蛋白质工程 (2)精选PPT.ppt

关于蛋白质工程(2)第1页，讲稿共134张，创作于星期三第一讲第一讲 蛋白质工程概况蛋白质工程概况 一、蛋白质工程的含义1983年由Ulmer首先提出“蛋白质工程”的概念，是生物工程的重要组成部分。蛋白质工程：以蛋白质分子的结构功能的关系研究为基础，利用基因工程技术，按照人类自身的需要，定向改造天然蛋白质，甚至创造新的、自然界本不存在的、具有优良特性的蛋白质分子的现代生物技术。即：按照特定的需要，对蛋白质进行分子设计和改造，并表达出具有不同功能的蛋白质。第2页，讲稿共134张，创作于星期三通过改造与蛋白质相应的基因中的碱基顺序，或设计合成新的基因，将它克隆至受体细胞中，通过基因表达获得具有新的特性的蛋白质技术。这是一门从改变基因入手，定做新蛋白质的技术，是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程。通过蛋白质化学、蛋白质晶体学和动力学的研究，获取有关蛋白质理化、结构、功能等各方面的信息，在此基础上利用生物技术手段对蛋白质的DNA编码序列进行有目的设计改造，获取自然界没有的、具有优良性质或适用于工业生产条件的全新蛋白质的过程，是包含多学科的综合科技工程。第3页，讲稿共134张，创作于星期三目标：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行分子设计与改造，定向改造或制造蛋白质。特征：在基因水平上特异地做一个非天然的优良工程蛋白。实质：对编码蛋白质的基因进行改造。前提：了解蛋白质的结构、功能及理化性质等原理：基因修饰或基因合成第4页，讲稿共134张，创作于星期三设计理念分子定向进化分子理性设计以蛋白质的性质、结构和功能的信息及其相互关系为基础，包括活性设计、专一性设计、构象设计等以体外模拟自然进化为基础，基因修饰和改造实施的必要条件筛选系统（灵敏、准确、高通量）随机突变库的构建（快速、简便、高效）第5页，讲稿共134张，创作于星期三根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质；质；从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计合成具有特定生物功能的全新蛋白质。合成具有特定生物功能的全新蛋白质。确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系（核心）；（核心）；二、蛋白质工程的主要研究内容第6页，讲稿共134张，创作于星期三蛋白质工程研究的4大主要类型利用已知蛋白质的一级结构信息开展应用研发；定量确定蛋白质结构-功能关系：这是目前蛋白质工程研究的主体，包括蛋白质三维结构模型的建立，酶催化的性质、蛋白质折叠和稳定性研究等；从混杂变异体库中筛选具有特定结构-功能关系的蛋白质；根据已知结构-功能关系的蛋白质，用人工方法合成它及其变异体。第7页，讲稿共134张，创作于星期三三、蛋白质工程的原理中心法则第8页，讲稿共134张，创作于星期三基因DNA多肽链三维结构的蛋白质生物功能mRNA转录翻译折叠蛋白质工程的理论依据：基因指导蛋白质的合成。基因DNA推测多肽链的氨基酸序列设计预期蛋白质的三维结构预期蛋白质的功能分子设计DNA合成蛋白质工程：反向生物学第9页，讲稿共134张，创作于星期三蛋白质工程设计原理蛋白质工程设计（蛋白质分子设计）：在知道需要改造的蛋白质的结构和功能的基础上，通过理论的方法，提出蛋白质改造的设计方案。为蛋白质工程提供指导性信息，也为探索蛋白质的折叠机制提供重要方法。基因水平的改造：改造蛋白质的编码基因蛋白质水平的改造：蛋白质的加工与修饰分子设计的层次第10页，讲稿共134张，创作于星期三第11页，讲稿共134张，创作于星期三四、蛋白质工程的程序与操作方法四、蛋白质工程的程序与操作方法蛋白质工程的程序从生物体中分离纯化目的蛋白；测定其氨基酸序列；借助核磁共振和X射线晶体衍射等手段，尽可能多地了解其空间结构信息；对目的蛋白的功能作详尽的研究，确定它的功能域*；通过分析蛋白质的一级结构、空间结构和功能之间相互关系，找出关键的基团和结构*；第12页，讲稿共134张，创作于星期三围绕这些关键的基团和结构提出对蛋白质进行改造的方案，并用基因工程的方法去实施；对经过改造的蛋白质进行功能性测定，看看改造的效果如何；重复上述带*的两步，直到获得比较理想的结果；分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用。