分子荧光光谱法PPT课件.ppt

关于分子荧光光谱法第一张，PPT共二十八页，创作于2022年6月 分子荧光光谱法又称分子发光光谱法或分子荧光光谱法又称分子发光光谱法或荧光分光光度法，即通常所谓的荧光分析法。荧光分光光度法，即通常所谓的荧光分析法。该法是一种利用某一波长的光线照射试样，该法是一种利用某一波长的光线照射试样，使试样吸收这一辐射，然后再发射出波长相使试样吸收这一辐射，然后再发射出波长相同或波长较长的光线的化学分析方法。同或波长较长的光线的化学分析方法。定性定性定量定量第二张，PPT共二十八页，创作于2022年6月 分子吸收了紫外分子吸收了紫外-可见光的辐射后，它的电子能级跃迁至激发可见光的辐射后，它的电子能级跃迁至激发态，然后以热能形式将这一部分能量释放出来，本身又回复到态，然后以热能形式将这一部分能量释放出来，本身又回复到基态。如果吸收辐射能后处于电子激发态的分子以发射辐射的基态。如果吸收辐射能后处于电子激发态的分子以发射辐射的方式释放这一部分能量，再发射的波长可以同分子所吸收的波方式释放这一部分能量，再发射的波长可以同分子所吸收的波长相同，也可以不同。长相同，也可以不同。荧光（荧光（Fluorescence）：）：当激发光停止照射后，发光过程几乎立当激发光停止照射后，发光过程几乎立即停止（即停止（10-910-6秒）秒）磷光（磷光（Phosphorescence）：）：将持续一段时间（将持续一段时间（10-310秒）秒）一、光致发光（一、光致发光（Photoluminescent）第三张，PPT共二十八页，创作于2022年6月二、荧光、磷光产生原理二、荧光、磷光产生原理 1、分子的激发态、分子的激发态单重激发态和三重激发态单重激发态和三重激发态 大多数分子含有偶数电子，在基态时，这些电子成对大多数分子含有偶数电子，在基态时，这些电子成对地存在于能量最低的各地存在于能量最低的各 个原子或分子轨道中，根据个原子或分子轨道中，根据Pauli不不相容原理，一个给定轨道中的两个电子，必定具有相反方向相容原理，一个给定轨道中的两个电子，必定具有相反方向的自旋，即自旋量子数分别为的自旋，即自旋量子数分别为1/2、-1/2，电子总自旋量子，电子总自旋量子数等于零：数等于零：S=+(-)=0，即基态没有净自旋，其电子能，即基态没有净自旋，其电子能态的多重性态的多重性 M=2S+1=1(M 为磁量子数为磁量子数)，因此，基态的多，因此，基态的多重性为重性为1，分子是抗（反）磁性的，其能级不受外界磁场影，分子是抗（反）磁性的，其能级不受外界磁场影响而分裂，称响而分裂，称“单重态单重态”；单重态单重态：第四张，PPT共二十八页，创作于2022年6月单重激发态：单重激发态：当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，被激发当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，被激发跃迁到能量较高的轨道上，通常它的自旋方向不改跃迁到能量较高的轨道上，通常它的自旋方向不改变，即两个电子的自旋方向仍相反，总自旋量子数变，即两个电子的自旋方向仍相反，总自旋量子数S=0，M=2S+1=1，则分子处于的激发态仍是单重态，即则分子处于的激发态仍是单重态，即“单重激发态单重激发态”；第五张，PPT共二十八页，创作于2022年6月 如果电子在跃迁过程中，还伴随着自旋方向的改变，如果电子在跃迁过程中，还伴随着自旋方向的改变，这时便具有两个自旋不配对的电子，即两个电子的自旋量这时便具有两个自旋不配对的电子，即两个电子的自旋量子数都为子数都为1/2，电子总自旋量子数不等于零，而等于电子总自旋量子数不等于零，而等于1：S=1/2+1/2=1，其多重性：，其多重性：M=2S+1=3，即分子在磁场即分子在磁场中受到影响而产生能级分裂，这种受激态称为中受到影响而产生能级分裂，这种受激态称为“三重激发三重激发态态”；三重激发态：三重激发态：第六张，PPT共二十八页，创作于2022年6月2、分子去活化过程及荧光的发生、分子去活化过程及荧光的发生 一个分子的外层电子能级包括一个分子的外层电子能级包括 S0（基态）和第（基态）和第1至第至第 n的电子激发的的电子激发的单重激发态单重激发态S1，S2，.Sn，第第1至第至第n的电子激发的三重激发态的电子激发的三重激发态T1.Tn，每个电子能级又包括一系列能量非常接近的振动能级。，每个电子能级又包括一系列能量非常接近的振动能级。