分子生物学实验讲义总.doc

实验一：对虾（肌肉组织）基因组DNA的提取（下次上课时交这次课的实验报告，依此类推）一、实验目的：掌握提取动物基因组DNA的基本方法，基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交（包括RFLP）及PCR分离基因等。二、实验原理：利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团悬浮其中，可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到提取的目的。在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提，混匀过程要轻缓，以保证得到较长的DNA。一般来说，构建基因组文库，初始DNA长度必须在100kb以上，否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析，DNA长度可短至50kb，在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段（20kb以下），并可保证包含PCR所扩增的片段（一般2kb以下）。不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同，不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法，以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用，因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时，应考虑除去多糖和酚类物质。本实验以对虾幼虾肌肉组织为材料，学习基因组DNA提取的一般方法。三、实验材料、试剂和仪器：1. 实验材料：-80保存的南美白对虾幼虾；（在116的超低温冰箱里，橘色盖子的冻存管中，可让研究生提前找好，每个冻存管中有23尾幼虾，学生做实验时，每个两人的小组取1/2或1/3尾幼虾进行研磨即可。）2. 实验所需试剂：CTAB提取缓冲液、Tris-饱和酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）、氯仿-异戊醇（24:1）、RNaseA、无水乙醇、75%乙醇、ddH2O（或TE）；（这3个标红色的试剂以前没用过，只用的是氯仿，RNaseA也没用过，所以提取效果很不好，所以最好让冯欣把这三个试剂赶紧订上）3. 实验所需仪器及器皿：研钵、微量移液器、制冰机、高速冷冻离心机、超低温冰箱、1.5mL离心管。四、操作步骤：1. 称取约0.2g对虾组织置于研钵中（研钵在上课前放入超低温冰箱中预冷），加入700L CTAB提取缓冲液，在冰上充分研磨成匀浆后转入1.5mL离心管中；2. 65水浴加热20min，中间适当轻轻摇动；（4楼实验室的水浴锅很大，加热缓慢，去实验室后先打开水浴锅和制冰机，再开始讲课）3.（因时间关系，这个步骤可以选做）如要除去其中的RNA，可加5L RNaseA(10g/L)，37保温30分钟；4. 加入等体积（700L）Tris-饱和酚-氯仿-异戊醇（25:24:1），轻轻振荡约10min，使两者混合均匀，4，9000rpm离心15min，将上清转移到一个新的离心管中；5. 加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1），轻轻振荡混匀，4，10000rpm离心5min，取约400L上清转移到一个新离心管中；6. 加入约2.5倍体积（1mL）预冷的无水乙醇（无水乙醇在上课前放到超低温冰箱中），轻轻混匀，可见白色絮状DNA，-80沉淀约20min；7. 4，10000rpm离心5min，弃上清；8. 用75%乙醇洗涤一次，4，10000rpm离心5min，弃上清；9. 空气干燥510min；10. 加入50L 灭菌的ddH2O（或pH8.0的TE）溶解DNA，-20保存，取2L进行电泳检测。（电泳检测由研究生代为完成，下次课前给学生看结果）  五、实验结果：1. 加入预冷的乙醇后，可见核酸形成白色的絮状沉淀，离心后白色沉淀位于管底部，记录溶解状态和难易度，如果难于溶解，说明混有蛋白；2. 记录电泳后的条带结果。基因组DNA分子较大，经过枪头吹打后被打断成约2040kb左右的片段，在电泳过程中迁移慢，移动距离较小；而RNA则大部分被降解，分子较小，迁移距离较大，跑在前方。六、分析与讨论：1. DNA的条带如果较弱，可能是由于部分降解所至。降解原因可能是由于对虾样本放置时间较长所至，也可能是研磨时加入的样本太多所至，导致研磨不充分，DNA没有充分释放出来。