基因克隆以及蛋白表达.ppt

关于基因克隆及蛋白表达第一张，PPT共八十六页，创作于2022年6月研究某一目的基因功能一般策略研究某一目的基因功能一般策略 目的目的DNADNA获得来自三条途径获得来自三条途径:l l1.1.genomegenome上的特定区域或序列上的特定区域或序列l l2.含有目的含有目的DNADNA的质粒的质粒l l3.从从cDNAcDNA文库中扩增单个已知文库中扩增单个已知cDNAcDNA获得目的获得目的获得目的获得目的DNADNA构构构构 建建建建 含含含含 目目目目 的的的的DNADNA质粒质粒质粒质粒转化细菌转化细菌转化细菌转化细菌蛋白表达纯化蛋白表达纯化蛋白表达纯化蛋白表达纯化转染真核细胞转染真核细胞转染真核细胞转染真核细胞蛋白定位、表达及表型变化蛋白定位、表达及表型变化蛋白定位、表达及表型变化蛋白定位、表达及表型变化第二张，PPT共八十六页，创作于2022年6月第一部分第一部分PCR第三张，PPT共八十六页，创作于2022年6月聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR）技术）技术 l l聚聚合合酶酶链链式式反反应应(Polymerase(PolymeraseChainChainReactionReaction，PCR)PCR)是是2020世世世世纪纪纪纪8080年年年年代代代代后后后后期期期期由由由由K.MullisK.Mullis等等等等建建建建立立立立的的的的一一一一种种种种体体体体外外外外酶酶酶酶促促促促扩增特异扩增特异扩增特异扩增特异DNADNA片断的技术。片断的技术。片断的技术。片断的技术。l lPCRPCR是是利利用用针针对对目目的的基基因因所所设设计计的的一一一一对对对对特特特特异异异异寡寡寡寡核核核核苷苷苷苷酸引物酸引物酸引物酸引物，以目的基因为模板进行的，以目的基因为模板进行的，以目的基因为模板进行的，以目的基因为模板进行的DNADNA体外合成反应。体外合成反应。体外合成反应。体外合成反应。l lPCR技技术术具具有有灵灵敏敏度度高高，特特异异性性强强，操操作作简简便便等等特点。目前已广泛应用于分子生物学的各个领域。特点。目前已广泛应用于分子生物学的各个领域。第四张，PPT共八十六页，创作于2022年6月一、一、PCRPCR实验原理实验原理第五张，PPT共八十六页，创作于2022年6月一、一、PCRPCR实验原理实验原理第六张，PPT共八十六页，创作于2022年6月二、二、PCRPCR的反应体系的反应体系 1.PCR1.PCR引物引物（1 1）primerprimer长度：长度：18-30bp18-30bp 引物短引物短引物短引物短特异性降低特异性降低特异性降低特异性降低引物长引物长影响产物生成影响产物生成（2 2）primer浓度：浓度：浓度：浓度：0.1-1.0umol/Lumol/L 浓度过高浓度过高浓度过高浓度过高错配、引物二聚体增加错配、引物二聚体增加浓度过低浓度过低浓度过低浓度过低PCRPCR效率降低效率降低效率降低效率降低第七张，PPT共八十六页，创作于2022年6月二、二、PCRPCR的反应体系的反应体系 2.2.缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液 KClKCl、Tris-ClTris-Cl、MgClMgCl2 2，MgMg2+2+：1.51.52.0mM2.0mMMgMg2+2+:DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 活性活性活性活性 PCRPCR产量产量产量产量Mg2+2+:PCR:PCR反应特异性反应特异性第八张，PPT共八十六页，创作于2022年6月二、二、PCRPCR的反应体系的反应体系 3.DNA3.DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 LADNALADNA聚合酶聚合酶 PrimeSTARPrimeSTAR(PyrobestDNA(PyrobestDNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶)PfuDNAPfuDNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶第九张，PPT共八十六页，创作于2022年6月第十张，PPT共八十六页，创作于2022年6月第十一张，PPT共八十六页，创作于2022年6月Taq DNA polymerase553353355533DNADNA聚聚合合酶酶活活性性。