相对独立）这两个结构的组合）和结构域（在空间上相对独立）这两个层次。层次。蛋白质的结构层次第10页，讲稿共109张，创作于星期三第11页，讲稿共109张，创作于星期三第12页，讲稿共109张，创作于星期三第13页，讲稿共109张，创作于星期三二二 肽肽n n肽和肽键的结构肽和肽键的结构n n肽的理化性质肽的理化性质n n天然存在的活性肽天然存在的活性肽第14页，讲稿共109张，创作于星期三第15页，讲稿共109张，创作于星期三概概 念念n n二肽二肽n n寡肽寡肽n n多肽多肽n n氨基酸残基氨基酸残基n n氨基酸残基与水分子的关系氨基酸残基与水分子的关系第16页，讲稿共109张，创作于星期三n n肽链书写方法肽链书写方法 游离的游离的游离的游离的-氨基在左边，游离的氨基在左边，游离的-羧基在右边，氨基羧基在右边，氨基酸间用酸间用“-”表示肽键表示肽键表示肽键表示肽键 三肽三肽+H H H H3 3 3 3N-N-N-N-丝氨酸丝氨酸-亮氨酸亮氨酸-苯丙氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸-COO-COO-COO-COO-，简写为，简写为Ser-Leu-PheSer-Leu-Phe Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu Leu-Ala-Tyr-Gly-Ser Leu-Ala-Tyr-Gly-Ser Leu-Ala-Tyr-Gly-Ser Leu-Ala-Tyr-Gly-Ser第17页，讲稿共109张，创作于星期三第18页，讲稿共109张，创作于星期三肽基的C、O和N原子间的共振相互作用共振产生的重要结果：共振产生的重要结果：限制绕肽键的自由旋转限制绕肽键的自由旋转 形成酰胺平面形成酰胺平面 产生键的平均化产生键的平均化 肽键呈反式构型肽键呈反式构型sp2sp2sp2sp3共振杂化体共振杂化体第19页，讲稿共109张，创作于星期三第20页，讲稿共109张，创作于星期三第21页，讲稿共109张，创作于星期三肽的理化性质肽的理化性质n n晶体熔点高晶体熔点高n n酸碱性质取决于游离的氨基、游离酸碱性质取决于游离的氨基、游离的羧基以及侧链的羧基以及侧链 R-基上的可解离基上的可解离功能团功能团第22页，讲稿共109张，创作于星期三双缩脲反应双缩脲反应n n肽和蛋白质特有的反应，氨基酸没有。肽和蛋白质特有的反应，氨基酸没有。n n含有一个或两个以上肽键的化合物与硫酸铜碱含有一个或两个以上肽键的化合物与硫酸铜碱性溶液发生双缩脲反应，得到紫红色或蓝紫色性溶液发生双缩脲反应，得到紫红色或蓝紫色复合物复合物第23页，讲稿共109张，创作于星期三n n双缩脲法的原理双缩脲法的原理双缩脲法的原理双缩脲法的原理:双缩脲双缩脲(NH2-CO-NH-CO-NH-CO-NH-CO-NH2)在碱性在碱性在碱性在碱性溶液中可与铜离子产生紫红色的络合物，这一反应称为溶液中可与铜离子产生紫红色的络合物，这一反应称为溶液中可与铜离子产生紫红色的络合物，这一反应称为溶液中可与铜离子产生紫红色的络合物，这一反应称为双缩脲反应。因为蛋白质中有多个肽键，也能与铜离子双缩脲反应。因为蛋白质中有多个肽键，也能与铜离子双缩脲反应。因为蛋白质中有多个肽键，也能与铜离子双缩脲反应。因为蛋白质中有多个肽键，也能与铜离子发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律一定范围内符合比尔定律一定范围内符合比尔定律一定范围内符合比尔定律(光被吸收的量正比于光程中光被吸收的量正比于光程中产生光吸收的分子数目产生光吸收的分子数目)，所以可用双缩脲法测定蛋白，所以可用双缩脲法测定蛋白，所以可用双缩脲法测定蛋白，所以可用双缩脲法测定蛋白质的含量。质的含量。质的含量。质的含量。第24页，讲稿共109张，创作于星期三n n双缩脲反应主要涉及肽键，因此受蛋白质特异双缩脲反应主要涉及肽键，因此受蛋白质特异性影响较小。试剂价廉易得，操作简便，可测性影响较小。