加入预冷的无水乙醇后再-80条件下沉淀时间较短，也可能导致DNA沉淀不充分。2. 用酚仿抽提比用氯仿抽提效果好些，能很好的溶解脂类和蛋白质。3. 在低温条件下研磨对虾，可保持DNA结构的稳定性，减少对DNA的破坏，酚仿既可以充当有机溶剂，溶解脂类和蛋白质，又可蛋白变性剂，是蛋白变性，与DNA分离。实验二：PCR扩增目的基因（扩增河蟹高血糖激素基因CHH）一、实验目的：1. 学习掌握PCR扩增的原理；2. 掌握PCR实验的操作过程；3. 通过PCR扩增获得河蟹高血糖激素基因（CHH）的部分cDNA片段。二、实验原理：1. PCR技术是Kary Mullis在1985年建立起来的在体外合成DNA的一种方法；（见下图）2. PCR是依据DNA半保留复制原理，利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特性，在附加的两个引物与模板杂交之后，按碱基配对原则经酶促反应合成DNA片段。该过程包括模板变性、引物退火及用DNA聚合酶延伸两个引物之间DNA的一定次数的重复循环，使包括在两个引物5端限定的特异性片段形成指数式积累，在短时间内可获得大量特异的DNA拷贝；3. 扩增DNA的特异性主要取决于引物和模板相结合的特异性，每个循环分3步： （1）模板变性：加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成游离于溶液中的单链DNA；（2）引物退火：温度突然降低，反应体系中的引物能准确地配对于被扩增区域的两个侧翼，这是因为模板分子结构比引物的结构复杂得多，而且引物的拷贝数远高于模板DNA的拷贝数，因此引物与模板DNA形成复合物的概率要大大高于模板DNA两条链的重新结合；（3）序列延伸：在DNA聚合酶、4种脱氧核糖核酸及Mg2+存在的条件下，DNA聚合酶催化以引物为起始点的5-3DNA链延伸反应，n个循环后，一个模板得到的扩增拷贝数为2n-1；4. 引物的设计必须有参考序列：可通过建立基因组文库或cDNA文库，进行测序获得参考序列；或纯化蛋白，对蛋白进行末端测序获得部分参考序列，进而设计兼并引物进行扩增；如果没有任何信息，也可通过同源克隆，根据已有相近物种的序列来设计引物；5. DNA变性要经过94的高温，DNA聚合酶最初来源于温泉中的一种耐高温的嗜热菌，现多为重组制品，不会在高温下变性失活；6. 模板cDNA为去除内含子后的mRNA在反转录酶（RNA依赖的DNA合成酶）的作用下形成的DNA。三、实验材料、试剂和仪器：1. 实验材料：（1）扩增河蟹CHH基因所需的模板；（用含有CHH的菌液即可，让王艳华提前准备）（2）扩增所需序列特异性引物。（王艳华准备）2. 试剂：ddH2O、10×PCR buffer(成分：Tris-HCl(pH8.3) 100mM; KCl 500mM; MgCl2 15mM）、dNTP（含dATP、dTTP、dCTP和dGTP各2.5mM）、Taq DNA polymerase（Takara，在甘油中保存）3. 仪器：制冰机、微量移液器、PCR小管、PCR仪、台式离心机四、实验步骤：1.PCR反应体系：10×PCR buffer (Mg2+ plus) 2.5 uLdNTP 2 uLTemplate 1 uLPrimer 1 1 uLPrimer 2 1 uLTaq DNA polymerase 0.25 uLddH2O 17.25 uL2. PCR反应条件：94 4min；94 1min，55 1min，72 1min；35个循环；72 10min；15 10min.3. 加样顺序：先加ddH2O，然后依次将10×PCR buffer、dNTP、Primer加入到水中，最后加模板和Taq DNA polymerase（这两样用时从冰箱中现用现拿）；4. 全部加完样品后在Vortex（涡旋振荡仪）上混匀样品，然后置于离心机（或者掌中宝）中快速离心，除去反应体系中的气泡，并使管壁上的液滴流下。5. 放于PCR仪中进行PCR扩增。（简单讲解PCR仪的使用和注意事项）五、实验结果：PCR扩增的结果需要用电泳检测，具体的电泳检测留到实验三进行。六、分析讨论：1. 如果模板是基因组DNA，因为分子量较大，需要提前在95水浴中预变性1015min，如果是cDNA为模板，因为其分子量较小，则不需要预变性；2. PCR仪扩增时选择热盖，如果没有热盖功能，可在加完所有组分后滴加12滴矿物油，防止挥发；3. 严格的操作应在冰上进行，可防止非特异性扩增；4. 引物的母液浓度为10 pmol/uL，在25uL反应体系中加入1uL后的工作浓度应在0.10.5 pmol/uL范围内，引物量过大时，容易产生引物与模板的错配和形成引物二聚体；5. 