在在模模板板和和引引物物存存在在的的条条件件下下，以以dNTPdNTP作作作作为为为为底底底底物物物物，沿沿沿沿5533方方方方向向向向合合合合成成成成与与与与模模模模板板板板互互互互补补补补的的的的DNADNA第十二张，PPT共八十六页，创作于2022年6月LATaqDNAPolymerase1.51.53DNA3DNA聚合酶活性；聚合酶活性；聚合酶活性；聚合酶活性；2.35DNA外切酶活性。外切酶活性。外切酶活性。外切酶活性。第十三张，PPT共八十六页，创作于2022年6月Pyrobest&pfu DNA PolymeraselTaqDNA聚合酶活性聚合酶活性l35外切酶活性，可信度极高外切酶活性，可信度极高lPCR产物为平滑末端产物为平滑末端第十四张，PPT共八十六页，创作于2022年6月PCR的反应体系4dNTP:50-200umol/L5.模板模板DNA（1）单链单链DNA（2）双链双链DNA（3）浓度：基因组浓度：基因组DNA：1ug质粒质粒DNA：10ng第十五张，PPT共八十六页，创作于2022年6月三、基本操作步骤三、基本操作步骤l1.1.变性变性(denature)(denature)(denature)(denature):95:95高温下高温下,双螺旋氢键断双螺旋氢键断 l 裂裂,双链双链DNADNA解链成为单链解链成为单链DNADNAl2.2.退火退火(annealing)(annealing)(annealing)(annealing):两条引物与模板两条引物与模板DNADNA扩增区扩增区 l 域的两端按碱基互补配对结合域的两端按碱基互补配对结合.l3.3.延伸延伸延伸延伸(extension)(extension)(extension)(extension):在在4 4种种dNTPdNTP底物及底物及Mg2+存在存在l条件下条件下,TaqDNA聚合酶在聚合酶在72下下,将单核将单核 l 苷酸按碱基互补配对原则从引物苷酸按碱基互补配对原则从引物3 3端掺端掺l 入入,使引物沿使引物沿5 533方向延伸合成新股方向延伸合成新股DNADNA第十六张，PPT共八十六页，创作于2022年6月四、条件优化四、条件优化l l1.1.1.1.变性变性变性变性:95:95:95:95变性变性20-30s,20-30s,20-30s,20-30s,即可使各种即可使各种DNADNADNADNA完全变性。完全变性。l l2.2.2.2.退退退退火火火火:引引引引物物物物与与与与模模模模板板板板退退退退火火火火温温温温度度度度由由由由引引引引物物物物长长长长度度度度和和和和GC%GC%GC%GC%决决决决定定定定,退退火火温温度度一一般般应应比比TmTmTmTm值值低低4-12 4-12 为为为为宜宜宜宜,退退退退火火火火时时时时间间间间一一一一般般般般为为为为20-40s20-40s20-40s20-40s。l l3.3.3.3.延延伸伸:通通通通常常常常68-7568-7568-7568-75。延延伸伸时时间间取取决决于于扩扩增增片片断断的的长长度度.可可可可以以以以500bp/30s500bp/30s为为为为基基基基准准准准，根根根根据据据据目目目目的的的的片片片片断断断断的的的的长长长长度度度度计计计计算反应时间。算反应时间。算反应时间。算反应时间。l l4.4.4.4.循环次数循环次数循环次数循环次数：一般为：一般为：一般为：一般为25-3525-3525-3525-35次。次。第十七张，PPT共八十六页，创作于2022年6月PCR反应液l lPCRBuffer（Mg2+）2.5ll ldNTP混合物（各混合物（各2.5mM）4ll l模板模板DNA1ll l引物引物1（20uM）0.5ll l引物引物2（20uM）0.5ll lTaqDNApolymerase（5U/ul）0.25ll lddH2O至至25l第十八张，PPT共八十六页，创作于2022年6月PCR反应条件 94 5minl94 30secl55 30sec 30 Cyclesl72 1minl72 10minl 4 forever第十九张，PPT共八十六页，创作于2022年6月五、五、PCR引物的设计引物的设计l lPCR反应成功的一个关键条件是正确设计引物反应成功的一个关键条件是正确设计引物l lPCR引引物物设设计计目目的的是是在在扩扩增增特特异异性性和和扩扩增增效效率率两个目标上取得平衡两个目标上取得平衡.l l可可以以利利用用计计算算机机软软件件进进行行引引物物设设计计,引引物物设设计计软软件件会会通通过过每每一一引引物物设设计计变变化化的的预预定定值值在在两两个个目标间取得平衡目标间取得平衡,找出最佳引物找出最佳引物.l l有时也需根据实验的具体要求进行适当调整有时也需根据实验的具体要求进行适当调整.