分子吸收了紫外分子吸收了紫外-可见光后，基态分子中的电子只能跃迁到激发可见光后，基态分子中的电子只能跃迁到激发单重态的不同振动能级上，根据自旋禁律，不能直接跃迁到激发三重单重态的不同振动能级上，根据自旋禁律，不能直接跃迁到激发三重态的各个振动能级上。态的各个振动能级上。处于激发态的分子不稳定，在较短的时间内可通过不同途径处于激发态的分子不稳定，在较短的时间内可通过不同途径释放多余的能量（辐射或非辐射跃迁）回到基态，这个过程称为释放多余的能量（辐射或非辐射跃迁）回到基态，这个过程称为“去活化过程去活化过程”。第七张，PPT共二十八页，创作于2022年6月1.振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞，把一部分能量以热的形式剂分子间发生碰撞，把一部分能量以热的形式迅速传递给溶剂分子（环境）回到同一电子激迅速传递给溶剂分子（环境）回到同一电子激发态的最低振动能级。发态的最低振动能级。2.内转换：当激发态内转换：当激发态S2的较低振动能级与的较低振动能级与S1的较高振的较高振动能级的能量相当或重叠时，分子有可能从动能级的能量相当或重叠时，分子有可能从S2的振动能级以无辐射方式过渡到的振动能级以无辐射方式过渡到S1的能量相等的的能量相等的振动能级上，振动能级上，这一无辐射过程称为这一无辐射过程称为“内转换内转换”。3.系间跨跃：当电子单重激发态的最低振动能级与电子三重激系间跨跃：当电子单重激发态的最低振动能级与电子三重激发态的较高振动能级相重叠时，发生电子自旋状态改变发态的较高振动能级相重叠时，发生电子自旋状态改变的的 ST 跃迁，这一过程称为跃迁，这一过程称为“系间跨跃系间跨跃”。4.外转换：激发态分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用而外转换：激发态分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用而以非辐射形式转移掉能量回到基态的过程。以非辐射形式转移掉能量回到基态的过程。5.荧光发射：当激发态的分子通过振动驰豫荧光发射：当激发态的分子通过振动驰豫内转换内转换振动驰豫到达单重激发态的最低振动能级振动驰豫到达单重激发态的最低振动能级时，单重激发态最低振动能级的电子可通过发射辐射（光子）跃回到基态的不同振动能级，此时，单重激发态最低振动能级的电子可通过发射辐射（光子）跃回到基态的不同振动能级，此过程称为过程称为“荧光发射荧光发射”。6.磷光发射：三重激发态最低振动能级的分子以发射辐射（光子）的形式回到基态的不同振动能级，此过程称为磷光发射：三重激发态最低振动能级的分子以发射辐射（光子）的形式回到基态的不同振动能级，此过程称为“磷光发射磷光发射”。第八张，PPT共二十八页，创作于2022年6月l由于三重态寿命较长，因而发生振动弛豫及外转换的几率也高，由于三重态寿命较长，因而发生振动弛豫及外转换的几率也高，失去激发能的可能性大，以致在室温条件下很难观察到溶液中的失去激发能的可能性大，以致在室温条件下很难观察到溶液中的磷光现象。因此，试样采用液氮冷冻降低其它去活化才能观察到磷光现象。因此，试样采用液氮冷冻降低其它去活化才能观察到某些分子的磷光。某些分子的磷光。l处于激发态的分子，可以通过上述不同途径回到基态，哪种途径处于激发态的分子，可以通过上述不同途径回到基态，哪种途径的速度快，哪种途径就优先发生。的速度快，哪种途径就优先发生。l如果发射荧光使受激分子去活化过程与其他过程相比较快，则荧光如果发射荧光使受激分子去活化过程与其他过程相比较快，则荧光发生几率高，强度大。发生几率高，强度大。l如果发射荧光使受激分子去活化过程与其他过程相比较慢，则荧光如果发射荧光使受激分子去活化过程与其他过程相比较慢，则荧光很弱或不发生。很弱或不发生。第九张，PPT共二十八页，创作于2022年6月三三、激发光谱与荧光光谱、激发光谱与荧光光谱1 1、激发光谱、激发光谱 将激发荧光的光源用单色器分光，连续改变激发光波长，将激发荧光的光源用单色器分光，连续改变激发光波长，固定荧光发射波长，测定不同波长激发光下物质溶液发射固定荧光发射波长，测定不同波长激发光下物质溶液发射的荧光强度的荧光强度(F)，以激发光的波长为横座标，荧光强度为纵座标以激发光的波长为横座标，荧光强度为纵座标作作Fl光谱图光谱图，便可得到荧光物质的激发光谱。，便可得到荧光物质的激发光谱。