试剂价廉易得，操作简便，可测定的范围为定的范围为110mg蛋白质，适于精度要求不太蛋白质，适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定，能测出的蛋白质含量须高的蛋白质含量的测定，能测出的蛋白质含量须在约在约0.5mg以上。双缩脲法的缺点是灵敏度差、以上。双缩脲法的缺点是灵敏度差、所需样品量大。所需样品量大。第25页，讲稿共109张，创作于星期三天然存在的活性肽（天然存在的活性肽（active peptide）n n具有特殊的生物学功能（多种人体代谢和生理具有特殊的生物学功能（多种人体代谢和生理调节功能），易消化吸收，有促进免疫、激素调节功能），易消化吸收，有促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等作用，调节、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等作用，食用安全性极高，是当前国际食品界最热门的食用安全性极高，是当前国际食品界最热门的研究课题和极具发展前景的功能因子。研究课题和极具发展前景的功能因子。第26页，讲稿共109张，创作于星期三大豆肽大豆肽n n大豆肽是大豆蛋白质经酸法或酶法水解后分离、精制而得到的多肽大豆肽是大豆蛋白质经酸法或酶法水解后分离、精制而得到的多肽大豆肽是大豆蛋白质经酸法或酶法水解后分离、精制而得到的多肽大豆肽是大豆蛋白质经酸法或酶法水解后分离、精制而得到的多肽混合物，以混合物，以混合物，以混合物，以3 36 6个氨基酸组成的小分子肽为主，还含有少量大分子个氨基酸组成的小分子肽为主，还含有少量大分子个氨基酸组成的小分子肽为主，还含有少量大分子个氨基酸组成的小分子肽为主，还含有少量大分子肽、游离氨基酸、糖类和无机盐等成分肽、游离氨基酸、糖类和无机盐等成分肽、游离氨基酸、糖类和无机盐等成分肽、游离氨基酸、糖类和无机盐等成分n n大豆肽的蛋白质含量为大豆肽的蛋白质含量为大豆肽的蛋白质含量为大豆肽的蛋白质含量为8585左右，其氨基酸组成与大豆蛋白质相同，左右，其氨基酸组成与大豆蛋白质相同，左右，其氨基酸组成与大豆蛋白质相同，左右，其氨基酸组成与大豆蛋白质相同，必需氨基酸的平衡良好，含量丰富。与大豆蛋白相比，具有消化吸收率必需氨基酸的平衡良好，含量丰富。与大豆蛋白相比，具有消化吸收率必需氨基酸的平衡良好，含量丰富。与大豆蛋白相比，具有消化吸收率必需氨基酸的平衡良好，含量丰富。与大豆蛋白相比，具有消化吸收率高、提供能量迅速、降低胆固醇、降血压和促进脂肪代谢的生理功能以高、提供能量迅速、降低胆固醇、降血压和促进脂肪代谢的生理功能以高、提供能量迅速、降低胆固醇、降血压和促进脂肪代谢的生理功能以高、提供能量迅速、降低胆固醇、降血压和促进脂肪代谢的生理功能以及无豆腥味、无蛋白变性、酸性不沉淀、加热不凝固、易溶于水、流动及无豆腥味、无蛋白变性、酸性不沉淀、加热不凝固、易溶于水、流动及无豆腥味、无蛋白变性、酸性不沉淀、加热不凝固、易溶于水、流动及无豆腥味、无蛋白变性、酸性不沉淀、加热不凝固、易溶于水、流动性好等良好的加工性能，是优良的保健食品素材。性好等良好的加工性能，是优良的保健食品素材。性好等良好的加工性能，是优良的保健食品素材。性好等良好的加工性能，是优良的保健食品素材。第27页，讲稿共109张，创作于星期三乳铁素乳铁素B(牛乳铁蛋白活性肽牛乳铁蛋白活性肽)n n牛乳铁蛋白经胃蛋白酶酶解后得到的牛乳铁蛋白经胃蛋白酶酶解后得到的最重要的抗菌肽，具有较强抗菌活性最重要的抗菌肽，具有较强抗菌活性.