《现代应用微生物技术》课程考核资料讲解.doc
Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。现代应用微生物技术课程考核-现代应用微生物技术课程考核题目：微生物技术在污水处理上的应用院系：潇湘学院姓名：韩月刚学号：1154030115专业：电子信息工程班级：一班授课教师：李会东信息与电气工程学院通信工程系2014.05-微生物技术在污水处理上的应用自1882年首次进行向污水中鼓入空气的试验后,微生物污水处理技术就作为一种独立的工艺方法在污水处理领域中占有重要地位4。它以成本低,出水水质较好,且污泥肥分高等优点,而被世界各国广泛采用。微生物污水处理技术是利用微生物代谢作用中产生的酶,来氧化分解有机污染物,从而达到净化污水的目的1,2。随着污泥膨胀、脱磷脱氮效率降低等问题的不断出现,促使人们对该体系中微生物的复杂群体结构与系统运转工艺之间的关系产生了浓厚的兴趣。然而,传统的微生物分离培养方法不能满足微生物原位识别及形态学研究的需要,并且在多样性和动力学研究方面还存在着严重的局限性:培养过程复杂耗时;只能反映显微镜条件下极少部分(<10%)的菌落数。近10年发展起来的以分子生物学方法为基础的分子生态学,大大拓宽了微生物生态学的研究视野,使之可以更客观、更直接地探讨微生物种群结构、遗传多样性及其与环境间的相互关系3。有关污水处理技术中微生物的研究起步较晚,且受到传统方法的束缚,直到20世纪80年代才出现应用分子生态学方法来研究污水处理系统中微生物群体的实例。目前,有关该系统中微生物的多样性、系统发育地位、种群结构以及与功能的相关性都成为该领域的研究热点。2rDNA序列同源性分析的应用长期以来,人们只能通过纯培养技术来研究污水处理系统中的微生物。但自然环境中的微生物有9915%9919%的种类是不可培养的27,而对于污水处理系统中的微生物,即使用最优化的培养基也只能复原其中的1%15%,某些特定种类还要选择特殊的培养基17,28,且培养过程复杂耗时。这为正确认识该系统中微生物的特性及系统发育地位带来了极大的困难。由于rRNA素有“细菌化石”之生态学杂志ChineseJournalofEcology2003,22(3):4953称,可作为生物进化史的计时器因此,以rDNA序列同源性分析为基础的微生物系统发育学研究在微生物分子生态学中已突显其重要性,其中以16SrD2NA序列分析较为常用。211Eikelboom菌群丝状菌在污水处理系统中的作用具有两面性,适当浓度的丝状菌对于絮凝物的形成是有益的,但其过度繁殖又是引起污泥膨胀的主要原因。目前,人们对于污水处理系统中丝状菌的特性了解还仅限于形态学方面,检测手段还以纯培养技术和染色技术为主,这对于丝状菌种类的正确识别、数量的合理控制都是不合适的。活性污泥中的大多数丝状菌在形态上是有别于以往已被鉴定的细菌,目前暂时使用类型号进行分类,如Eikelboom型0041,1701,021N等。同时,这些丝状菌的形态随环境的不同而变化很大,这为快速准确预报污泥膨胀的发生带来了极大不便。因此,16SrDNA序列同源性分析作为一种更为可靠的原位识别方法就自然而然地应用于污水处理系统中特殊类群微生物的研究。2000年,日本的Takahiro等26对所分离的15丝状菌进行了形态学、生理学及16SrDNA序列分析,认为这些在形态学上应归类为Eikelboom型021N菌群的菌株与丝硫细菌属(Thiothrix)的形态特征截然不同。通过比较各菌株的16SrDNA序列,发现可将它们分为三个进化类群,而G2C含量和16SrRNA序列与丝硫细菌属相似,与丝硫细菌属同属于变形杆菌纲(Proteobacteria)的2亚纲,从而肯定了Howarth等14提出的在形态学上归为Eikelboom型021N菌群的微生物包括几种不同基因型的观点,并建议修改丝硫细菌属的分类定义,将021N菌群归类其中。而Nielsen等20的研究也表明活性污泥中大约有5%10%的细菌属于丝硫细菌属。这些信息的获得为原位识别有益丝状菌提供了分类学上的依据,也为核酸探针的选择与设计补充了必要的资料。212“G”细菌除磷率下降是污水处理系统中生物除磷阶段经常会遇到的问题。然而,在一个设计良好并已排除外干扰的试验室规模的生物除磷反应器中,也会出现类似的问题。通过观察发现:在厌氧阶段,这些反应器中一种能利用有机底物但不释放磷的特殊类型微生物常占据优势19。Cech等9在以葡萄糖作为唯一碳源的生物除磷反应器中发现并分离到了该微生物,且暂时命名为“G”细菌“(G”bacteria)。