反应buffer中含有适量的Mg2+，它直接影响到引物的退火、模板和PCR产物的接连温度；6. dNTP中4种脱氧核糖核酸的浓度应平衡相等，且不要较高，较高时反应过快，较低时，反应过慢；7. Taq酶的浓度应适宜，在100uL的反应体系中需要13个单位的酶，过多时可导致非特异性DNA的积累，会产生较强的背景。实验三：DNA的琼脂糖凝胶电泳检测一、实验目的：1. 掌握DNA的琼脂糖凝胶电泳检测原理和方法，能够利用电泳Marker估计DNA分子的大致大小；2. 检测实验二中各组PCR扩增后得到的目的基因的质量及大小。二、实验原理：1.琼脂糖是由-D-吡喃型半乳糖和3,6-脱水-L-吡喃型半乳糖以糖苷键相互交替（1,3-1,4）连接而成的一种线性半乳糖，它能够在热的溶剂中熔化并在冷却过程中形成凝胶；2. 适当浓度的琼脂糖凝胶介质作为电泳的支持物，可以发挥分子筛的功能，使大小构型不同的核酸分子泳动距离出现较大差异，以达到分离的目的； 3. 由于核酸分子结构的重复性，核苷酸数目相同的不同核酸几乎具有灯亮的静电荷，所以核酸携带的电荷的差异几乎不造成对核酸迁移率的影响，真正决定核酸分子在某一特定电场下的电泳迁移率因素是核酸分子的大小和构型；DNA分子含有大量磷酸，带负电，在电场力的作用下会向正极移动，但由于其大小构型不同，导致迁移率不同，因此可以将它们分开；（电泳槽：红正黑负）4. 观察琼脂糖凝胶中DNA最常用的方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色，溴化乙锭含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团，因此被认为是一种潜在的致癌物。它与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性。在高离子强度的饱和溶液中，大约每2.5个碱基插入一个溴化乙锭分子。当染料分子插入后，其平面基团与螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作用。这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致与DNA结合的染料呈现荧光，其荧光产率比游离溶液中染料有所增加。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身吸收302nm和366nm的光辐射。这两种情况下，被吸收的能量在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。由于溴化乙锭-DNA复合物的荧光产率比没有结合DNA的染料高出20-30倍，所以当凝胶中含有游离的溴化乙锭（0.5ug/ml）时，可以检测到少至10ng的DNA条带。 溴化乙锭可以用来检测单链或双链核酸（DNA或RNA）。但是染料对单链核酸的亲和力相对较小，所以其荧光产率也相对较低。事实上，大多数对单链DNA或RNA染色的荧光时通过染料结合到分子内形成较短的链内螺旋产生的。 由于在该染料存在的情况下，线状DNA的电泳迁移率约降低15%，因此，当需要知道DNA片段的准确大小（如DNA限制酶酶切图谱的鉴定）时，凝胶应该在无EB情况下电泳，电泳结束后用EB染色。染色完毕后，通常不需要脱色。但是在检测小量DNA（小于10ng）片段时，通常要将染色后的凝胶进行脱色。5. 由于溴化乙锭具有一定的毒性，实验结束后，应对含EB的溶液进行净化处理再行弃置，以避免污染环境和危害人体健康，处理方法如下： 将EB溶液用水稀释至浓度低于0.5mg/ml； 加入一倍体积的0.5mol/L KMnO4，混匀，再加入等量的25mol/L HCl，混匀，置室温数小时； 加入一倍体积的2.5mol/L NaOH，混匀并废弃。 （现在国际上更多的实验室已经不再使用EB，而是使用Invitrogen公司的SYBR safe DNA gel stain来代替，效果完全可与EB媲美，使用上更安全。）三、实验材料、试剂和仪器：1. 材料：上次实验课PCR扩增的河蟹CHH基因产物；2. 试剂：琼脂糖、50×TAE电泳缓冲液（2mol/L Tris碱，1mol/L 冰醋酸，100 mmol/L EDTA）、标准分子量DNA（Marker）、6×loading上样缓冲液 30mM EDTA，36%(v/v) Glycerol（甘油），0.05%(w/v) Xylene Cyanol FF（二甲苯青FF)，0.05%(w/v) Bromophenol BLUE (溴酚蓝)、溴化乙锭（EB）；3. 仪器器皿：电子天平、量筒、微波炉、烧杯、微量移液器、一次性手套、电泳仪、紫外成像仪。