研究表明，乳铁素研究表明，乳铁素研究表明，乳铁素研究表明，乳铁素B对大肠杆菌的最小对大肠杆菌的最小抑菌质量浓度为抑菌质量浓度为0.5 mg/mL0.5 mg/mL，对金黄，对金黄，对金黄，对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为色葡萄球菌的最小抑菌浓度为色葡萄球菌的最小抑菌浓度为色葡萄球菌的最小抑菌浓度为0.4 mg/mL；第28页，讲稿共109张，创作于星期三n n葡萄糖、葡萄糖、葡萄糖、葡萄糖、蔗糖、蔗糖、蔗糖、蔗糖、麦芽糖、牛血清白蛋白麦芽糖、牛血清白蛋白麦芽糖、牛血清白蛋白麦芽糖、牛血清白蛋白(BSA)、尿素、硫尿素、硫尿素、硫尿素、硫酸铵在酸铵在酸铵在酸铵在010 mg/mL，乳糖、可溶性淀粉在，乳糖、可溶性淀粉在0 04 mg/mL4 mg/mL的质量浓度范围内，对乳铁素的质量浓度范围内，对乳铁素B B的抗菌活性影响不大；的抗菌活性影响不大；的抗菌活性影响不大；的抗菌活性影响不大；n n当当当当NaCl或或KClKCl的浓度为的浓度为的浓度为的浓度为2525100 mmol/L100 mmol/L，MgCl2或或或或CaCl2的浓度为的浓度为1.01.05.0 mmol/L时，乳铁素时，乳铁素时，乳铁素时，乳铁素B B的抗菌活性就会大的抗菌活性就会大的抗菌活性就会大的抗菌活性就会大大降低；随着缓冲盐浓度和有机酸浓度（大降低；随着缓冲盐浓度和有机酸浓度（大降低；随着缓冲盐浓度和有机酸浓度（大降低；随着缓冲盐浓度和有机酸浓度（25100 mmol/L）的增大，乳铁素）的增大，乳铁素B的抗菌活性呈下降趋势，在的抗菌活性呈下降趋势，在的抗菌活性呈下降趋势，在的抗菌活性呈下降趋势，在微碱性环境下乳铁素微碱性环境下乳铁素微碱性环境下乳铁素微碱性环境下乳铁素B B表现出较强的抗菌活力表现出较强的抗菌活力.第29页，讲稿共109张，创作于星期三第30页，讲稿共109张，创作于星期三谷胱甘肽的作用谷胱甘肽的作用n n加强人体免疫系统的免疫活性加强人体免疫系统的免疫活性,n n抗氧化剂和自由基清除剂抗氧化剂和自由基清除剂抗氧化剂和自由基清除剂抗氧化剂和自由基清除剂 机体内新陈代谢产生的许多自由基会损伤细胞膜，机体内新陈代谢产生的许多自由基会损伤细胞膜，侵袭生命大分子，促进机体衰老，并诱发肿瘤或动侵袭生命大分子，促进机体衰老，并诱发肿瘤或动脉粥样硬化的产生脉粥样硬化的产生 n n调节其他抗氧化剂调节其他抗氧化剂，保护身体免受疾病，保护身体免受疾病.n n中和解毒作用。中和解毒作用。GSH能与进入机体的有毒化合物、重金属离子或致能与进入机体的有毒化合物、重金属离子或致癌物质等相结合，并促其排出体外，起到中和解毒癌物质等相结合，并促其排出体外，起到中和解毒作用作用第31页，讲稿共109张，创作于星期三n n谷胱甘肽有还原型（谷胱甘肽有还原型（G-SH）和氧化型（）和氧化型（G-S-S-G）两种形式，在生理条件下以还原型谷胱）两种形式，在生理条件下以还原型谷胱甘肽占绝大多数。谷胱甘肽还原酶催化两型甘肽占绝大多数。谷胱甘肽还原酶催化两型间的互变。该酶的辅酶为磷酸糖旁路代谢提间的互变。该酶的辅酶为磷酸糖旁路代谢提供的供的NADPH。第32页，讲稿共109张，创作于星期三n n由于还原型谷胱甘肽本身易受某由于还原型谷胱甘肽本身易受某些物质氧化，能够保护许多蛋白些物质氧化，能够保护许多蛋白质和酶等分子中的巯基不被如自质和酶等分子中的巯基不被如自由基等有害物质氧化，从而发挥由基等有害物质氧化，从而发挥其生理功能。其生理功能。第33页，讲稿共109张，创作于星期三n n人体红细胞中谷胱甘肽的含量很多，人体红细胞中谷胱甘肽的含量很多，对保护红细胞膜上蛋白质的巯基处于对保护红细胞膜上蛋白质的巯基处于还原状态，防止溶血具有重要意义，还原状态，防止溶血具有重要意义，还可以保护血红蛋白不受过氧化氢、还可以保护血红蛋白不受过氧化氢、自由基等氧化而持续正常在发挥运输自由基等氧化而持续正常在发挥运输氧的能力。氧的能力。第34页，讲稿共109张，创作于星期三n n红细胞中部分血红蛋白在过氧化氢等氧化剂的红细胞中部分血红蛋白在过氧化氢等氧化剂的作用下，其中二价铁氧化为三价铁，使血红蛋作用下，其中二价铁氧化为三价铁，使血红蛋白转变为高铁血红蛋白，从而失去了带氧能力。白转变为高铁血红蛋白，从而失去了带氧能力。还原型谷胱甘肽既能直接与过氧化氢等氧化剂还原型谷胱甘肽既能直接与过氧化氢等氧化剂结合，生成水和氧化型谷胱甘肽，也能够将高结合，生成水和氧化型谷胱甘肽，也能够将高铁血红蛋白还原为血红蛋白。