疟原虫血片制作方法讲稿.ppt

关于疟原虫血片制作方法第一页，讲稿共二十七页哦 血膜的制作（取血时间）血膜的制作（取血时间）n取取血血时时机机 现现症症病病人人一一般般可可随随时时取取血血，疟疟疾疾普普查查时时可可不不考考虑虑取取血血时时机机。但但在在诊诊断断或或需需要要某某期期疟原虫作标本时，则应掌握适宜的取血时机。疟原虫作标本时，则应掌握适宜的取血时机。间间日日疟疟在在寒寒热热发发作作时时，外外周周血血液液中中主主要要可可见见环环状状体体期期；发发作作后后数数小小时时，环环状状体体发发育育到到滋滋养养体体期期，疟疟色色素素形形成成，形形态态较较易易辩辩认认，为为诊诊断断的的有有利利时时机机；3648小小时时，可可检检出出裂裂殖殖体体；发发作作一、二次后，配子体出现较多。一、二次后，配子体出现较多。n恶恶性性疟疟较较理理想想的的取取血血时时间间是是在在发发作作后后至至20小小时内取血，初发患者退热后常查不到原虫。时内取血，初发患者退热后常查不到原虫。第二页，讲稿共二十七页哦 血膜的制作（取血操作）血膜的制作（取血操作）n取血方法取血方法 采血部位一般人为耳垂，指头，采血部位一般人为耳垂，指头，通常在耳垂取血（现场取血建议用大头针通常在耳垂取血（现场取血建议用大头针采血，一人一针，避免血传疾病）。先用采血，一人一针，避免血传疾病）。先用75%酒精棉球消毒取血部位（冬季用手酒精棉球消毒取血部位（冬季用手捻动耳垂使其充血后再行消毒），待酒精捻动耳垂使其充血后再行消毒），待酒精干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方，干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方，右手持消毒针迅速刺入耳垂下端右手持消毒针迅速刺入耳垂下端12毫米，毫米，不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻向不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻向挤压出血。挤压出血。第三页，讲稿共二十七页哦 取血量及涂片法（涂片操作）取血量及涂片法（涂片操作）n薄薄血血膜膜 取取洁洁净净的的载载玻玻片片2张张，1张张平平置置在在桌桌上上，以以左左手手拇拇指指，食食指指夹夹持持载载玻玻片片两两端端（手手指指切切勿勿接接触触玻玻片片表表面面），用用另另一一张张边边缘缘平平滑滑（最最好好为为磨磨口口边边缘缘）的的载载玻玻片片做做推推片片，用用推推片片一一端端边边缘缘的的中中点点从从取取血血部部分分取取约约1微微升升的的血血量量（相相当当于于1/4火火柴柴头头大大小小），使使血血滴滴与与平平置置的的载载玻玻片片接接触触，并并形形成成2530度度夹夹角角，待待血血液液向向两两侧侧扩扩展展约约2厘厘米米长长度度时时，均均匀匀而而迅迅速速地地轻轻轻轻向向左左推推出出（约约2.5厘厘米长）。米长）。第四页，讲稿共二十七页哦（涂片操作）（涂片操作）厚血膜厚血膜 用推片的一角，从取血部位刮取约用推片的一角，从取血部位刮取约4微升血量（相微升血量（相当于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，再当于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，再由里向外一个方向旋转，转由里向外一个方向旋转，转24圈，涂成直径圈，涂成直径0.81厘米大小圆形厚血膜，血膜厚薄均匀，过厚易于脱落，过厘米大小圆形厚血膜，血膜厚薄均匀，过厚易于脱落，过薄达不到检出率的要求。薄达不到检出率的要求。