第13页，讲稿共134张，创作于星期三纯蛋白质基因文库空间结构模型蛋白质与功能研究合成的寡核苷酸计算机辅助设计分子性质预测及分子定向改造方案测试分子性质纯化的突变体蛋白质表达载体DNA序列突变体克隆化基因蛋白质工程的程序第14页，讲稿共134张，创作于星期三蛋白质工程的操作方法合理化的分子设计基因的定向突变和定向进化突变体的大规模筛选突变体的表达及其分析检测第15页，讲稿共134张，创作于星期三通过改变蛋白质的活性部位，提高其生物功效；通过改变蛋白质的组成和空间结构，提高其在特定(极端)条件下的稳定性；通过改变蛋白质的遗传信息，提高其独立工作能力，不再需要辅助因子；通过改变蛋白质的特性，使其便于分离纯化；通过改变蛋白质的调控位点，使其与抑制剂脱离，解除反馈抑制作用；.五、蛋白质工程的技术策略五、蛋白质工程的技术策略第16页，讲稿共134张，创作于星期三六、蛋白质工程的诞生与发展六、蛋白质工程的诞生与发展蛋白质工程是20世纪80年代初诞生的一个新兴生物技术领域。1983年，Ulmer在“Science”上发表以“ProteinEngineering”(蛋白质工程)为题的专论，一般将此视为蛋白质工程诞生的标志。1984年，Perry通过将溶菌酶中Ile(3)改成Cys(3)，并进一步氧化生成Cys(3)-Cys（97）二硫键，使酶热稳定性提高，显著改进了这种食品工业用酶的应用价值。第17页，讲稿共134张，创作于星期三1987年，福什特通过将枯草杆菌蛋白酶分子表面的Asp99和Glu156改成Lys，而导致了活性中心His64质子pKa从7下降到6，使酶在pH6时的活力提高10倍。1988年杜邦公司宣布，成功设计并合成了由四段反平行-螺旋组成含73个氨基酸残基的成果。这显示，按人们预期要求，通过从头设计以折叠成新蛋白的目标已是可望又可及了。由此蛋白质工程开创了按照人类意愿改造、创造符合人类需要的蛋白质的新时期。第18页，讲稿共134张，创作于星期三第二讲第二讲 蛋白质的结构基础蛋白质的结构基础 蛋白质是由许多氨基酸单位通过肽键连接起来的、具有特定分子结构的高分子化合物。蛋白质分子的生物功能，与蛋白质分子的结构密不可分。蛋白质分子的构象是其功能活性的基础，是决定这种特殊生物功能的关键因素。蛋白质的分子结构可人为划分为一、二、三、四级结构。除一级结构外，蛋白质的二、三、四级结构均属于空间结构。一、蛋白质的结构层次第19页，讲稿共134张，创作于星期三第20页，讲稿共134张，创作于星期三蛋白质的结构层次蛋白质的结构层次四级结构三级结构结构域超二级结构二级结构一级结构第21页，讲稿共134张，创作于星期三核糖核酸酶：124aa，分子内含有4个二硫键第22页，讲稿共134张，创作于星期三蛋白质的一级结构（氨基酸序列）决定它的高级结构，是阐明蛋白质生物功能的分子基础。IAYKPAG IAYKPAG。氨基酸序列（一级结构）高级结构 生物功能 第23页，讲稿共134张，创作于星期三二级结构：蛋白质主链折叠产生的有规则构象，主要有-螺旋、-折叠片、-转角和无规卷曲等。结构复杂的蛋白质分子就由这些比较简单的二级结构元件进一步组合而成。第24页，讲稿共134张，创作于星期三超二级结构（super-secondarystruture，结构模体struturemotif）：相邻的二级结构元件组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的在空间上能辨认的二级结构组合或二级结构串，其充当三级结构的构件。常见的常见的超二级结构超二级结构（复绕（复绕-螺旋）螺旋）（曲折和希腊钥匙拓扑结构）曲折和希腊钥匙拓扑结构）-折叠桶折叠桶-螺旋螺旋-转角转角-螺旋螺旋第25页，讲稿共134张，创作于星期三第26页，讲稿共134张，创作于星期三结构域（domain）：多肽链在二级结构及超二级结构的基础上，进一步卷曲折叠成的相对独立的紧密球状结构，即它们按一定的拓扑学规则构成的三维空间结构实体。通常是几个(超)二级结构的组合；结构域自身是紧密装配的，但结构域与结构域之间关系松懈；对于较小的蛋白质分子，结构域与三级结构等同，即这些蛋白为单结构域蛋白；较大的蛋白质分子或亚基往往由两个以上结构域缔合而成三级结构；结构域是球状蛋白质的折叠单位。