铁血红蛋白还原为血红蛋白。第35页，讲稿共109张，创作于星期三n n人工已研制开发出了谷胱甘肽药物，广泛应人工已研制开发出了谷胱甘肽药物，广泛应用于临床，除利用其巯基以螯合重金属、氟用于临床，除利用其巯基以螯合重金属、氟化物、芥子气等毒素中毒外，还用在肝炎、化物、芥子气等毒素中毒外，还用在肝炎、溶血性疾病以及角膜炎、白内障和视网膜疾溶血性疾病以及角膜炎、白内障和视网膜疾病等，作为辅助治疗的药物病等，作为辅助治疗的药物 第36页，讲稿共109张，创作于星期三第37页，讲稿共109张，创作于星期三历史上第一个被确定历史上第一个被确定氨基酸序列的蛋白质氨基酸序列的蛋白质胰岛素insulin第38页，讲稿共109张，创作于星期三胰岛素的历史胰岛素的历史 第一个生化药物第一个生化药物n n动物胰腺动物胰腺动物胰腺动物胰腺 细胞分泌的一种激素细胞分泌的一种激素,运输糖、运输糖、氨基酸、氨基酸、K+；最小的蛋白质，由最小的蛋白质，由A A链链链链(21(21 AA)AA)和和和和B(30 (30 AA)AA)组成；组成；组成；组成；n n19211921年年年年Banting&Best Banting&Best 从胰腺中抽提出了从胰腺中抽提出了从胰腺中抽提出了从胰腺中抽提出了有活性的胰岛素，有活性的胰岛素，有活性的胰岛素，有活性的胰岛素，19231923年年年年Banting&Macleod获获获获Nobel医学奖；医学奖；n n194319435353年，年，年，年，Sanger确定了牛胰岛素的一确定了牛胰岛素的一级结构，级结构，1958年获得年获得NobelNobel化学奖；化学奖；n n19811981年，年，年，年，BergBerg（因因因因DNADNA重组技术得奖）在重组技术得奖）在大肠杆菌中表达了人胰岛素大肠杆菌中表达了人胰岛素.第39页，讲稿共109张，创作于星期三一级结构测定对样品的要求一级结构测定对样品的要求n n均一，纯度均一，纯度97%以上以上n n相对分子量已知相对分子量已知第40页，讲稿共109张，创作于星期三蛋白质一级结构测定的步骤蛋白质一级结构测定的步骤1、蛋白质的分离纯化、蛋白质的分离纯化 2、测定蛋白质分子中多肽链的数目测定蛋白质分子中多肽链的数目3、亚基分离亚基分离4、二硫键的拆分与保护二硫键的拆分与保护5、分析每一多肽链的氨基酸组成分析每一多肽链的氨基酸组成6、鉴定鉴定多肽链的多肽链的N-末端和末端和C-末端残基末端残基7、多种方法的部分水解多种方法的部分水解8、测序测序 9、重叠重叠 10、二硫键位置的确定二硫键位置的确定一级结构测定策略蛋白质一级结构测定步骤第41页，讲稿共109张，创作于星期三1.蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化n n（1 1）根据）根据）根据）根据溶解度溶解度溶解度溶解度不同的方法不同的方法不同的方法不同的方法 盐析、等电点沉淀法、低温有机溶剂沉淀法盐析、等电点沉淀法、低温有机溶剂沉淀法盐析、等电点沉淀法、低温有机溶剂沉淀法盐析、等电点沉淀法、低温有机溶剂沉淀法n n（2 2）根据）根据）根据）根据蛋白质分子大小蛋白质分子大小蛋白质分子大小蛋白质分子大小不同的方法不同的方法 透析与超滤透析与超滤透析与超滤透析与超滤、凝胶过滤法凝胶过滤法凝胶过滤法凝胶过滤法n n（3 3）根据）根据）根据）根据蛋白质带电性质蛋白质带电性质进行分离的方法进行分离的方法 电泳、离子交换层析电泳、离子交换层析n n（4 4）根据）根据配体特异性配体特异性配体特异性配体特异性的分离方法亲和色谱法的分离方法亲和色谱法的分离方法亲和色谱法的分离方法亲和色谱法 第42页，讲稿共109张，创作于星期三透析只用于除盐类和小分子杂质第43页，讲稿共109张，创作于星期三第44页，讲稿共109张，创作于星期三超过滤超过滤除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质加压加压蛋白质溶液半透膜支持膜的栅板超滤液第45页，讲稿共109张，创作于星期三凝凝胶胶层层析析第46页，讲稿共109张，创作于星期三第47页，讲稿共109张，创作于星期三n