第五页，讲稿共二十七页哦血膜的制作血膜的制作（涂片操作）（涂片操作）n涂涂制制厚厚、薄薄血血膜膜的的位位置置 通通常常是是将将厚厚、薄薄血血膜膜涂涂在在一一张张载载片片上上。方方法法是是将将载载片片分分为为6等等分分，第第1、2格格备备贴贴标标签签及及编编号号用用；厚厚血血膜膜涂涂在在第第3格格中中央央，薄薄血血膜膜涂涂在在第第4格格前前缘缘至至第第6格格中中部部。作作为为标标本本的的血血片片每每张张玻玻片片涂涂厚厚、薄薄血血膜膜各各1个个；门诊和发热病人血片每片门诊和发热病人血片每片1人，涂人，涂 涂涂2个厚血膜个厚血膜1个薄血膜，个薄血膜，以以 防血膜脱落而影响检查防血膜脱落而影响检查；疟疾调查时，每张玻片疟疾调查时，每张玻片 可涂制可涂制23人血膜。人血膜。标本片发热病人血片标签标签第六页，讲稿共二十七页哦血膜的制作血膜的制作n血膜编号血膜编号 血膜制成后，立即用特种蜡笔血膜制成后，立即用特种蜡笔或水笔于玻片面上写上受检者的号码，以或水笔于玻片面上写上受检者的号码，以防差错，待薄血膜干后再用铅笔于薄血膜防差错，待薄血膜干后再用铅笔于薄血膜中写上血片种类的代号和受检者的个人编中写上血片种类的代号和受检者的个人编号，依次顺序插入标本盒内。号，依次顺序插入标本盒内。第七页，讲稿共二十七页哦 制作制作血膜血膜的注意事项的注意事项 1.玻片清洗时，避免玻片碰撞、磨损。制作血膜的载玻片必须完全清洁而毫无油渍或污垢。制片时，手指只能持载片的边缘，不能接触玻片表面，以免油污使薄血膜产生空白区以及厚血膜脱落。作为推片的玻片边缘一定要平滑，才能使推出的血膜均匀一致。第八页，讲稿共二十七页哦制作制作血膜血膜的注意事项的注意事项n 2.刚刚涂涂制制的的血血膜膜要要平平放放在在标标本本盒盒内内，厚厚血血膜膜未未干干前前勿勿使使标标本本盒盒倾倾斜斜，以以免免血血膜膜倾倾向向一一侧侧，造造成成血血膜膜厚厚薄薄不不均均，厚厚处处不不一一溶溶血血和和着着色色而而影影响响检检查查结结果果；晾晾干干血血膜膜时时应应注注意意防防尘尘、防防止止苍苍蝇蝇、蟑蟑螂螂等等昆昆虫虫吮吮吸吸血血膜膜，干干后后应应及及时时装装入入标标本本盒盒并并盖盖严严，新新的的木木制制标标本本盒盒需需敞敞开开放放置置一一段段时时间间，让让木木醇醇挥挥发发后后才才能能使使用用，以以免免厚厚血血膜膜红红蛋蛋白白被被其其固固定定，不不能能溶溶血血或或染染色色效效果果不佳。不佳。第九页，讲稿共二十七页哦制作制作血膜血膜的注意事项的注意事项n 3.血膜让其自然干燥，切忌用太阳晒或血膜让其自然干燥，切忌用太阳晒或火烤，干透后才能用甲醇固定薄血膜。火烤，干透后才能用甲醇固定薄血膜。夏天标本尽可能夏天标本尽可能2448小时内固定染色；小时内固定染色；冬天也不能超过冬天也不能超过72小时。放置时间越久，小时。放置时间越久，厚血膜越不易脱血，染色效果也差。若厚血膜越不易脱血，染色效果也差。若不能及时染色，膜血膜宜先用甲醇固定不能及时染色，膜血膜宜先用甲醇固定（13分钟）然后用过滤清水对厚血膜分钟）然后用过滤清水对厚血膜溶血，晾干固定后装入盒内盖严，待以溶血，晾干固定后装入盒内盖严，待以后染色。后染色。第十页，讲稿共二十七页哦血片的染色血片的染色（一）染液的种类及染色原理（一）染液的种类及染色原理染液种类染液种类：目前所用的血片染色液，虽然名称目前所用的血片染色液，虽然名称很多，但都是从罗门诺夫斯基氏创造的染液很多，但都是从罗门诺夫斯基氏创造的染液变化过来的。总的可分为水溶液和酒精溶液变化过来的。总的可分为水溶液和酒精溶液两大类，前者包括罗氏、西氏（两大类，前者包括罗氏、西氏（Simon)、J.S.B氏染液等，后者包括利氏氏染液等，后者包括利氏(Leishman)、瑞氏和吉氏染液等。这些染液中的主要染剂瑞氏和吉氏染液等。