第27页，讲稿共134张，创作于星期三第28页，讲稿共134张，创作于星期三结构域与功能域的关系：结构域与功能域的关系：有时一个结构域就是蛋白质的功能有时一个结构域就是蛋白质的功能域，但不总是；功能域通常由多个结构域组成；域，但不总是；功能域通常由多个结构域组成；作为酶活作为酶活性部位的功能域常由多个结构域的相邻部分组成，结构域性部位的功能域常由多个结构域的相邻部分组成，结构域的剩余部分不参与组成活性部位。的剩余部分不参与组成活性部位。结构域结构域的类型的类型反平行反平行 螺旋结构域螺旋结构域混合型混合型折叠结构域（折叠结构域（结构域）结构域）反反平行平行 折叠片结构域折叠片结构域富含金属或二硫键结构域富含金属或二硫键结构域第29页，讲稿共134张，创作于星期三蛋白质的三级结构：蛋白质分子在二级结构或超二级结构基础上进一步盘曲折叠而形成的整体构象，即一条多肽链全部原子在三维空间的排布位置。溶菌酶分子的三级结构溶菌酶分子的三级结构三级结构是蛋白质发挥生物活性所必须的；球状蛋白的三级结构很密实，大部分的水分子从球状蛋白的核心中被排出，这使得极性基团间以及非极性基团间的相互作用成为可能。第30页，讲稿共134张，创作于星期三蛋白质的四级结构：专指亚基的种类、数量以及各个亚基在寡聚蛋白质中的空间排布和亚基间的相互作用。血红蛋白的四级结构由两个由两个亚基和两个亚基和两个亚基构成一个四面亚基构成一个四面体构型，每个亚基分体构型，每个亚基分别别含含1 1个血红素辅基个血红素辅基。亚基单独存在时无生物活性或活性很低，只有相互聚合成特定构象时才具有完整的生物活性；一级结构规定了亚基间的结合方式，四级结构的形成遵从“自我装配”的原则。第31页，讲稿共134张，创作于星期三二、蛋白质结构分类复杂性和多样性是蛋白质结构的重要特征，（超）二级结构的组合构成了大多数结构域结构的核心。在结构域中，结构模体的组织方式是有限的，而且一些组合具有明显的优势，常常出现在功能和序列都不相同的蛋白质中，使蛋白质的结构域表现出一些主要的类型。第32页，讲稿共134张，创作于星期三分类M.Levitt和C.Chothia的分类法：认为二级结构的组合构成了大多数结构域结构的核心，在结构域水平上，蛋白质的结构分为：型结构、型结构、/型结构、+型结构、无规型富含二硫键和金属离子型。第33页，讲稿共134张，创作于星期三20世纪70年代，建立了蛋白质结构数据库（ProteinDataBank，PDB），PDB数据库最初由美国Brookhaven国家实验室负责维护和管理，为适应结构基因组和生物信息学研究的需要，1998年，由美国国家科学基金委员会、能源部和卫生研究院资助，成立了结构生物学合作研究协会(ResearchCollaboratoryforStructuralBioinformatics，RCSB)，并由RCSB对PDB进行维护和管理。系统性分类第34页，讲稿共134张，创作于星期三蛋白质结构分类是蛋白质结构研究的一个重要方向，包括如折叠类型、拓扑结构、家族、超家族、结构域、二级结构、超二级结构等不同层次。蛋白质结构分类数据库是三维结构数据库（PDB）的重要组成部分。蛋白质结构分类数据库SCOP（StructuralClassificationOfProteins）：由英国医学研究委员会（MedicalResearchCouncil，MRC）的分子生物学实验室和蛋白质工程研究中心开发和维护。该数据库对已知三维结构的蛋白质进行分类，并描述了它们之间的结构和进化关系。第35页，讲稿共134张，创作于星期三SCOP数据库从不同层次对蛋白质结构进行分类，以反映它们结构和进化的相关性。通常将蛋白质分成家族，超家族和折叠类型等许多层次，但不同层次之间的界限并不十分严格，通常层次越高，越能清晰地反映结构的相似性。家族：为SCOP数据库的第一个分类层次，依据的是序列相似性程度。通常将相似性程度在30%以上的蛋白质归入同一家族，即它们之间有比较明确的进化关系。当然这一指标也并非绝对，某些情况下，尽管序列的相似性低于这一标准，也可以从结构和功能相似性推断它们来自共同祖先（如：某些球蛋白家族的序列相似性只有15%）。第36页，讲稿共134张，创作于星期三超家族：如果序列相似性较低，但其结构和功能特性表明它们有共同的进化起源，则将其视作超家族。折叠类型：无论有无共同的进化起源，只要二级结构单元具有相同的排列和拓扑结构，即认为这些蛋白质具有相同的折叠方式。在这些情况下，结构的相似性主要依赖于二级结构单元的排列方式或拓扑结构。第37页，讲稿共134张，创作于星期三CATH蛋白质结构分类数据库：它由英国伦敦大学UCL开发和维护，其含义为类型（Class）、构架（Architecture）、拓扑结构（Topology）和同源性（Homology）。