n亲和层析法亲和层析法亲和层析法亲和层析法（afinity chromatography）是分离蛋白质）是分离蛋白质）是分离蛋白质）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，只需经过一步处理即可使某的一种极为有效的方法，只需经过一步处理即可使某的一种极为有效的方法，只需经过一步处理即可使某的一种极为有效的方法，只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。来，而且纯度很高。来，而且纯度很高。来，而且纯度很高。n n根据某些根据某些蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质与另一种称为与另一种称为配体配体配体配体(Ligand）的分子）的分子）的分子）的分子能特异而非共价地结合。能特异而非共价地结合。能特异而非共价地结合。能特异而非共价地结合。第48页，讲稿共109张，创作于星期三n n基本原理：基本原理：蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离（白质的分离（白质的分离（白质的分离（Separation），提纯（），提纯（Purification）和鉴）和鉴定（定（CharacterizationCharacterization）是生物化学中的重要的一部分，）是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往往采取白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。几种方法联合使用。第49页，讲稿共109张，创作于星期三2、测定蛋白质分子中多肽链的数目测定蛋白质分子中多肽链的数目 通过测定末端氨基酸残基的通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的的关系，即可确定多肽链的数目数目。第50页，讲稿共109张，创作于星期三多肽链的拆分多肽链的拆分 由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L8mol/L尿素或尿素或6mol/Lmol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基亚基).第51页，讲稿共109张，创作于星期三4、二硫键的拆分与保护二硫键的拆分与保护 几条多肽链通过二硫键交联在一起。可用几条多肽链通过二硫键交联在一起。可用几条多肽链通过二硫键交联在一起。可用几条多肽链通过二硫键交联在一起。可用8mol/L8mol/L尿素或尿素或尿素或尿素或6 6 6 6mol/Lmol/Lmol/Lmol/L盐酸胍存在下，盐酸胍存在下，用过量的用过量的用过量的用过量的-巯基乙醇巯基乙醇巯基乙醇巯基乙醇处理，使二硫处理，使二硫键还原为巯基，然后用键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护烷基化试剂保护生成的巯基，防生成的巯基，防止重新被氧化。止重新被氧化。通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力；应用价力；应用价力；应用价力；应用过甲酸氧化法或巯基还原过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫法拆分多肽链间的二硫法拆分多肽链间的二硫法拆分多肽链间的二硫键。键。键。键。