第二十张，PPT共八十六页，创作于2022年6月引物设计的基本原则引物设计的基本原则 l l(一一一一)引物长度引物长度引物长度引物长度l l在在在在16-30bp16-30bp范围内范围内,以以以以18-24bp18-24bp18-24bp18-24bp为最佳为最佳为最佳为最佳.l l引引引引物物物物过过过过短短短短,产产产产物物物物特特特特异异异异性性性性降降降降低低低低,每每增增加加一一个个核核苷苷酸酸,引引物特异性可增加物特异性可增加4 4 4 4倍倍倍倍.l l引引物物的的长长度度是是指指与与模模板板DNADNADNADNA序序序序列列列列互互互互补补补补的的的的部部部部分分分分,不不不不包包包包括为后续克隆而加的酶切位点与额外序列括为后续克隆而加的酶切位点与额外序列括为后续克隆而加的酶切位点与额外序列括为后续克隆而加的酶切位点与额外序列.第二十一张，PPT共八十六页，创作于2022年6月引物设计的基本原则引物设计的基本原则l l(二二二二)引物末端引物末端引物末端引物末端l l1.1.1.1.引物的引物的引物的引物的3 3 3 3末端对于末端对于PCRPCRPCRPCR反应是关键反应是关键反应是关键反应是关键.l l2.2.2.2.引引引引物物物物的的的的3333末末末末端端端端的的的的第第第第一一一一和和和和第第第第二二二二个个个个碱碱碱碱基基基基影影影影响响响响Taq Taq Taq Taq DNADNADNADNA聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶的的的的延延延延伸伸伸伸效效效效率率率率,故故故故其其其其影影影影响响响响PCRPCRPCRPCR反反反反应应应应的的的的扩扩扩扩增增增增效效效效率率率率及及及及特特特特异异异异性性性性.引引引引物物物物3333末末末末端端端端最最最最佳佳佳佳碱碱碱碱基基基基选选选选择择择择G G G G或或或或C C C C，因因因因为为为为它它它它们形成的碱基配对比较稳定。们形成的碱基配对比较稳定。们形成的碱基配对比较稳定。们形成的碱基配对比较稳定。第二十二张，PPT共八十六页，创作于2022年6月引物设计的基本原则引物设计的基本原则l l3.3.引物引物55末端的碱基无严格限制末端的碱基无严格限制l l当当引引物物的的长长度度足足够够时时,引引物物5 5末末端端的的碱碱基基可可不不与与模模板板DNADNA互互补补而而呈呈游游离离状状态态。可可在在5 5端端加加上上限限制制内内切切酶酶位位点点,启启动动子子序序列列或或其其他他序序列列等等,以以便于便于PCRPCR产物的分析克隆。产物的分析克隆。第二十三张，PPT共八十六页，创作于2022年6月引物设计的基本原则引物设计的基本原则l l4.4.在一个在一个PCRPCR反应中的一对引物之间不应存反应中的一对引物之间不应存在互补序列在互补序列,特别是特别是33末端应尽量避免互补末端应尽量避免互补,以免形成以免形成“引物二聚体引物二聚体”造成引物浪费和造成引物浪费和非特异性的扩增非特异性的扩增.l l5.5.每个引物的内部应尽量避免形成二级结构每个引物的内部应尽量避免形成二级结构,特别是引物的末端应无回文结构特别是引物的末端应无回文结构.第二十四张，PPT共八十六页，创作于2022年6月引物设计的基本原则引物设计的基本原则l l(三三)引物的引物的引物的引物的GCGCGCGC含量和含量和含量和含量和TmTmTmTm值值l lPCRPCRPCRPCR引引引引物物物物G+CG+CG+CG+C碱碱碱碱基基基基的的的的含含含含量量量量应应应应保保保保持持持持在在在在45-65%45-65%45-65%45-65%之之之之间间间间，G+CG+CG+CG+C含含含含量量量量一一一一般般般般为为为为40-60%40-60%。其其其其TmTm值值值值是是是是寡寡寡寡核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸的的的的解解解解链链链链温温温温度度度度，即即即即在一定盐浓度条件下，在一定盐浓度条件下，在一定盐浓度条件下，在一定盐浓度条件下，50%50%50%50%寡核苷酸双链解链的温度。