这些染液中的主要染剂都包含美兰、伊红和由美兰氧化所成的天青，都包含美兰、伊红和由美兰氧化所成的天青，所以称多色性染剂。所以称多色性染剂。第十一页，讲稿共二十七页哦血片的染色血片的染色（一）染液的种类及染色原理（一）染液的种类及染色原理染色原理：染色原理：伊红是伊红是酸性酸性水溶性钠盐，美兰是水溶性钠盐，美兰是碱性碱性水溶性盐酸盐，当它们各自溶化水中时，就离水溶性盐酸盐，当它们各自溶化水中时，就离解为带阳电和阴电的离子。伊红主要离解为酸解为带阳电和阴电的离子。伊红主要离解为酸性的阳离子，在遇到碱性的蛋白质如血红蛋白、性的阳离子，在遇到碱性的蛋白质如血红蛋白、嗜伊红白血球颗粒等即可结合成不易溶于水的嗜伊红白血球颗粒等即可结合成不易溶于水的沈淀物染成红色。美兰主要离解为碱性的美兰沈淀物染成红色。美兰主要离解为碱性的美兰离子，美兰就与疟原虫、淋巴和大单核细胞的离子，美兰就与疟原虫、淋巴和大单核细胞的胞浆、嗜碱性白细胞的颗粒等酸性蛋白质结合胞浆、嗜碱性白细胞的颗粒等酸性蛋白质结合染成兰色。染成兰色。第十二页，讲稿共二十七页哦血片的染色血片的染色（一）染液的种类及染色原理（一）染液的种类及染色原理染色原理染色原理：美兰与伊红都不能使原虫和白细胞：美兰与伊红都不能使原虫和白细胞的核着色，必须由天青作为媒介（染媒）才的核着色，必须由天青作为媒介（染媒）才能使其着色。天青虽然也是碱性染剂，但又能使其着色。天青虽然也是碱性染剂，但又具有染媒作用，使原虫核和白细胞核等原来具有染媒作用，使原虫核和白细胞核等原来只能染上极淡兰色的结构染上显著的酸性染只能染上极淡兰色的结构染上显著的酸性染剂伊红，这样，就使白细胞粗大的核染成显剂伊红，这样，就使白细胞粗大的核染成显著的既兰又红的紫兰色，而较小或菲薄的原著的既兰又红的紫兰色，而较小或菲薄的原虫核和淋巴细胞原浆中的颗粒染成紫红色。虫核和淋巴细胞原浆中的颗粒染成紫红色。第十三页，讲稿共二十七页哦血片的染色血片的染色（一）染液的种类及染色原理（一）染液的种类及染色原理注意注意：蛋白质是：蛋白质是二性二性电解质，当其处于较电解质，当其处于较等电点等电点为酸的溶液中时，便呈为酸的溶液中时，便呈硷的作用，即与酸或阴离子结合，这就说明为何在染液偏酸时，伊硷的作用，即与酸或阴离子结合，这就说明为何在染液偏酸时，伊红的着色力强，使红细胞着色鲜艳而淋巴细胞和原虫的胞浆着色不红的着色力强，使红细胞着色鲜艳而淋巴细胞和原虫的胞浆着色不著；反之，蛋白质在偏硷的溶液中呈酸的作用而中和硷基，也就说著；反之，蛋白质在偏硷的溶液中呈酸的作用而中和硷基，也就说明为何染液偏硷时，红细胞和嗜伊红白细胞的颗粒等被染成紫兰色。明为何染液偏硷时，红细胞和嗜伊红白细胞的颗粒等被染成紫兰色。伊红在水溶液内遇到美兰或天青，即可互相化合而产生沈淀从伊红在水溶液内遇到美兰或天青，即可互相化合而产生沈淀从而失去染色力，因此，吉氏母液绝对不能进水。而失去染色力，因此，吉氏母液绝对不能进水。第十四页，讲稿共二十七页哦血片的染色血片的染色（二）吉氏染液母液配置方法（二）吉氏染液母液配置方法 取吉氏粉取吉氏粉0.5克置于研钵中，加克置于研钵中，加少量甘油充分研磨，再加再磨，至少量甘油充分研磨，再加再磨，至25毫升加完为止，倒入毫升加完为止，倒入60或或100毫升带有玻塞的有色玻瓶中。在研毫升带有玻塞的有色玻瓶中。在研钵中加少量甲醇，洗去甘油浓液混钵中加少量甲醇，洗去甘油浓液混入瓶内，至入瓶内，至25毫升甲醇洗净钵中甘毫升甲醇洗净钵中甘油染液为止，塞紧瓶塞，充分摇匀，油染液为止，塞紧瓶塞，充分摇匀，置于置于5560水浴中或温箱内水浴中或温箱内24小时或室温内小时或室温内35天，多加摇动，天，多加摇动，即成原液。吉氏染液是目前较优良的即成原液。