第52页，讲稿共109张，创作于星期三 巯基的保护巯基的保护测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比；测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比；分析多肽链的分析多肽链的N-N-末端和末端和C-C-末端末端 末端氨基酸的测定：末端氨基酸的测定：多肽链端基氨基酸分为两类，N-端氨基酸和C-端氨基酸。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。末端氨基酸测定的主要方法有：第53页，讲稿共109张，创作于星期三5、分析每一多肽链的氨基酸组成分析每一多肽链的氨基酸组成第54页，讲稿共109张，创作于星期三N端的测定方法端的测定方法1、Sanger（二硝基氟苯）二硝基氟苯）法法2、丹磺酰氯丹磺酰氯法法3、Edman法法4、酶降解法、酶降解法第55页，讲稿共109张，创作于星期三氨基酸与氨基酸与2,42,4一二硝基氟苯一二硝基氟苯(DNFB)DNFB)的反应的反应（sangersangersangersanger反应）反应）DNFB（dinitrofiuorobenzene）DNP-AA(黄色黄色)+HF弱碱中弱碱中氨基酸氨基酸第56页，讲稿共109张，创作于星期三Sanger试剂(FDNB)标记N末端Sanger试剂标记反应第57页，讲稿共109张，创作于星期三H2NCHCOOH+RNCH3CH3O=S=OCl5-二甲氨基萘磺酰氯二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）pH9.7 40NCH3CH3O=S=OHNCHCOOH RDNS-氨氨基酸基酸取代取代DNFB测定蛋白质测定蛋白质N端氨基酸，灵敏度高端氨基酸，灵敏度高酰化反应酰化反应第58页，讲稿共109张，创作于星期三氨基酸与苯异硫氰酯（氨基酸与苯异硫氰酯（PITCPITC）的反应的反应（EdmanEdman反应）反应）PITC（phenylisothiocyanate）+苯乙内酰硫脲衍生物苯乙内酰硫脲衍生物(PTH-AA)（phenylisothiohydantion-AA）弱硷中弱硷中(400 C)(硝基甲烷硝基甲烷 400 C)H+第59页，讲稿共109张，创作于星期三Edman 降解法降解法(I)DABITC:DABITC:有色有色EdmanEdman试剂试剂在在EdmanEdman试剂上加发色基团试剂上加发色基团Edman降解法1第60页，讲稿共109张，创作于星期三Edman 降解法(II)Edman降解法2第61页，讲稿共109张，创作于星期三无冕英雄Pehr Victor Edman n n瑞典人瑞典人瑞典人瑞典人,1916.4.14-1977.3.19,1916.4.14-1977.3.19n n1946-471946-47年在美国留学时想到改进年在美国留学时想到改进年在美国留学时想到改进年在美国留学时想到改进19301930 年年年年Abderhalden&BrockmannAbderhalden&Brockmann发明的发明的发明的发明的 PITCPITC试剂的反应试剂的反应试剂的反应试剂的反应,50,50年发明年发明年发明年发明Edman Edman degradation degradation反应反应反应反应.Acta Chem Scand 4:283(1950)Acta Chem Scand 4:283(1950)1957 1957年移居墨尔本年移居墨尔本年移居墨尔本年移居墨尔本,远离国际学术中心开始远离国际学术中心开始远离国际学术中心开始远离国际学术中心开始 过隐居生活过隐居生活过隐居生活过隐居生活,1967,1967年研制的自动化仪器可以达到每小时一个年研制的自动化仪器可以达到每小时一个年研制的自动化仪器可以达到每小时一个年研制的自动化仪器可以达到每小时一个氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸的速度的速度的速度的速度;他坚持不申请专利他坚持不申请专利他坚持不申请专利他坚持不申请专利,给了美国公司得以随便开发仪器的方给了美国公司得以随便开发仪器的方给了美国公司得以随便开发仪器的方给了美国公司得以随便开发仪器的方便便便便.1972.1972年到德国年到德国年到德国年到德国,77,77年因脑瘤过世年因脑瘤过世年因脑瘤过世年因脑瘤过世.