寡核苷酸双链解链的温度。寡核苷酸双链解链的温度。寡核苷酸双链解链的温度。l lPCRPCRPCRPCR扩扩扩扩增增增增中中中中的的的的复复复复性性性性温温温温度度度度一一一一般般般般是是是是较较较较低低低低TmTm值值引引物物的的TmTmTmTm值值值值减减减减去去去去5-105-105-105-10度度度度。引引引引 物物物物 长长长长 度度度度 小小小小 于于于于20bp20bp20bp20bp时时,Tm=4(G+C)+2(A+T)Tm=4(G+C)+2(A+T)。第二十五张，PPT共八十六页，创作于2022年6月引物设计的基本原则引物设计的基本原则l l(四四四四)引物的位置引物的位置引物的位置引物的位置l l1.1.1.1.引引引引物物物物的的的的序序序序列列列列应应应应位位位位于于于于基基基基因因因因组组组组DNADNADNADNA的的的的高高高高度度度度保保保保守守守守区区区区，且且且且与与与与非非非非扩扩扩扩增增增增区区区区无无无无同同同同源源源源序序序序列列列列，这这这这样样样样可可可可减减减减少少少少引引引引物物物物与与与与基基基基因因因因组的非特异结合，提高反应的特异性。组的非特异结合，提高反应的特异性。组的非特异结合，提高反应的特异性。组的非特异结合，提高反应的特异性。l l2.2.2.2.若若以以cDNAcDNA为为模模板板，则则首首先先应应尽尽量量使使引引物物和和产产物物保保持持在在mRNAmRNAmRNAmRNA的的的的编编编编码码码码区区区区域域域域内内内内；其其其其次次次次，尽尽尽尽量量量量把把把把引引引引物物物物放放放放在在在在不不不不同同同同的的的的外外外外显显显显子子子子上上上上，以以以以便便便便使使使使特特特特异异异异的的的的PCRPCRPCRPCR产产产产物物物物与与与与从从从从污污污污染染染染DNADNADNADNA中产生的产物在大小上相区别。中产生的产物在大小上相区别。第二十六张，PPT共八十六页，创作于2022年6月引物设计的基本原则引物设计的基本原则l l（五五五五)Primer)Primer)Primer)Primer primer primer primer primer 5.05.05.05.0辅辅辅辅助助助助的的的的引引引引物物物物设设设设计计计计步步步步骤骤骤骤及及及及条条条条件优化件优化件优化件优化第二十七张，PPT共八十六页，创作于2022年6月第二部分第二部分RT-PCR第二十八张，PPT共八十六页，创作于2022年6月RT-PCRl l是是将将RNA反反转转录录和和PCR结结合合起起来来建建立立的的一一种种PCR技技术术。首首先先进进行行反反转转录录产产生生cDNA，然然后后进行常规进行常规PCR。第二十九张，PPT共八十六页，创作于2022年6月cDNA合成合成lSuperscriptfirst-strandsynthesissystem for RT-PCR 是是从从总总RNA或或mRNA合成合成cDNA。lRNA量为量为1ng5ug。第三十张，PPT共八十六页，创作于2022年6月Reverse Transcriptase553353351.依依赖赖于于RNA的的53DNA聚聚合合酶酶活活性性（反反转录活性）；转录活性）；2.依赖于依赖于DNA的的53DNA聚合酶活性。聚合酶活性。第三十一张，PPT共八十六页，创作于2022年6月Reverse TranscriptaseRNADNADNA3.RNaseH活活性性：特特异异性性识识别别并并分分解解RNA-DNA杂交体中的杂交体中的RNA链链第三十二张，PPT共八十六页，创作于2022年6月RT-PCR 第三十三张，PPT共八十六页，创作于2022年6月用用M-MuLV反转录酶（反转录酶（RNase H-）进）进行行cDNA第一链的合成第一链的合成 l lRNaseH缺缺缺缺陷陷陷陷型型型型莫莫莫莫洛洛洛洛尼尼尼尼氏氏氏氏鼠鼠鼠鼠白白白白血血血血病病病病病病病病毒毒毒毒（M-MuLVM-MuLV）反反反反转转转转录录录录酶酶酶酶是是是是一一一一种种种种RNA介介导导的的DNADNA聚聚合合酶酶。该该酶酶能能以以RNARNA或或或或者者者者单单单单链链链链DNADNA做做做做模模模模板板板板由由由由引引引引物物物物起起起起始始始始合合合合成成成成一一一一个个个个互互互互补补补补的的的的DNADNA链链链链。