吉氏染液是目前较优良的血膜染剂，即使在炎热天气中，亦可血膜染剂，即使在炎热天气中，亦可经久不变。经久不变。材料：材料：1、吉氏粉、吉氏粉0.5克克 2、甘油、甘油25毫升毫升 3、甲醇、甲醇25毫升毫升第十五页，讲稿共二十七页哦血片的染色血片的染色（三）吉氏染液血片染色方法（三）吉氏染液血片染色方法 先用甲醇或无水酒精固定薄血膜，待干后进行染色。先用甲醇或无水酒精固定薄血膜，待干后进行染色。亦可在固定薄血膜后用清水对厚血膜溶脱血红蛋白，然后亦可在固定薄血膜后用清水对厚血膜溶脱血红蛋白，然后才进行染色。才进行染色。成批血片染色成批血片染色：将已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒：将已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入入2%吉氏染液稀释液（吉氏染液稀释液（2毫升原液加中性蒸馏水毫升原液加中性蒸馏水98毫升毫升稀释均匀即成），同时对厚薄血膜染色稀释均匀即成），同时对厚薄血膜染色30分钟（如染分钟（如染液不合标准时，得酌情增减染色时间），然后用清水轻液不合标准时，得酌情增减染色时间），然后用清水轻轻将染液冲去，再用清水轻轻冲洗一次，干净后将血片轻将染液冲去，再用清水轻轻冲洗一次，干净后将血片标本（血膜面朝下）插于晾干板上，待干镜检。标本（血膜面朝下）插于晾干板上，待干镜检。第十六页，讲稿共二十七页哦血片的染色血片的染色（三）吉氏染液血片染色方法（三）吉氏染液血片染色方法 先用甲醇或无水酒精固定薄血膜，待干先用甲醇或无水酒精固定薄血膜，待干后进行染色。亦可在固定薄血膜后用清水对厚后进行染色。亦可在固定薄血膜后用清水对厚血膜溶脱血红蛋白，然后才进行染色。血膜溶脱血红蛋白，然后才进行染色。单张血片染色单张血片染色：薄血膜经固定干燥后，：薄血膜经固定干燥后，用用2%吉氏染液稀释液吉氏染液稀释液12毫升，滴入血片标毫升，滴入血片标本上染色本上染色30分钟左右，或用中性蒸馏水分钟左右，或用中性蒸馏水1毫升，毫升，加吉氏母液加吉氏母液12滴，混合均匀后滴入血片标滴，混合均匀后滴入血片标本上，染色本上，染色1020分钟，然后用清水轻轻将分钟，然后用清水轻轻将片上的染液冲洗干净，晾干镜检。片上的染液冲洗干净，晾干镜检。第十七页，讲稿共二十七页哦影响染色效果的因素影响染色效果的因素n血血片片染染色色好好坏坏除除了了与与玻玻片片是是否否清清洁洁，血血片片制制作作质质量量好好坏坏等等有有关关外外，还还受受到到以以下下几几个个因素的影响：因素的影响：n（1）染染料料溶溶剂剂的的质质量量 染染料料、甲甲醇醇和和甘甘油油如如果果不不纯纯，常常使使配配制制的的染染液液偏偏酸酸或或偏偏碱碱而而影影响响染染色色效效果果。因因此此必必须须用用分分析析纯纯的的甲甲醇醇和和中中性性甘甘油油，而而且且在在配配制制时时所所用用的的器器具具必必须干净而无水份。须干净而无水份。第十八页，讲稿共二十七页哦影响染色效果的因素影响染色效果的因素n（2）染染液液的的新新旧旧 新新配配制制的的染染液液因因色色素素尚尚未未充充分分溶溶解解，染染色色力力较较弱弱且且常常呈呈现现偏偏碱碱性性。染染液液存存放放时时间间越越久久，染染色色力力越越强强。通通常常在在染染液液配配制制12周周后后才才使使用用，盛盛装装染染液液的的瓶瓶子应加塞盖密。以防吸潮而影响染液质量。子应加塞盖密。以防吸潮而影响染液质量。第十九页，讲稿共二十七页哦影响染色效果的因素影响染色效果的因素n（3）染染液液稀稀释释后后使使用用时时间间 吉吉氏氏和和瑞瑞氏氏染染液液的的主主要要成成份份是是美美蓝蓝、伊伊红红和和由由美美蓝蓝氧氧化化产产生生的的天天青青，三三者者能能在在酒酒精精溶溶液液中中溶溶解解，但但在在水水溶溶液液中中伊伊红红遇遇到到美美蓝蓝和和天天青青即即产产生生沉沉淀淀。