CATH数据库的分类基础是蛋白质结构域。第一个层次为二级结构的类型：蛋白质分为主类、主类，-类（/型和+型）和低二级结构类（二级结构成分含量很低的蛋白质分子）4类。第38页，讲稿共134张，创作于星期三第二个层次为超二级结构的排列方式：不考虑它们之间的连接关系，形象地说来就是蛋白质分子的构架，如同建筑物的立柱、横梁等主要部件。第三个层次为拓扑结构：二级结构的形状和二级结构间的联系。第四个层次为结构的同源性：先通过序列比较后再用结构比较来确定。最后一个层次为序列的同源性：在这一层次上，只要结构域中的序列同源性大于35%，就被认为具有高度的结构和功能的相似性。对于较大的结构域，则至少要有60%与小的结构域相同。第39页，讲稿共134张，创作于星期三型结构域结构：主要由-螺旋所构成，例如血红蛋白的结构等。在已知的蛋白质结构中，四螺旋束和球状折叠是最常见的两种螺旋排列方式。细胞色素c血红蛋白三、主要蛋白质结构第40页，讲稿共134张，创作于星期三型结构域结构：从功能角度看，具有型结构域结构的蛋白质是较为分散的，包括了酶、输运蛋白、抗体和病毒外壳蛋白等。这类结构域的内核由四到十几个-链所构成，这些-链主要以反平行的方式排列，并形成两个交联在一起并互相堆积的-回折。第41页，讲稿共134张，创作于星期三丙糖磷酸异构酶-型结构域结构：含有一个由-螺旋包围着的平行或混合-回折的核。所有的糖酵解酶都属于此类结构，许多其他的酶以及结合运输蛋白属于这类结构。上列三类结构所占的比例分别是20(型)、32(型)、35(-型)，这三类结构包含了已知蛋白质的绝大部分。第42页，讲稿共134张，创作于星期三第三讲第三讲 蛋白质的分子设计蛋白质的分子设计 一、蛋白质分子设计的含义一、蛋白质分子设计的含义蛋白质分子设计（ProteinDesign）：依赖于蛋白质结构测定和分子模型的建立，按照蛋白质构效关系的理论基础，设计出比天然蛋白质性能优越的新型蛋白质。蛋白质设计属于多学科交叉领域（如计算机模拟专家、X射线晶体学家、蛋白质化学家、生物技术专家等的合作与配合）。第43页，讲稿共134张，创作于星期三蛋白质设计目的：有目的地为工程蛋白质的改造提供设计方案和指导信息；探索蛋白质的折叠机理。蛋白质设计的目标：产生既能折叠为预想的结构又具有特定功能的工程蛋白质。途径：反向实现蛋白质与工程底物的契合，改变功能；从头设计功能蛋白质。蛋白质设计目前存在的问题：与天然的蛋白质比较，缺乏结构的独特性及明显的功能优越性；三级结构的确定性较差。第44页，讲稿共134张，创作于星期三二、蛋白质分子设计原理二、蛋白质分子设计原理蛋白质分子设计的层次三维结构已知：直接将三维结构信息和蛋白质的功能相关联进行设计，属于高层次的设计。三维结构未知：借助一级结构序列信息及生物化学性质进行分子设计工作。第45页，讲稿共134张，创作于星期三蛋白质分子设计的分类定点突变或化学修饰法：在已知结构的天然蛋白质分子多肽链内的确定位置上，进行一个或数个氨基酸残基的改变或进行化学修饰，以研究和改善蛋白质的性质、结构和功能（小改）。拼接组装设计法：对来源于不同蛋白质的结构域或肽链进行剪裁、拼接和组装，以期望能转移相应的功能，获得具有新特点的蛋白质分子（中改）。全新蛋白质从头设计：从设计氨基酸结构开始，从头设计全新的自然界不存在的蛋白质，使之具有特定的空间结构和预期的功能（大改）。第46页，讲稿共134张，创作于星期三蛋白质分子设计的基础蛋白质生物功能的多样性；蛋白质功能由其高级结构决定；蛋白质的一级结构及其其构象与功能的关系；蛋白质的空间构象与功能活性的关系；结构生物学与生物信息学蛋白质分子设计的促进作用。第47页，讲稿共134张，创作于星期三蛋白质分子设计的原则活性设计：分子设计的第一步，主要考虑被研究的蛋白质功能，涉及选择化学基团及其空间取向；专一性设计：指功能性蛋白质在发挥其生理功能的时，总是与其他分子发生专一性相互作用；框架（Scaffold）设计：对蛋白质分子的立体设计，是分子设计中最难的一部；疏水基团与亲水基团需要合理分布；考虑最优氨基酸侧链的特定几何排列。第48页，讲稿共134张，创作于星期三蛋白质分子设计的程序设计目标蛋白质数据库建立结构模型获得目标蛋白质结构信息分析检测序列合成修正设计收集相关蛋白质的结构信息，建立所研究蛋白质的结构模型，结构模型的生物信息分析，选择设计目标，序列分析，预测结果，获得新蛋白质，新蛋白质的检测，完成新蛋白质设计。