从从激激发发光光谱谱图图上上可可找找到到发发生生荧荧光光强强度度最最强强的的激激发发波波长长lex，选选用用 lex可得到强度最大的荧光。可得到强度最大的荧光。第十张，PPT共二十八页，创作于2022年6月2 2、荧光光谱、荧光光谱 如果保持激发光的波长和强度不变，测量不同波长处荧光的强度分如果保持激发光的波长和强度不变，测量不同波长处荧光的强度分布，将荧光的波长为横座标，荧光强度为纵座标作布，将荧光的波长为横座标，荧光强度为纵座标作F-l 光谱图光谱图便得到荧光便得到荧光光谱或称发射光谱。光谱或称发射光谱。倍频峰 荧光光谱中荧光强度最强的波长为荧光光谱中荧光强度最强的波长为 lem。第十一张，PPT共二十八页，创作于2022年6月四、溶液荧光光谱特征l斯托克斯位移斯托克斯位移 在溶液荧光光谱中，荧光波长总是大在溶液荧光光谱中，荧光波长总是大于激发光波长。激发与发射之间存在着一于激发光波长。激发与发射之间存在着一定的能量损失。定的能量损失。l荧光光谱的形状与激发波长无关荧光光谱的形状与激发波长无关l荧光光谱与激发光谱呈镜像关系荧光光谱与激发光谱呈镜像关系第十二张，PPT共二十八页，创作于2022年6月 物质分子结构与荧光的发生及荧光强度紧密相关，根据物质分子结构与荧光的发生及荧光强度紧密相关，根据物质的分子结构可判断物质的荧光特性。物质的分子结构可判断物质的荧光特性。分子能产生荧光或磷光，首先要求分子结构能吸收紫外和可见辐分子能产生荧光或磷光，首先要求分子结构能吸收紫外和可见辐射。通常，分子吸收辐射的能力愈强，则产生的荧光或磷光也愈强。射。通常，分子吸收辐射的能力愈强，则产生的荧光或磷光也愈强。荧光体系：几乎都是含有一个或几个苯环的复杂的有机化合物。荧光体系：几乎都是含有一个或几个苯环的复杂的有机化合物。在这些化合物中能产生最强荧光的吸收过程通常包含有在这些化合物中能产生最强荧光的吸收过程通常包含有*跃迁跃迁而达到电子激发态的而达到电子激发态的。五、五、荧光与分子结构的关系荧光与分子结构的关系 第十三张，PPT共二十八页，创作于2022年6月六、分析方法六、分析方法 波长扫描波长扫描 时间扫描时间扫描 3-D扫描扫描 第十四张，PPT共二十八页，创作于2022年6月1 1、波长扫描、波长扫描 给定发射波长，在激发波长的某一范围内进行扫描。给定发射波长，在激发波长的某一范围内进行扫描。给定激发波长，在发射波长的某一范围内进行扫描。给定激发波长，在发射波长的某一范围内进行扫描。EX波长：波长：200-900nmEM开始波长：开始波长：200890nmEM结束波长：结束波长：210900nmEM波长：波长：200-890nmEX开始波长：开始波长：200890nmEX结束波长：结束波长：210900nm第十五张，PPT共二十八页，创作于2022年6月2 2、时间扫描、时间扫描EX波长：波长：200-900nmEM波长：波长：200-900nm给定激发波长和发射波长，扫描一段时间。给定激发波长和发射波长，扫描一段时间。第十六张，PPT共二十八页，创作于2022年6月3、3-D扫描扫描 EX开始波长：开始波长：200850nmEX结束波长：结束波长：200900nmEX采样间隔：采样间隔：150nmEM开始波长：开始波长：200850nmEM结束波长：结束波长：200900nmEM采样间隔：采样间隔：110nm等高线的间隔：等高线的间隔：0.011000在激发波长和发射波长的给定范围内进行扫描。在激发波长和发射波长的给定范围内进行扫描。第十七张，PPT共二十八页，创作于2022年6月七七、荧光强度与溶液浓度的关系荧光强度与溶液浓度的关系(一一)定量依据定量依据 If=2.3fI0bc（荧光物质浓度很小）荧光物质浓度很小）式中：式中：f为荧光效率，为荧光效率，I0为激发光的强度，为激发光的强度，荧光物质的摩尔吸收系数，荧光物质的摩尔吸收系数，b为试样池的光程，为试样池的光程，c为荧光物质的浓度。为荧光物质的浓度。在一定条件下，在一定条件下，f、I0、b均为常数：均为常数：If=Kc 第十八张，PPT共二十八页，创作于2022年6月（二）定量方法（二）定量方法1.1.标准曲线法标准曲线法 配配制制一一系系列列标标准准浓浓度度试试样样测测定定荧荧光光强强度度，绘绘制制标标准准曲曲线线，再再在在相相同同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出未知试样的浓度。