第62页，讲稿共109张，创作于星期三n n由于由于Edman降解产物需要在降解产物需要在紫外域紫外域进行检进行检测测,只有只有HPLC和相应的紫外检测手段进步和相应的紫外检测手段进步后才得到普及后才得到普及;60年代后期年代后期Moore&Stein利用该反应测定了利用该反应测定了RNase的一级结构的一级结构,遗憾的是遗憾的是Edman没有和他们分享没有和他们分享Nobel化化学奖学奖.第63页，讲稿共109张，创作于星期三1、肼法肼法2、还原还原法法3、酶降解法、酶降解法 C端的测定方法端的测定方法第64页，讲稿共109张，创作于星期三蛋白质与无水肼加热蛋白质与无水肼加热 -NH-CH-CONH-CH-COOH|Rx Rx Ry -+-+NH-CH-CONH-NH2 +NH2-CH-COOHNH2-CH-COOH|Rx Rx Ry肼肼(hydrazine)法测定法测定NHNH2 2NHNH2 2，100100，5 510h10h溶于有机溶剂而被除去溶于有机溶剂而被除去多种方法确定多种方法确定肼法C端测定第65页，讲稿共109张，创作于星期三还原法还原法n n碳末端氨基酸通过硼氢化锂还原碳末端氨基酸通过硼氢化锂还原为氨基醇，水解后氨基醇可以进为氨基醇，水解后氨基醇可以进行鉴别行鉴别第66页，讲稿共109张，创作于星期三羧肽酶法：羧肽酶法：羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的肽链的C-C-端逐个的水解。端逐个的水解。根据根据不同不同的反应时间测出酶水解所释放出的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的蛋白质的C-C-末端残基顺序。末端残基顺序。第67页，讲稿共109张，创作于星期三常用的羧肽酶常用的羧肽酶n n羧肽酶羧肽酶 A A：释放除了：释放除了ProPro、Arg、Lys之外之外的所有的所有C-C-末端残基末端残基n n羧肽酶羧肽酶羧肽酶羧肽酶B：仅能水解：仅能水解：仅能水解：仅能水解 Arg、Lys为为C-末端的末端的末端的末端的氨基酸残基氨基酸残基氨基酸残基氨基酸残基n n二者混用二者混用二者混用二者混用n n羧肽酶羧肽酶Y Y：作用于任何一个：作用于任何一个C-C-末端残基末端残基第68页，讲稿共109张，创作于星期三二硫桥的断裂二硫桥的断裂n n过甲酸氧化法过甲酸氧化法n n巯基化合物还原法巯基化合物还原法n n注意注意 1 暴露二硫键暴露二硫键 2 保护巯基保护巯基第69页，讲稿共109张，创作于星期三使用的还原剂有使用的还原剂有 巯基乙醇、巯基乙酸、二硫苏糖醇（巯基乙醇、巯基乙酸、二硫苏糖醇（DTT）-巯基乙醇巯基乙醇H0CH2CH2SH巯基保护剂：碘乙酰胺、碘乙酸、巯基保护剂：碘乙酰胺、碘乙酸、3溴丙胺等。溴丙胺等。第70页，讲稿共109张，创作于星期三氨基酸组成的分析氨基酸组成的分析n n方法：酸水解，辅以碱水解方法：酸水解，辅以碱水解n n表达方法表达方法 每摩尔蛋白质中含有的氨基酸残基的摩尔数每摩尔蛋白质中含有的氨基酸残基的摩尔数 100克蛋白质中含有的氨基酸的克数。克蛋白质中含有的氨基酸的克数。第71页，讲稿共109张，创作于星期三 利用外切蛋白水解酶利用外切蛋白水解酶 (exo-peptidase)将将肽链的氨基酸从肽链的氨基酸从N端端 (aminopeptidase)或或C端端(carboxypeptidase)一个接一个游离出来，一个接一个游离出来，在不同时间取样进行分析，根据所游离的在不同时间取样进行分析，根据所游离的氨基酸判断氨基酸的排列顺序氨基酸判断氨基酸的排列顺序。