第49页，讲稿共134张，创作于星期三三、基于天然蛋白质结构的分子设计三、基于天然蛋白质结构的分子设计主要是依据天然蛋白质的一级结构，对蛋白质分子进行小改（定位突变）或中改（分子拼接组装）；定位突变定位突变蛋白质修饰基因定位突变蛋白质修饰：通过活性基团的引入或去除，而使蛋白质一级结构发生改变的过程；包括必须部分的修饰和非必需部分的修饰。第50页，讲稿共134张，创作于星期三定位突变的设计目标及解决方法目标：提高蛋白质的热酸稳定性和专一性、增加活性、降低副作用，进行结构-功能关系研究等，其中改善蛋白质的稳定性是蛋白质设计和改造的重要目标之一。基因定位突变：从基因水平上，进行蛋白质分子的改造，即采用定位诱变的技术，对编码蛋白质的基因进行核苷酸密码子的插入、删除、替换和改组，然后对突变后的基因进行蛋白质表达，并分析所表达蛋白质的功能活性，其结果为蛋白质分子改造提供新的设计方案。第51页，讲稿共134张，创作于星期三设计目标解决办法热稳定性对氧化的稳定性对重金属的稳定性pH稳定性提高酶学性质引入二硫桥，增加内氢键数目，改善内疏水堆积，增加表面盐桥把Cys转换为Ala或Ser，把Met转换为Gln、Val、Ile或Leu，把Trp转换为Phe或Tyr把Cys转换为Ala或Ser，把Met转换为Gln、Val、Ile或Leu，替代表面羧基替换表面荷电基团，His、Cys及Tyr的置换，内离子对的置换专一性的改变，增加逆转数，改变酸碱度蛋白质定位突变的设计目标及解决办法（蛋白质定位突变的设计目标及解决办法（Hartley，1986）第52页，讲稿共134张，创作于星期三定位突变的程序建立所研究蛋白质的结构模型；找出对所要求的性质有重要影响的位置；预测突变体的结构；构建突变体，获得突变体蛋白；突变体蛋白质的检测。定位突变残基的鉴定（结构与功能研究）根据结构信息确定残基的突变；依据突变方法鉴定突变功能残基；利用蛋白质的同源性鉴定突变功能残基。第53页，讲稿共134张，创作于星期三设计流程查找PDB了解需设计的蛋白质的三维结构是否已被收录，如果PDB中没有收录又未见文献报道，需要通过蛋白质X射线晶体及NMR方法测定蛋白质的三维结构，或通过结构预测的方法构建该蛋白质的三维结构模型。设计蛋白质突变体利用计算机模拟技术确定突变位点及替换的aa（确定对蛋白质折叠敏感的区域以及对功能非常重要的位置，考察剩余位置对所希望改变的影响，进行aa残基改变时应考虑其对结构特征的影响，同时也应考虑其对蛋白质功能的影响）；第54页，讲稿共134张，创作于星期三蛋白质设计的成功与否，必须要有理论与实验的紧密相结合利用能量优化及蛋白质动力学方法预测修饰后的蛋白质的结构；预测的结构与原始的蛋白质结构进行比较，利用蛋白质结构-功能或结构-稳定相关知识及理论计算预测新蛋白质可能具有的性质。在上述的设计工作完成后，要进行合成或突变实验，并经表达、分离纯化及表征后得到所要求的新工程蛋白质。第55页，讲稿共134张，创作于星期三蛋白质分子设计流程图天然蛋白质蛋白质晶体学新蛋白质蛋白质三维结构结构与功能关系蛋白质突变体设计及结构预测几何优化及蛋白质动力学研究结构分析与原先的结构比较蛋白质合成定位突变分离、纯化及表征蛋白质结构预测从数据库输入第56页，讲稿共134张，创作于星期三设计原理内核假设：内核是指蛋白质在进化过程中保守的内部区域，由氢键连接的二级结构单元组成。假设蛋白质独特的折叠形式主要由蛋白质内核中的残基相互作用决定。所有蛋白质内部具有疏水效应，成密堆积（很少有空穴大到可以结合一个水分子或惰性气体），并且没有重叠。所有内部的氢键都是最大满足的主链及侧链。疏水及亲水基团需要合理地分布在溶剂可及表面及不可及表面。第57页，讲稿共134张，创作于星期三金属蛋白质中配位残基的替换要满足金属配位几何：符合正确的键长、键角及整体的几何。对于金属蛋白质围绕金属中心的第二壳层的相互作用是最重要的，大部分配基含有多于一个与金属作用或形成氢键的基团，其余形成围绕金属中心的氢键网络，涉及与蛋白质主链、侧链或水分子的相互作用。最优的aa侧链几何排列：蛋白质侧链构象决定于立体势垒和氨基酸的空间位置。结构及功能的专一性：形成独特的结构，独特的分子间相互作用是生物相互作用及反应的标志。实践表明这是蛋白质设计最困难的问题。第58页，讲稿共134张，创作于星期三设计时应注意的问题应确定蛋白质折叠敏感的区域，包括带有特殊扭角的氨基酸、盐桥、密堆积区等；应确定对功能非常重要的位置；考察剩余位置对所希望改变的影响；当进行互换或插入/删除残基是应考虑他们对结构特征的影响，如疏水堆积、侧链取向、氢键、盐桥等。