RNaseRNaseHH活活活活性性性性的的的的缺缺缺缺失失失失增增增增强强强强了了了了该该该该酶酶酶酶合合合合成成成成长长长长链链链链cDNAcDNA的的能能力。力。l l编编编编码码码码M-MuLVM-MuLV反反转转录录酶酶的的基基因因在在重重组组大大肠肠杆杆菌菌中中表表达达，该该酶酶在在其其RNaseRNaseHH区区区区域域域域含含含含一一一一点点点点突突突突变变变变，从从从从而而而而使使使使修修修修饰饰饰饰后酶的后酶的后酶的后酶的RNaseRNase活性缺失，但反转录功能不受影响。活性缺失，但反转录功能不受影响。活性缺失，但反转录功能不受影响。活性缺失，但反转录功能不受影响。第三十四张，PPT共八十六页，创作于2022年6月用用M-MuLV反转录酶（反转录酶（RNase H-）进）进行行cDNA第一链的合成第一链的合成 l l进行进行PCR前用前用RnaseH消化。消化。去除与去除与去除与去除与cDNAcDNA结合的结合的结合的结合的RNARNA，增加，增加PCRPCR敏感性。敏感性。敏感性。敏感性。第第第第一一一一链链链链合合合合成成成成过过过过程程程程中中中中RNaseRNaseHH降降降降解解解解模模模模板板板板mRNAmRNA，导导致致全长全长cDNA合成减少及合成减少及合成减少及合成减少及cDNAcDNA第一链产量降低。第一链产量降低。第一链产量降低。第一链产量降低。第三十五张，PPT共八十六页，创作于2022年6月cDNA第一链的合成有三个方法第一链的合成有三个方法 l l（1）Randomhexamers：是是最最非非特特异异性性引引物物。通通常常在在特特异异全全长长mRNA难难以以拷拷贝贝时时应应用用此此引引物物。利利用用该该方方法法，以以全全部部RNA做做模模板板合合成成cDNA。在在PCR时时，PCR引引物物决决定定其其特特异异性。性。第三十六张，PPT共八十六页，创作于2022年6月cDNA第一链的合成有三个方法第一链的合成有三个方法l（2）oligo（dT）：较较特特异异和和常常见见的的方方法法,其其cDNA的的合合成成数数量量和和复复杂杂性性大大大大低低于于random hexamers方方法法,尤尤其其是是进进行行新新的的mRNART-PCR时时,建议用此方法建议用此方法.第三十七张，PPT共八十六页，创作于2022年6月cDNA第一链的合成有三个方法第一链的合成有三个方法l l(3)Gene-specificprimer(GSP):最最为为特特异异的的方方法法。利利用用邻邻近近mRNA3末末端端的的PCR引引物物进进行行cDNA第第一一链链合合成成,但但是是,某某些些GSP即即使使以以DNA为为模模板板,能能扩扩增增出出DNA条条带带.有有时时,也也不不能能进进行行cDNA第第一一条条链链合合成成.此此时时建建议议用用oligo（dT）引物）引物.第三十八张，PPT共八十六页，创作于2022年6月cDNAcDNA第一条链合成步骤第一条链合成步骤第三十九张，PPT共八十六页，创作于2022年6月第四十张，PPT共八十六页，创作于2022年6月第三部分克隆第三部分克隆第四十一张，PPT共八十六页，创作于2022年6月RNARNA提取纯化提取纯化提取纯化提取纯化RT-PCRRT-PCR质粒质粒质粒质粒DNADNAPCRPCR凝胶回收凝胶回收凝胶回收凝胶回收PCRPCR扩增片段扩增片段扩增片段扩增片段目目目目的的的的基基基基因因因因片片片片段段段段T-AT-A克隆克隆克隆克隆转化感受态细胞转化感受态细胞转化感受态细胞转化感受态细胞蓝白斑筛选蓝白斑筛选蓝白斑筛选蓝白斑筛选质粒提取、酶切鉴定质粒提取、酶切鉴定质粒提取、酶切鉴定质粒提取、酶切鉴定连连连连 入入入入GSTGST融融融融 合合合合表达载体表达载体表达载体表达载体外外外外源源源源基基基基因因因因克克克克隆隆隆隆到到到到真核表达载体真核表达载体真核表达载体真核表达载体GSTGST融合蛋白表达融合蛋白表达融合蛋白表达融合蛋白表达转化、活性测定转化、活性测定转化、活性测定转化、活性测定转染真核细胞转染真核细胞转染真核细胞转染真核细胞表达定位表达定位表达定位表达定位得得得得到到到到目目目目的的的的基基基基因因因因片片片片段段段段的的的的T-AT-A克隆克隆克隆克隆第四十二张，PPT共八十六页，创作于2022年6月PCR片段回收片段回收l l利用从琼脂糖凝胶中回收纯化利用从琼脂糖凝胶中回收纯化DNA片段的片段的试剂盒。试剂盒采用了独特的凝胶融解系试剂盒。