条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出未知试样的浓度。2.比较法比较法在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较：在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较：第十九张，PPT共二十八页，创作于2022年6月（3 3）荧光定性分析）荧光定性分析 将实验测得样品的荧光激发光光谱和荧光发将实验测得样品的荧光激发光光谱和荧光发射光谱与标准荧光光谱图进行比较来鉴定样品成射光谱与标准荧光光谱图进行比较来鉴定样品成分。分。第二十张，PPT共二十八页，创作于2022年6月七、荧光分析法的应用七、荧光分析法的应用 目目前前荧荧光光分分析析大大多多用用于于定定量量分分析析，由由于于自自身身发发射射荧荧光光的的化化合合物物不不多多，因因此此往往往往利利用用有机试剂与荧光较弱或不显荧光的物质结合形成发荧光的配合物来进行测定。有机试剂与荧光较弱或不显荧光的物质结合形成发荧光的配合物来进行测定。(1)(1)无机化合物的分析无机化合物的分析与与有有机机试试剂剂形形成成配配合合物物后后测测量量；可可测测量量约约6060多种元素。多种元素。第二十一张，PPT共二十八页，创作于2022年6月（2 2）有机化合物的分析）有机化合物的分析 芳香族化合物具有共轭的不饱和结构，多能发生荧光，可以直接进行荧光测定；而脂肪芳香族化合物具有共轭的不饱和结构，多能发生荧光，可以直接进行荧光测定；而脂肪族化合物的分子结构较简单，本身能发荧光的很少，须与某些试剂反应后才能进行分析。族化合物的分子结构较简单，本身能发荧光的很少，须与某些试剂反应后才能进行分析。第二十二张，PPT共二十八页，创作于2022年6月 由于分子荧光分析法的选择性和灵敏性好，常由于分子荧光分析法的选择性和灵敏性好，常由于分子荧光分析法的选择性和灵敏性好，常由于分子荧光分析法的选择性和灵敏性好，常应用于医药、食品、生物化学和天然产物的分析。应用于医药、食品、生物化学和天然产物的分析。应用于医药、食品、生物化学和天然产物的分析。应用于医药、食品、生物化学和天然产物的分析。在有机物分析方面应用较多。在有机物分析方面应用较多。在有机物分析方面应用较多。在有机物分析方面应用较多。应应用：用：第二十三张，PPT共二十八页，创作于2022年6月八、磷光分析法及应用 与荧光相比，磷光具有两个特点：与荧光相比，磷光具有两个特点：（1 1）磷光辐射的波长比荧光长；）磷光辐射的波长比荧光长；（2 2）磷光的寿命比荧光长。）磷光的寿命比荧光长。1.1.磷光强度与磷光物质浓度的关系磷光强度与磷光物质浓度的关系 当磷光物质浓度很小时，磷光强度当磷光物质浓度很小时，磷光强度I Ip p与磷光物质浓度与磷光物质浓度c c之间的关系式为：之间的关系式为：I Ip p=2.3=2.3p pI I0 0bcbc式式中中：p为为磷磷光光效效率率，I I0 0为为激激发发光光的的强强度度，磷磷光光物物质质的的摩摩尔尔吸吸收收系系数数，b为为试试样池的光程。样池的光程。在一定条件下，在一定条件下，p、I I0 0、b均为常数，所以上式可写成：均为常数，所以上式可写成：I Ip p=K=Kc c第二十四张，PPT共二十八页，创作于2022年6月2.温度对磷光强度的影响温度对磷光强度的影响 随着温度的降低，磷光逐渐增强。随着温度的降低，磷光逐渐增强。3.低温磷光低温磷光 用液氮作冷却剂。用液氮作冷却剂。第二十五张，PPT共二十八页，创作于2022年6月九、仪器介绍九、仪器介绍 F-4500第二十六张，PPT共二十八页，创作于2022年6月（1）激发光源：通常用汞弧灯、氢弧灯或氙灯。）激发光源：通常用汞弧灯、氢弧灯或氙灯。（2）试样液槽：通常用石英制成。）试样液槽：通常用石英制成。（3）测量荧光的检测器：要求检测器有较高的灵敏度。一般用光电管或光电倍增管做检测器。）测量荧光的检测器：要求检测器有较高的灵敏度。一般用光电管或光电倍增管做检测器。（4）激发用单色器：其作用是获得单色性较好的激发光以激发样品产生荧光；）激发用单色器：其作用是获得单色性较好的激发光以激发样品产生荧光；荧光用单色器：其作用在于减少光谱干扰，得到一定波长的荧光。荧光用单色器：其作用在于减少光谱干扰，得到一定波长的荧光。第二十七张，PPT共二十八页，创作于2022年6月感感谢谢大大家家观观看看第二十八张，PPT共二十八页，创作于2022年6月10/19/2022