第59页，讲稿共134张，创作于星期三结构与功能的容忍度：蛋白质结构及功能对残基的替换有一定的容忍度，即结构与功能关系有一定的稳健度。Fersht等替换了Barnase的所有内核残基，其结果表明23的突变体保留了酶的活性。Mathews等在溶菌酶内核中替换多至10个残基，其结果表明多重取代的蛋白仍具有活性及协同折叠。不同的氨基序列具有相近的设计结构。第60页，讲稿共134张，创作于星期三蛋白质分子拼接：替换蛋白质分子的一（多）个肽段或一（多）个结构域。结构域是蛋白质分子中一种基本的结构单位。结构域拼接：通过基因操作把位于两种不同蛋白质上的几个结构域连接在一起，形成融合蛋白，它兼有原来两种蛋白的性质。结构域拼接是研究蛋白质功能的一种非常有力的手段，同时也为提高某些蛋白类药物的功效、改善其性能提供了一种思路，如：抗体工程。第61页，讲稿共134张，创作于星期三四、全新蛋白质分子设计四、全新蛋白质分子设计全新蛋白质分子设计：也称蛋白质分子从头设计，是指基于对蛋白质折叠规律的认识，从氨基酸的序列（一级结构）出发，设计制造自然界不存在的全新蛋白质，使之具有具有特定的空间结构和预期的功能。核心问题：根据所希望的结构及功能设计蛋白质或多肽的氨基酸序列。在确定所期望的目标结构时，最好用自然界现存的某种蛋白质的基本结构图样作为参考，但从头设计的蛋白质的氨基酸顺序又不能与任何已知蛋白质的天然氨基酸顺序相同。第62页，讲稿共134张，创作于星期三全新蛋白质分子设计程序设计目标序列生成结构预测合成构建模型检测第63页，讲稿共134张，创作于星期三从头设计方法的步骤活性位点分析：对结合位点的具体的化学信息进行扫描、分析和归类。这些信息的三维空间相互关系都必须充分考虑。配体分子构建：采用不同的片段选择和分子构建方法，产生相应的分子结构。评价：使用特定的评分系统将构建的分子与活性位点的匹配性进行排序，可以选择其中优良的结果作为合成实验的对象，也可以将之做新一轮计算的起点进行进一步的优化。第64页，讲稿共134张，创作于星期三勾勒出目标蛋白的大体轮廓依据氨基酸残基的统计学数据和排列的优先顺序，确定每个残基位置上的氨基酸。用分子动力学进行能量极小化计算，使构象的能量水平达到最低和稳定，优化目标蛋白的三维模型用各种已获得试验数据来检验和考核所给定的目标蛋白质结构是否合理对所设计的模型做进一步修正第65页，讲稿共134张，创作于星期三用多肽合成法或基因表达法获得全新目标蛋白质采用光谱学的方法对其结构进行考查采用相应的生物化学方法测定其生物功能用x射线结晶法准确测定目标蛋白质的三维结构通常需要经过几轮或许多轮的设计、检验和再设计，方可获得一个正确折叠和带有人们渴望功能的目标蛋白质。第66页，讲稿共134张，创作于星期三全新蛋白质设计结构的从头设计功能的从头设计分类蛋白质结构的从头设计：根据生物分子活性位点的特征产生一系列的结构片段，连接这些结构片段构成一个全新分子；或者在结合腔内对一个已知的结构骨架进行化合物的衍生。中心问题：稳定及独特的三维结构序列；基本障碍：线性聚合构象熵；解决方法：使相互作用的强度与数目达到最大；共价交叉连接。第67页，讲稿共134张，创作于星期三设计原则超二级结构和三级结构二级结构蛋白质结构的从头设计二级结构模块单元的自组装配体诱导组装通过共价交叉连接实现肽的自组装（-S-S-；DAB）在合成模板上的肽自组装线性多肽折叠为球状结构基于组合库的全新蛋白质设计第68页，讲稿共134张，创作于星期三二级模块单元的自组装：最简单、最直接的策略合成单一的两亲性的二级结构单元（螺旋、折叠）作为多肽链的片段模块，然后复制这些片段并把它们连接成整个蛋白质结构。疏水表面埋藏在内核形成紧密的蛋白质结构中。四螺旋束疏水亲水第69页，讲稿共134张，创作于星期三通过共价交叉连接实现肽的自组装：几个没有连接的肽进行自组装，熵势垒是比较难以克服的，通过共价交叉连接减少构象熵。不使用二硫键和人工连接片段的方法：赖氨酸的侧链氨基基团与谷氨酸、天冬氨酸的侧链羧酸基团彼此间能形成肽键。第70页，讲稿共134张，创作于星期三配体诱导组装策略：在蛋白结构中几个相互作用片段的界面处设计一个配位结合位点，如果这个位点对配体有很高的亲和力，则结合配体的合适的自由能将充分克服熵消耗并驱动肽自组装。利用二价铁离子诱导组装形成三螺旋束第71页，讲稿共134张，创作于星期三蛋白质功能的从头设计：途径：反向实现蛋白质与底物的契合，改变功能；从头设计功能蛋白质。