试剂盒采用了独特的凝胶融解系统，结合统，结合DNA制备膜技术，具有高效快速的制备膜技术，具有高效快速的特点。本试剂盒纯化特点。本试剂盒纯化DNA片段纯度高，完整片段纯度高，完整性好。可直接用于连接反应，性好。可直接用于连接反应，PCR扩增。扩增。第四十三张，PPT共八十六页，创作于2022年6月第四十四张，PPT共八十六页，创作于2022年6月T-A克隆克隆l l经经TaqDNA聚聚合合酶酶扩扩增增后后的的PCR产产物物末末端端都都带带有有单单个个A。正正是是基基于于这这一一原原理理，pGEM-T质质粒粒经经EcoRV切切成成平平端端后后，在在开开口口端端加加上上一一个个T制制成成T载载体体，一一方方面面避避免免了了自自身身环环化化，另另一一方方面面由由于于T-A互互补补，提提高高了了T载载体体与与PCR产产物物之间的连接效率。之间的连接效率。第四十五张，PPT共八十六页，创作于2022年6月第四十六张，PPT共八十六页，创作于2022年6月第四十七张，PPT共八十六页，创作于2022年6月T-Vector第四十八张，PPT共八十六页，创作于2022年6月转化感受态细胞转化感受态细胞 l l转化过程所用的受体细胞：限制修饰酶系统缺陷转化过程所用的受体细胞：限制修饰酶系统缺陷转化过程所用的受体细胞：限制修饰酶系统缺陷转化过程所用的受体细胞：限制修饰酶系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（变体（变体（变体（RR，MM）。）。）。）。l l它可以容忍外源它可以容忍外源DNADNA分子进入体内并稳定地遗传给分子进入体内并稳定地遗传给分子进入体内并稳定地遗传给分子进入体内并稳定地遗传给后代。后代。后代。后代。l l受受受受体体体体细细细细胞胞胞胞经经经经过过过过一一一一些些些些特特特特殊殊殊殊方方方方法法法法（如如如如电电电电击击击击法法法法，CaClCaCl2 2）处处处处理理理理后后后后，细细细细胞胞胞胞膜膜膜膜的的的的通通通通透透透透性性性性发发发发生生生生了了了了暂暂暂暂时时时时性性性性的的的的改改改改变变变变，成成成成为为为为 能能能能 允允允允 许许许许 外外外外 源源源源 DNADNA分分 子子 进进 入入 的的 感感 受受 态态 细细 胞胞（CompetentcellsCompetentcells）。第四十九张，PPT共八十六页，创作于2022年6月转化感受态细胞转化感受态细胞 l l进入受体细胞的进入受体细胞的进入受体细胞的进入受体细胞的DNADNA分子通过复制，表达实现遗传分子通过复制，表达实现遗传分子通过复制，表达实现遗传分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（选出转化子（选出转化子（选出转化子（Transformant），即带有异源），即带有异源DNADNA分子的受体细胞分子的受体细胞分子的受体细胞分子的受体细胞。第五十张，PPT共八十六页，创作于2022年6月T-Vector第五十一张，PPT共八十六页，创作于2022年6月进行蓝白筛选，对阳性克隆进行扩增进行蓝白筛选，对阳性克隆进行扩增 IPTG(IPTG(IPTG(IPTG(异丙基异丙基-半乳糖苷半乳糖苷）是）是）是）是-半乳糖苷半乳糖苷半乳糖苷半乳糖苷酶酶酶酶活性的活性的活性的活性的诱导诱导诱导诱导物物物物,可使可使lacZ lacZ lacZ lacZ 阻抑物失活，从而诱导阻抑物失活，从而诱导阻抑物失活，从而诱导阻抑物失活，从而诱导laclaclaclac操纵子转操纵子转操纵子转操纵子转录。录。录。录。基于基于这这个特性个特性,当当当当PUCPUCPUCPUC系列系列系列系列载载载载体以体以体以体以lacZlacZlacZlacZ缺欠缺欠缺欠缺欠细细细细胞作胞作胞作胞作为为为为宿主宿主宿主宿主进进进进行行行行转转转转化化化化时时时时,如果在培养基中加入如果在培养基中加入如果在培养基中加入如果在培养基中加入X-GalX-GalX-GalX-Gal和和和和IPTG,IPTG,IPTG,IPTG,由由由由于于于于-半乳糖苷半乳糖苷半乳糖苷半乳糖苷酶酶酶酶的的的的-互互互互补补补补性性性性,可以根据是否呈可以根据是否呈可以根据是否呈可以根据是否呈现现现现白色而白色而白色而白色而方便的方便的方便的方便的选择选择选择选择出基因重出基因重出基因重出基因重组组组组体体体体.