在电子显微镜下观察,它是一种呈聚合状态的球菌,属于古细菌界,可以在有氧或无氧系统中以甲酸盐或乙酸盐为底物生长。由于在生物除磷反应器中,它是以多糖代替多聚磷酸盐作为最初的能量储备形式,因此,对除磷率的提高不起作用,相反,它与多聚磷积累菌(polyphosphateaccumulatingbacteria)竞优势菌的地位,使得多聚磷积累菌的数量降低,从而导致了除磷率的降低8。由于它经常与多聚磷积累菌伴随出现在生物除磷体系中,而有关该菌确切的生理生化特征及其在污水处理系统中的作用还不完全清楚。Maszenan等18利用16SrDNA序列同源性分析方法并综合其它表型特征,确定了“G”细菌的分类地位。发现所分离的菌株和Cech等8分离到的菌株无论在形态及生理特性上,还是在16SrDNA序列同源性上都存在着极高的相似性,与以往鉴定的序列不同,因此,认为它们属于一个新属,定名为Amaricoccus,属于变形杆菌纲的-亚纲。因此,称其为“G”细菌是毫无实际意义的。由此可见,16SrDNA序列同源性分析在确定新物种的分类地位上具有不可替代的作用。3核酸探针杂交技术的应用传统的纯培养技术在定量测定污水处理系统中微生物数量上存在着极大的偏差,而核酸探针杂交技术既弥补了传统方法不能进行原位测定的不足,又克服了免疫探针只能用于纯培养微生物以及絮凝物阻止抗体作用靶细胞的缺陷,而被广泛应用于污水处理系统中微生物生态学的研究5。Wagner等29首次利用核酸探针杂交技术对活性污泥中的微生物群落结构进行了分析,利用4种特异性核酸探针(变形杆菌纲,2亚纲和细菌域)与活性污泥中的微生物进行全细胞杂交,再通过落视荧光显微镜(epifluorescencemicroscope)进行定量分析,发现活性污泥中处于支配地位的微生物分属于变形杆菌纲,和-亚纲,大约占活菌量的80%。这是第一次在类群水平上对活性污泥中微生物群落结构进行原位分析。由于核酸探针杂交技术的研究与微生物数量及微生物活性间存在一定的数学关系,可以建立相应的微生物生长底物关系模型22。因此,通过设计专一性的核酸探针来快速灵敏地检测出研究对象50生态学杂志第22卷第3期的核酸序列,并利用光密度测定法所得的定量结果反映相关微生物的存在及功能。以16SrRNA或23SrRNA为探针的杂交技术在目前的许多研究中获得了成功,但是,对于某些特殊的微生物群体,如低rRNA含量但具代谢活性的微生物21和高rRNA残留量但不具代谢活性的微生物23,29,就不起作用。因此,有人提出使用前导16SrRNA作为探针进行杂交16。Cangelosi等6的研究证实了使用大肠杆菌前导16SrRNA为探针检测自然环境中细菌生长状况比16SrRNA探针更灵敏且可行,建议使用这种可以量化rRNA水平的探针前导16SrRNA探针来检测细胞的生长活性。因此,Daniel等10将该技术引入污水处理系统中的原位检测。他们选择了具有高效除磷效果的不动杆菌(Acinetobacter)为研究对象,报道了其前导16SrRNA序列结构及特性,并设计了相应的核酸探针,以此作为污水处理系统中评价该方法的模式体系。他们分别用16SrRNA和前导16SrRNA为探针来监控纯培养条件下醋酸钙不动杆菌(A1calcoaceticus)的生长变化情况:发现前导16SrRNA的水平在醋酸钙不动杆菌对数生长阶段的前期快速增长,末期开始下降;而16SrRNA的水平在对数生长阶段的中后期达到最高,下降趋势贯穿整个稳定期。这说明了前导16SrRNA检测细菌生长变化的高灵敏性。然而,当醋酸钙不动杆菌从LB培养基转移至过滤污水中培养时,前导16SrRNA表现出显著的不均一性,说明该方法的使用要针不同菌采用不同的策略。由此可见,以16SrRNA前体为探针的核酸原位杂交技术在测定微生物生长活性方面是有发展前途的,但仍需有更多的有关rRNA加工过程及不同环境微生物的前导16SrRNA文库的资料。目前,可直接利用的核酸探针序列虽很多,但荧光原位杂交法(FISH)定量的手段却还停留在荧光显微镜下人工计数的阶段25,30。这不仅费时且杂交细胞的数量受到限制(仅限于几千个),还需要有高放大倍数的共焦激光扫描显微镜(CLSM)。Hol2ger等13为弥补以上不足之处,综合运用FISH法、CLSM和数字图像分析等方法,设计了一套半自动测定污水处理系统中氨氧化菌浓度的方案:向样品中掺入不同浓度的大肠杆菌(Escherichiacoli)细胞,并利用特定的核酸探针对掺入大肠杆菌(E)和未掺入大肠杆菌(UE)的样品进行荧光原位杂交;利用数字图像分析不同的样品,折算出面积比;从UE样品的面积比中扣除E样品的面积比,将所得各点绘制成双对数曲线图,并求出回归方程;根据公式将等价的大肠杆菌浓度折算成氨氧化菌的真实浓度。