通过反向拟合天然蛋白质设计新的功能键合及催化的从头设计主主在全新蛋白质中引入结合位点催化活性蛋白质的设计膜蛋白及离子通道的设计新材料的设计类型第72页，讲稿共134张，创作于星期三全新蛋白质分子设计的现状：全新蛋白质分子设计不仅使我们有可能得到自然界不存在的具有全新结构和功能的蛋白质，并且已经成为检验蛋白质折叠理论和研究蛋白质质折叠规律的重要手段。由于我们对蛋白质全新设计的理论基础，即蛋白质折叠规律的认识还不够，所以蛋白质全新设计还处在探索阶段。全新蛋白质分子设计的前景：随着新实验技术的发展，蛋白质全新设计的速度和效率必将得到极大的提高。组合化学方法应用到蛋白质全新设计中必然能够大大地缩短设计的周期，并将彻底改变蛋白质全新设计的面貌。第73页，讲稿共134张，创作于星期三一、蛋白质的化学修饰一、蛋白质的化学修饰第四讲第四讲 蛋白质分子的修饰蛋白质分子的修饰 化学途径分子生物学途径蛋白质修饰影响蛋白质化学修饰反应的主要因素：蛋白质功能基团的反应活性和修饰剂的反应活性。蛋白质的化学修饰：通过活性基团的引入或去除，而使蛋白质一级结构发生改变的过程；包括必须部分的修饰和非必需部分的修饰。第74页，讲稿共134张，创作于星期三影响蛋白质功能基团的反应活性的主要因素：基团之间的氢键与静电作用等和基团之间的空间阻力。修饰反应的主要类型：酰化反应、烷基化反应、氧化还原反应、芳香环取代反应等。蛋白质的侧链基团（组成蛋白质氨基酸残基上的功能团）主要包括氨基、羧基、巯基、胍基、酚基等。这些基团对蛋白质空间结构的形成和稳定有重要作用，侧链基团一旦改变将引起蛋白质空间构象的改变，从而改变蛋白质的特性和功能。可用于研究各种基团在蛋白质分子中的作用及其对蛋白质的结构、特性和功能的影响。蛋白质侧链基团的化学修饰第75页，讲稿共134张，创作于星期三侧链修饰基团通常有巯基、二硫键、氨基、羧基、咪唑基、羟基、酚羟基、胍基、色氨酸吲哚基等。蛋白质的位点专一性修饰：底物或配体结构相类似的修饰剂（对酶活性部位具有特异的亲和性）只对活性部位的氨基酸残基进行共价修饰的方法。作用原理与专一性不可逆抑制剂相同。亲和标记：试剂（抑制剂）专一性地标记酶的活性部位上，使酶不可逆地失活。第76页，讲稿共134张，创作于星期三光亲和标记：光亲和标记试剂的反应可以用光照来引发，它们的反应性能被很好地控制，其参与反应的成分为自由基，可以与它们附近几乎所有的基团反应，这些标记试剂也可以与非极性的侧链基团相结合。蛋白质的聚乙二醇修饰聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，使其末端活化后，通过共价键连接于蛋白质分子的表面，形成一层覆盖层。第77页，讲稿共134张，创作于星期三聚乙二醇修饰超氧物歧化酶，不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。酶半衰期相对稳定性天然SOD6min1聚乙二醇-SOD35h350蛋白质的化学交联和化学偶联蛋白质的化学交联：含双功能基团的化合物（双功能试剂）与蛋白质分子中相距较近的两个侧链基团之间形成共价交联，从而提高蛋白质的稳定性的修饰方法。第78页，讲稿共134张，创作于星期三双功能试剂：戊二醛可以两端都含有醛基，可以与蛋白质分子中的氨基反应形成酰胺键或者与羟基反应形成酯键；己二胺可以两端都含有氨基，可以与蛋白质分子中的羧基反应形成酰胺键。化学交联可发生在分子内的亚基与亚基之间，也可发生于蛋白质分子与分子之间，或多个分子之间，而形成网状交联。蛋白质修饰的化学偶联：将蛋白质分子偶联到一个化学惰性的水不溶性载体上，形成固定化蛋白质的蛋白质修饰方法。第79页，讲稿共134张，创作于星期三二、二、蛋白质的分子生物学改造基因的体外定基因的体外定向突变向突变基因的体外基因的体外定向进化定向进化PCR 扩增突变法扩增突变法引物定点引入法引物定点引入法局部随机慘入法局部随机慘入法碱基定点转换法碱基定点转换法部分片段合成法或基因全合成法部分片段合成法或基因全合成法易错易错PCRDNA改组改组体外随机引发重组体外随机引发重组交错延伸交错延伸过度模板随机嵌合生长过度模板随机嵌合生长渐增切割杂合酶生成渐增切割杂合酶生成同源序列非依赖性蛋白质重组同源序列非依赖性蛋白质重组第80页，讲稿共134张，创作于星期三定向突变：在DNA的水平上产生多肽链编码顺序的特异性改变，即在指定的位置上定向地诱发的基因突变。