酶解法末端测序酶解法末端测序第72页，讲稿共109张，创作于星期三常常用用的的酶酶n n胰蛋白酶胰蛋白酶n n胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）n n嗜热菌蛋白酶嗜热菌蛋白酶n n胃蛋白酶胃蛋白酶第73页，讲稿共109张，创作于星期三胰蛋白酶胰蛋白酶n n肽链内切酶，它能把多肽链中肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸赖氨酸和精氨酸残基残基中的羧基侧切断，是特异性最强的蛋白酶，中的羧基侧切断，是特异性最强的蛋白酶，在测定蛋白质的氨基酸排列中，是不可缺少的工在测定蛋白质的氨基酸排列中，是不可缺少的工具。牛的胰蛋白酶氨基酸残基具。牛的胰蛋白酶氨基酸残基223个，分子量为个，分子量为23300，活性部位的，活性部位的丝氨酸残基丝氨酸残基是不可缺少的是不可缺少的丝氨酸蛋白酶。丝氨酸蛋白酶。第74页，讲稿共109张，创作于星期三胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）n n属于肽链内切酶，主要切断多肽链中属于肽链内切酶，主要切断多肽链中的的芳香族氨基酸残基芳香族氨基酸残基的羧基一侧的羧基一侧n n断裂点邻近的基团为碱性断裂点邻近的基团为碱性，断裂能力，断裂能力增强；酸性断裂能力减弱增强；酸性断裂能力减弱第75页，讲稿共109张，创作于星期三胃蛋白酶胃蛋白酶n n胃蛋白酶在对蛋白或多肽进行剪切时，具有一定的胃蛋白酶在对蛋白或多肽进行剪切时，具有一定的氨基酸序列特异性。断裂点两侧的残基都是氨基酸序列特异性。断裂点两侧的残基都是疏水性疏水性氨基酸氨基酸n n胃蛋白酶在酸性环境中具有较高活性，其最适胃蛋白酶在酸性环境中具有较高活性，其最适pHpH值值值值约为约为约为约为3。在中性或碱性。在中性或碱性pH值的溶液中，胃蛋白酶会值的溶液中，胃蛋白酶会发生解链而丧失活性。发生解链而丧失活性。常用来确定二硫键的位置常用来确定二硫键的位置第76页，讲稿共109张，创作于星期三肽键的专一性水解(化学法)化学法化学法:CNBr,H+,NH2 2OH,etc化学法专一性水解第77页，讲稿共109张，创作于星期三 溴化氰水解法溴化氰水解法(CNBr):(CNBr):切割切割MetMet的羧基所形的羧基所形成的肽键。成的肽键。用羟胺断裂用羟胺断裂:它断裂它断裂Asn-Gly-,Asn-Gly-,但专一性不高。但专一性不高。蛋白质中出现机率低，适于分子量大的蛋白蛋白质中出现机率低，适于分子量大的蛋白质序列的测定。质序列的测定。第78页，讲稿共109张，创作于星期三消化道内几种蛋白酶的专一性（Phe.Tyr.Trp）（Arg.Lys）（脂肪族）（脂肪族）胰凝乳蛋胰凝乳蛋白酶白酶胃蛋白酶胃蛋白酶弹性蛋白酶弹性蛋白酶羧肽酶羧肽酶胰蛋白酶胰蛋白酶氨肽酶氨肽酶羧肽酶羧肽酶（Phe.Trp）第79页，讲稿共109张，创作于星期三氨基酸的鉴定、分离纯化PTH-AA氨基酸的确定第80页，讲稿共109张，创作于星期三肽段在多肽链中次序的决定肽段在多肽链中次序的决定n n资料：资料：N-末端残基末端残基H,C-末端残基末端残基S;n n第一套肽段第一套肽段 第二套肽段第二套肽段n nOUS SEOn nPS WTOUn nEOVE VERLn nRLA APS n nHOWT HO第81页，讲稿共109张，创作于星期三n n借助重叠肽确定肽段次序：借助重叠肽确定肽段次序：n n末端残基末端残基 H Sn n末端肽段末端肽段HOWT APS 或或 n n OUS n n第一套肽段：第一套肽段：HOWT OUS EOVE RLA PSn n第二套肽段：第二套肽段：HO WTOU SEO VERL APSn n推断全序列推断全序列:HOWTOUSEOVERLAPS第82页，讲稿共109张，创作于星期三第83页，讲稿共109张，创作于星期三二硫键的断裂：二硫键的断裂：几条多肽链通过二硫键交联在一几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在可用起。可在可用8 8mol/Lmol/Lmol/Lmol/L尿素或尿素或6 6mol/Lmol/L盐酸胍存在下，盐