这一方案为污水处理系统中微生物数量的确定提供了一个既便捷且准确性高的途径。4PCR扩增技术的应用自PCR技术发明以来,因其可快速灵敏地扩增特异性DNA或RNA,而被广泛应用。其中较常用的PCR技术有:常规PCR、反转录PCR(RT2PCR)、竞争性PCR(Competitive2PCR)、定量PCR(Quanti2tative2PCR)、槽式PCR(Nested2PCR)、任意扩增长度多态性(RAPD)、扩增的rDNA限制性酶切分析(ARDRA)等。目前,应用PCR技术研究污水处理系统中的微生物主要集中在以下两个方面:411检测体系中特定微生物和特定基因不动杆菌属中的微生物在自然界中普遍存在,其中一些是危害严重的流行病病原菌,受到医学界的高度重视;另一些因具有高效除磷效果而在除磷系统中广泛应用。但这些可以应用的不动杆菌无论在形态还是在生理特征上都与摩拉克氏菌属(Moraxella)、布兰汉氏菌属(Brannamelld)和奈瑟氏菌属(Neisseria)等有许多相似之处12,给识别与检测带来了诸多不便。1994年,有人31利用常规的PCR指纹技术识别并区分了不同种的不动杆菌。由于这一方法具有可重复性且快速的特点,使得它逐步代替了传统的DNA2DNA杂交识别方法。Carr等7利用RAPD指纹技术对照分析了生物除磷系统中的不动杆菌与医学上描述的该属中其它菌间的不同,发现它们在外形和染色体组成上都存在着差异。因此,建议重新修订不动杆菌属的分类地位,以适应非医学菌株的需要。这对于改变不动杆菌属中各菌专属医学界应用的传统错误认识具有重大意义。另外,该研究结果也暗示在不同的处理系统中不动杆菌菌群具有特异性,这为细菌分类学和生物多样性研究提供了很好的研究对象。RT2PCR具有不需构建和筛选cDNA文库就能直接克隆cDNA产物的优点,可直接用于检测转录产物,分析基因表达水平。Selvaratnam等24利用该方法首次报道了dmpN基因在降解苯酚的序批式间歇反应器(SBR)中的表达情况。他们利用RT2PCR原位跟踪了dmpN基因转录水平的上升和下张倩茹等:微生物分子生态学技术应用于污水处理系统的研究进展51降阶段,发现反应器中苯酚的浓度以及最初阶段的通风都可以激发dmpN基因的转录活性,而且也发现了dmpN基因转录水平从未降低到零的现象。这为调整SBR的操作流程以增强系统中微生物的代谢活性,选择合适时机添加底物或特定微生物都提供了可靠的依据。412量化体系中微生物群体的各组成成员美国的Dionisi等11首次利用竞争性PCR对污水处理系统中的硝化螺菌(Nitrospiraspp1)和隶属于硝化螺菌属的亚硝酸盐氧化菌(nitrite-oxidizinbacteria)进行了定量描述。由于以硝化螺菌的16SrDNA为引物会导致非硝化菌序列被共同扩增,设计了对amoA基因(编码氨单加氧酶活性部位)具有特异性的引物,并对amoA基因和硝化螺菌的16SrDNA进行了竞争性PCR扩增,再通过对两者数据的分析比较计算出了各菌群的数量。同时,从试验结果中也可以清楚的看到硝化细菌群落中亚硝酸盐氧化菌占据着优势地位。虽然目前可进行定量测定的方法有很多,但由于活性污泥中絮状物过多很难使用,而该技术的运用恰恰克服了这一点。而且,还具有灵敏性高、定量准确等优点,特别适合于活性污泥中待测微生物含量极低的情况。结语污水处理系统作为特殊的微生物区系,其微生物间的共生关系及其对污水处理的作用已越来越受到广泛的关注,而运用分子生态学方法对其进行分析已成为目前水处理研究的热点。这势必会推动分子生态学的发展,也为微生物分类与生物多样性研究提供了宝贵的资料。但在实际工作中,单一的分子生态学方法并不能完全达到预定的要求,需要综合运用多种分子生态学手段,有时甚至要结合传统方法,才有可能对复杂的微生态系统进行全面的分析和研究。1998年,Juretschko等15综合运用传统的富集分离培养技术以及核酸探针原位杂交、16SrDNA序列分析和PCR扩增等现代分子生物学技术对活性污泥中硝化细菌的生物多样性进行了分析,这些方法的联合使用不但可以精确地对群体中的硝化细菌进行直接计数,而且还可以同时分析该类菌的分布情况。这样的策略弥补了各方法间的不足,也为大型处理系统的设计提供了重要的参数指标。