第五十二张，PPT共八十六页，创作于2022年6月进行蓝白筛选，对阳性克隆进行扩增进行蓝白筛选，对阳性克隆进行扩增 X-gal:(5-溴溴-4氢氢-3-吲哚吲哚-D-半乳糖苷半乳糖苷)X-gal是是E.Coli产生的产生的-半乳糖苷酶的显半乳糖苷酶的显色底物。色底物。-半乳糖苷酶可将半乳糖苷酶可将X-gal转变为不溶性转变为不溶性的深蓝色沉淀。的深蓝色沉淀。第五十三张，PPT共八十六页，创作于2022年6月进行蓝白筛选，对阳性克隆进行扩增进行蓝白筛选，对阳性克隆进行扩增 l双双链链pGEM-T质质粒粒，有有一一个个复复制制起起点点，一一个个氨氨苄苄青青霉霉素素抗抗性性基基因因和和一一个个多多克克隆隆位位点点，多多克克隆隆位位点点处处于于表表达达LacZ基因产物基因产物-半乳糖苷酶的氨基端片段。半乳糖苷酶的氨基端片段。l用用质质粒粒转转化化LacZ基基因因突突变变的的大大肠肠杆杆菌菌株株（JM109或或DH5）时时，因因为为由由质质粒粒表表达达的的-肽肽补补充充了了大大肠肠杆杆菌菌缺缺失失的的-肽肽，所以恢复了分解半乳糖的能力。所以恢复了分解半乳糖的能力。第五十四张，PPT共八十六页，创作于2022年6月进行蓝白筛选，对阳性克隆进行扩增进行蓝白筛选，对阳性克隆进行扩增 在在加加入入IPTG和和X-gal的的培培养养基基上上，长长出出蓝蓝色色克克隆隆。如如果果在在多多克克隆隆位位点点内内插插入入外外源源DNA，由由于于它它破破坏坏了了-肽肽的的表表达达，因因而而在在加加入入IPTG和和X-gal的的培培养养基基，不不能能长长出出蓝蓝色色克克隆隆，这就是所谓的蓝白筛选。这就是所谓的蓝白筛选。第五十五张，PPT共八十六页，创作于2022年6月质质粒粒的的提提取取及及酶酶切切鉴鉴定定第五十六张，PPT共八十六页，创作于2022年6月第五十七张，PPT共八十六页，创作于2022年6月第四部分：外源基因的原核表达第四部分：外源基因的原核表达第五十八张，PPT共八十六页，创作于2022年6月外源基因的原核表达外源基因的原核表达 l l外外源源基基因因的的表表达达是是研研究究和和探探索索基基因因功功能能、基基因因表表达达调调控控机机制制以以及及编编码码蛋蛋白白质质的的结结构构和和功功能能的的重重要要方方法法，亦亦是是制制备备和和生生产产新新型型蛋蛋白白质质药药物物、新新型型诊诊断断试试剂剂必必不不可可少少的的手手段段。外外源源基基因因通通过过在在宿宿主主细细胞胞中中的的表表达达可可大量获得其产物。大量获得其产物。第五十九张，PPT共八十六页，创作于2022年6月一、原核表达系统常用的载体及一、原核表达系统常用的载体及其应用其应用 l l（一）大肠杆菌表达系统（一）大肠杆菌表达系统l l（二）大肠杆菌载体的表达方式（二）大肠杆菌载体的表达方式第六十张，PPT共八十六页，创作于2022年6月大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统 l l大肠杆菌表达系统是目前应用最广泛的经大肠杆菌表达系统是目前应用最广泛的经典表达系统。典表达系统。l优点：优点：l l遗传背景清晰、目的基因表达水遗传背景清晰、目的基因表达水平高、培养周期短等；平高、培养周期短等；第六十一张，PPT共八十六页，创作于2022年6月大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统 l缺点：缺点：l l缺少真核生物的蛋白翻译后修缺少真核生物的蛋白翻译后修饰和加工过程，如剪切、糖基化饰和加工过程，如剪切、糖基化及正确二硫键的形成等；及正确二硫键的形成等；l l表达的蛋白质多以包含体形式存表达的蛋白质多以包含体形式存在，需经复性才能恢复构象与活性；在，需经复性才能恢复构象与活性；l l宿主本身杂蛋白多，纯化步骤复宿主本身杂蛋白多，纯化步骤复杂。杂。第六十二张，PPT共八十六页，创作于2022年6月大肠杆菌载体的表达方式大肠杆菌载体的表达方式 l1非非融融合合性性表表达达载载体体：此此种种载载体体表表达达的的蛋蛋白白质质与与天天然然状状态态下下存存在在的的蛋蛋白白质质在在结结构构、功功能能和和免免疫疫源源性性等等方方面面基基本本或或完完全一致。全一致。第六十三张，PPT共八十六页，创作于2022年6月大肠杆菌载体的表达方式 2融合表达载体：分子量较小的蛋白质可采用融合表达载体：分子量较小的蛋白质可采用这种载体进行表达。这种载体进行表达。