区域性定向突变（盒式诱变）：用人工合成的具有多种突变的双链寡核苷酸片段替换靶DNA的对应片段。即：将靶基因的一段DNA删掉，用人工化学合成所具有的突变核苷酸的双链寡核苷酸片段取代。第81页，讲稿共134张，创作于星期三目的：通过改变几个氨基酸序列来研究蛋白质的结构-功能之间的关系，也可以通过盒式突变法产生嵌合蛋白质。在这个嵌合蛋白质中，蛋白质分子中的整个结构域都可以用完全不同的氨基酸序列来置换。用途：产生各种特异性的突变或突变家族，在这些突变体中各种不同的序列被集中在目标基因的一个特定区域，从而为研究蛋白质特定结构区段或特定结构域的结构和功能提供了一个切实可行的方法。第82页，讲稿共134张，创作于星期三寡核苷酸引物诱寡核苷酸引物诱变技术变技术定点突变：将基因的某一个或某些位点进行人工替换、插入或删除的过程。第83页，讲稿共134张，创作于星期三第84页，讲稿共134张，创作于星期三利用聚合酶链反应(PCR)产生定点突变5端或3端区产生突变：直接PCR中心区突变：重叠延伸（overlapextension）GeneSOEing：通过重叠延伸进行剪接（splicingbyoverlapextension），即通过重组延伸方法将不同的基因进行剪接和组合在一起。第85页，讲稿共134张，创作于星期三第86页，讲稿共134张，创作于星期三重叠延伸重叠延伸PCR法示意图法示意图 第87页，讲稿共134张，创作于星期三大引物大引物PCR诱变法示意图诱变法示意图 第88页，讲稿共134张，创作于星期三重组重组PCR定点诱变法（一步反向定点诱变法（一步反向PCR法法）PCR第89页，讲稿共134张，创作于星期三插入突变第90页，讲稿共134张，创作于星期三缺失突变第91页，讲稿共134张，创作于星期三基因的全化学合成：按照所需蛋白质的氨基酸顺序，先后合成结构基因、转录的起始信号及终止信号、限制酶切位点等核酸片段，然后用连接酶将各片段连接起来，通过基因工程转移到细菌中进行目标蛋白质的表达。调节基因启动基因结构基因终止基因连接酶完整基因DNA第92页，讲稿共134张，创作于星期三定向进化易错PCR（Error-pronePCR，ep-PCR）：在采用DNA聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件（提高镁离子浓度、加入锰离子、改变体系中四种的dNTPs浓度或运用低保真度DNA聚合酶等）来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体。条件：降低一种dNTP的量（降至5-10），加入dITP来代替被减少的dNTP；缓冲液中另加0.5mmol/L Mn2+，改变Mg2+的浓度。第93页，讲稿共134张，创作于星期三第94页，讲稿共134张，创作于星期三关键：选择的合适突变频率，突变频率太高会导致绝大多数突变为有害突变，无法筛选到有益突变；突变频率太低则会导致文库中全是野生型群体。理想的碱基置换率和易错的最佳条件主要依赖于突变的DNA片段的长度。连续易错：将一次扩增得到的有益突变基因作为下一次扩增的模板，连续反复地进行随机诱变，使每一次扩增得到的正向突变累积而产生重要的有益突变。第95页，讲稿共134张，创作于星期三DNA改组（DNAshuffing，重组装）：又称基因洗牌术，是DNA分子的体外重组，是基因在分子水平上有性重组。通过改变单基因(或基因家族)原有核苷酸序列，创造新基因，赋予表达产物以新功能。DNAShuffling与常规定向进化的比较项目进化速度进化对象进化周期影响对象突变效率常规定向进化缓慢进化整个基因组多年完整基因组高DNAShuffling快速进化特定基因/操纵子/病毒几天部分基因组低第96页，讲稿共134张，创作于星期三DNA酶I将基因被切成片段，片段退火进行无引物PCR（有性PCR），随着循环数的增加，PCR产物将越来越接近切割前的目的基因的长度，最后用基因两侧的引物合成全长的基因，并构建突变文库。第97页，讲稿共134张，创作于星期三单基因改组多基因改组单点突变文库嵌合体文库外显子、单基因和基因家族的改组第98页，讲稿共134张，创作于星期三体外随机引发重组第99页，讲稿共134张，创作于星期三交错延伸第100页，讲稿共134张，创作于星期三基因突变库的大规模筛选平板分析（遗传互补筛选法）：使抗生素失效的酶类(如头孢菌素酶，b-乳糖酶），提高耐热性，易于观察的菌落表型（如菌落颜色等），营养缺陷型的辅助筛选等。噬菌