因因此此，必必须须在在稀稀释释染染液液当当时时使使用用，一般在半小时内一般在半小时内染色力最强。染色力最强。第二十页，讲稿共二十七页哦影响染色效果的因素影响染色效果的因素n（4）染液的稀释浓度）染液的稀释浓度 染液的浓度高其着染液的浓度高其着色就快而深，从而疟原虫寄生红细胞的薛色就快而深，从而疟原虫寄生红细胞的薛氏点粗大显著，但颜色常偏碱；染液浓度氏点粗大显著，但颜色常偏碱；染液浓度过低则染色时间久，颜色偏酸，薛氏点不过低则染色时间久，颜色偏酸，薛氏点不明显或消失。明显或消失。第二十一页，讲稿共二十七页哦影响染色效果的因素影响染色效果的因素n（5）染色时间）染色时间 染色时间长染色效果好，染色时间长染色效果好，反之较差。室温高则着色快，染色时间可反之较差。室温高则着色快，染色时间可略缩短，气温低可适当延长。因此染色时略缩短，气温低可适当延长。因此染色时间应根据染液的质量、新旧、稀释浓度和间应根据染液的质量、新旧、稀释浓度和气温而适当增减。气温而适当增减。第二十二页，讲稿共二十七页哦影响染色效果的因素影响染色效果的因素n（6）染色用水）染色用水 染液的稀释用水和染色后冲洗用水应选染液的稀释用水和染色后冲洗用水应选择择Ph7.07.2清洁水，通常使用的新鲜的蒸馏水或过滤清洁水，通常使用的新鲜的蒸馏水或过滤的冷开水，以及自来水、井水、河水、泉水和雨水等。如的冷开水，以及自来水、井水、河水、泉水和雨水等。如果偏酸或偏碱，可用缓冲蒸馏水调整。染色后发现血膜颜果偏酸或偏碱，可用缓冲蒸馏水调整。染色后发现血膜颜色偏蓝（偏碱）或偏红（偏酸）时，可用与之相反的酸、色偏蓝（偏碱）或偏红（偏酸）时，可用与之相反的酸、碱度水冲洗血片予以纠正。碱度水冲洗血片予以纠正。第二十三页，讲稿共二十七页哦影响染色效果的因素影响染色效果的因素n（7）染染色色后后不不要要直直接接将将染染液液倒倒掉掉，应应沿沿玻玻片片或或染染色色缸缸边边缘缘加加水水使使染染液液表表面面一一层层溢溢出出，并轻轻冲洗，以免染液色素颗粒沾污血膜。并轻轻冲洗，以免染液色素颗粒沾污血膜。第二十四页，讲稿共二十七页哦显微镜的一般构造显微镜的一般构造1.镜座 9.粗调节器 17.滤光镜圈 2.镜柱 10.细调节器 18.反光镜3.镜臂 11.齿板4.倾斜度关节 12.镜台5.镜筒 13.推动器6.接目镜 14.弹簧夹7.旋转盘 15.聚光器8.接物镜 16.虹彩第二十五页，讲稿共二十七页哦血片的镜检血片的镜检1.在学习镜检疟原虫之前，必须先对正常厚薄血膜中各种血在学习镜检疟原虫之前，必须先对正常厚薄血膜中各种血细胞的形态、内部结构和染色性质加以识别。细胞的形态、内部结构和染色性质加以识别。2.学习镜检疟原虫，首先要学看薄血膜，在基本上掌握薄血膜学习镜检疟原虫，首先要学看薄血膜，在基本上掌握薄血膜中疟原虫形态后，才学习镜检厚血膜。中疟原虫形态后，才学习镜检厚血膜。3.镜检疟原虫一般只查厚血膜，薄血膜仅作为原虫分类时镜检疟原虫一般只查厚血膜，薄血膜仅作为原虫分类时参考和血片编号之用。参考和血片编号之用。4.镜检疟原虫必须用油镜头配合镜检疟原虫必须用油镜头配合5X低倍目镜镜检，当发现疑低倍目镜镜检，当发现疑难问题时可调换难问题时可调换10X目镜进行观察。目镜进行观察。5.检查时应从厚血膜的上缘开始，使血膜从上而下，自左至检查时应从厚血膜的上缘开始，使血膜从上而下，自左至右，由右至左，一行接一行，一个视野稍叠一个视野顺序右，由右至左，一行接一行，一个视野稍叠一个视野顺序地查完整个血膜。地查完整个血膜。第二十六页，讲稿共二十七页哦感感谢谢大大家家观观看看第二十七页，讲稿共二十七页哦