优点：优点：可增加可增加可增加可增加mRNAmRNAmRNAmRNA和表达产物的稳定性；和表达产物的稳定性；和表达产物的稳定性；和表达产物的稳定性；可应用针对融合蛋白中非目的蛋白片段可应用针对融合蛋白中非目的蛋白片段可应用针对融合蛋白中非目的蛋白片段可应用针对融合蛋白中非目的蛋白片段进行亲进行亲进行亲进行亲和层析，很容易将融合蛋白纯化；和层析，很容易将融合蛋白纯化；和层析，很容易将融合蛋白纯化；和层析，很容易将融合蛋白纯化；通过融合表达可产生可溶性蛋白；通过融合表达可产生可溶性蛋白；通过融合表达可产生可溶性蛋白；通过融合表达可产生可溶性蛋白；第六十四张，PPT共八十六页，创作于2022年6月大肠杆菌载体的表达方式 融合表达载体融合表达载体主要有以下几种：主要有以下几种：谷胱甘肽谷胱甘肽-S-S-转移酶（转移酶（转移酶（转移酶（GSTGSTGSTGST）系统；）系统；-半乳糖苷酶系统；半乳糖苷酶系统；半乳糖苷酶系统；半乳糖苷酶系统；麦芽糖结合蛋白（麦芽糖结合蛋白（麦芽糖结合蛋白（麦芽糖结合蛋白（MBPMBPMBPMBP）系统；）系统；蛋白蛋白蛋白蛋白A A A A系统；系统；系统；系统；与纯化标签融合表达以及其他融合系统。与纯化标签融合表达以及其他融合系统。与纯化标签融合表达以及其他融合系统。与纯化标签融合表达以及其他融合系统。第六十五张，PPT共八十六页，创作于2022年6月大肠杆菌载体的表达方式大肠杆菌载体的表达方式 l l3带带纯纯化化标标签签的的表表达达载载体体：目目前前应应用用较较多多的纯化标签有的纯化标签有GST-tag,FLAG-tag,His-tag.l l4分泌型表达载体分泌型表达载体l l5表面展示表达载体表面展示表达载体l l6带分子伴侣的表达载体带分子伴侣的表达载体第六十六张，PPT共八十六页，创作于2022年6月外外外外源源源源基基基基因因因因的的的的原原原原核核核核表表表表达达达达载载载载体体体体构构构构建建建建及及及及转转转转化化化化第六十七张，PPT共八十六页，创作于2022年6月扩增阳性克隆并进行诱导表达扩增阳性克隆并进行诱导表达 l lpGEX-5x-1载体带有载体带有IPTG（异丙基（异丙基-D-硫代半乳糖苷）诱导启动子，可以表达外硫代半乳糖苷）诱导启动子，可以表达外源蛋白的总量可以达到全菌蛋白的源蛋白的总量可以达到全菌蛋白的30%以以上。上。第六十八张，PPT共八十六页，创作于2022年6月SDS-PAGE电泳电泳 l l将含有目标蛋白的样品用将含有目标蛋白的样品用SDS-聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝胶电泳（胶电泳（SDS-PAGE）分离。利用浓缩胶和分）分离。利用浓缩胶和分离胶的浓缩效应，电荷效应和分子筛效应对不离胶的浓缩效应，电荷效应和分子筛效应对不同分子量大小的蛋白质进行分离。同分子量大小的蛋白质进行分离。第六十九张，PPT共八十六页，创作于2022年6月第七十张，PPT共八十六页，创作于2022年6月Western BlotGST-Pro-BGST第七十一张，PPT共八十六页，创作于2022年6月RNARNA提取纯化提取纯化提取纯化提取纯化RT-PCRRT-PCR质粒质粒质粒质粒DNADNAPCRPCR凝胶回收凝胶回收凝胶回收凝胶回收PCRPCR扩增片段扩增片段扩增片段扩增片段目目目目的的的的基基基基因因因因片片片片段段段段T-T-A A克隆克隆克隆克隆转化感受态细胞转化感受态细胞转化感受态细胞转化感受态细胞蓝白斑筛选蓝白斑筛选蓝白斑筛选蓝白斑筛选质粒提取、酶切鉴定质粒提取、酶切鉴定质粒提取、酶切鉴定质粒提取、酶切鉴定连连连连入入入入GSTGST融融融融合合合合表表表表达载体达载体达载体达载体外外外外源源源源基基基基因因因因克克克克隆隆隆隆到到到到真核表达载体真核表达载体真核表达载体真核表达载体GSTGST融合蛋白表达融合蛋白表达融合蛋白表达融合蛋白表达转化、活性测定转化、活性测定转化、活性测定转化、活性测定转染真核细胞转染真核细胞转染真核细胞转染真核细胞表达定位表达定位表达定位表达定位得得得得到到到到目目目目的的的的基基基基因因因因片片片片段的段的段的段的T-AT-A克隆克隆克隆克隆第七十二张，PPT共八十六页，创作于2022年6月l lNorthern印迹杂交是用于检测和量化细胞印迹杂交是用于检测和量化细胞RNA的一种基本技术。它主要是将电泳凝胶的一种基本技术。它主要是将电泳凝胶中的中的RNA转移到尼龙膜上，通过紫外交联作转移到尼龙膜上，通过紫外交联作用而使用而使RNA与膜永久的结合在一起，固定在与膜永久的结合在一起，固定在膜上的膜上的RNA样品与特异的探针