四、实验步骤：1. 制胶：（1）按照1%的浓度比例称取1g琼脂糖粉末置于烧杯中，加入100mL 1×TAE电泳缓冲液，晃匀后放入微波炉中加热约2min至完全融解；（2）待凝胶温度降至不烫手时，加入少量EB（约1-2uL）；（EB量太大会导致紫外成像时凝胶背景太亮，从而不易与目的条带形成鲜明对比）（3）将凝胶倒入放在水平桌面上的制胶槽中（制胶槽预先用胶带封闭两端，放好梳子），如有气泡，可用枪头粗端去除，室温约15-20min至凝胶完全凝固；（4）拔出梳子，将凝胶连带制胶板一起放入电泳槽中，切记：凝胶的点样孔在负极（黑色）一侧。2. DNA电泳：（1）将DNA样品与6×DNA上样缓冲液（体积比为1：6）混合均匀（可在一次性手套或封口膜上混合），依次加入凝胶点样孔中；（注意：枪头尖部不要碰触凝胶，防止刺穿凝胶，另外样品全部推出到点样孔中之后，仍须按住微量移液器，至枪头离开液面后再松手，往常很多同学提前松手，导致样品又被吸回到移液器中）（2）连好电源线，打开电泳仪，调至恒压状态，电压设定为约90V；（电压设定视情况而定，通常高电压跑得快，但如果条带多则易聚集在一起，不容易区分，而低电压跑的慢，条带之间迁移的较开，易于区分）（3）电泳结束后，先将电压调至0，再关闭电泳仪，拔下电源线，取出凝胶，置于紫外成像仪上进行观察和拍照。（注意：污染的手套不要触摸任何非污染区和设备，如果不经过电脑裸眼观察时，一定要将有机玻璃盖板置于紫外灯管上，否则容易损伤眼睛）五、实验结果：可放照片加以说明，或者画示意图说明，标明所见条带、dimer及Marker。六、分析讨论：1. 加EB时应小心，要戴至少两层一次性手套；EB加量不要太大，否则反而影响对DNA的观察；2. 如果PCR产物不单一，则应低电压跑电泳，这样条带之间分离效果较好；3. 缓冲液的pH值直接影响DNA的解离程度和电荷密度，缓冲液pH为8.0时，DNA氨基几乎不解离，磷酸全部解离带负电，因此向正极泳动；4. 在电泳中，6×loading上样缓冲液可显示两条带，前面的蓝色的条带是溴酚蓝，代表的片段大小是 300bp，后面的绿色的条带是二甲苯青，代表的片段大小在4000bp左右。loading buffer的功能主要有两个。第一，里边的指示剂溴酚蓝和二甲苯酚起到指示的作用，显示电泳的进程，以便我们适时终止电泳，通常溴酚蓝迁移到凝胶的2/3处电泳就可停止了；第二，里边的成分“甘油”可以加大样品密度，使样品密度大于TAE，从而沉降到点样孔中，防止样品漂出点样孔。另外有的Buffer是加有SDS的，一般都会写明，SDS主要是促使聚合酶变性，因为没有除尽的聚合酶会结合在DNA双链上影响它的迁移速率。在酶切反应中加入loading，是为了中止酶促反应。实验四：从琼脂糖凝胶中回收目的DNA一、实验目的：熟练掌握用柱回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回收目的DNA的方法，为后续将其连接到载体中做准备，因为胶回收的质量和数量直接影响后继的一系列实验比如酶切连接、转化筛选、测序或者PCR扩增、标记乃至显微注射等工作。二、实验原理：1. 胶回收的质量直接影响后继实验的成功与否，要想做好胶回收，无论是自己亲力亲为还是借助目前五花八门的胶回收试剂盒，最基本的评定标准无外乎这样几个：质量（ 回收产物的纯度和浓度）、回收效率、操作方便（速度）、柱子的载量等；（1）回收产物质量：回收产物的质量主要指纯度。常规电泳过程中，普通级别的琼脂糖自带的一些性状不明的多糖，会连同DNA一起从凝胶中抽提出来，强烈抑制后续的连接、酶切、或者标记、扩增等实验。从凝胶中回收DNA片断，产物的纯度自然是要考虑的第一要务。对于大片断DNA回收，质量还包括了产物的完整与否，如果机械剪切力使得回收产物大小不一致，则无法进行后续试验。而对于较小片断回收，质量其实还包括了回收产物的浓度。因为产物浓度太小，对后继实验同样也有影响，比如连接、标记实验等等就很不顺利，往往需要再浓缩一次，增加了操作的复杂性。此外，极微量的纯化介质或者是某些试剂混入回收产物中也会对结果产生严重的影响；（2）回收率：回收得率，是我们考虑的另一个重要参数。由于上电泳的样品量通常都很少，电泳的过程本身也会导致样品的分散和损失，因而尽可能多的回收电泳凝胶条带中的目的片断，提高产物得率，对于后继实验来说是非常重要的。回收率的多少通常和回收产物的大小以及量的多少有关，比如DNA片断越大，和固相基质的结合力越强，就越难洗脱，回收率就低；又比如说，DNA的量越少，相对损失越大，回收率越低。因此，根据情况选择不同的方法是很重要的。值得注意的是，由于样品的大小和多少对回收率都有显著的影响，所以回收率并非是一成不变的；（3）操作方面：相信大家都会比较喜欢操作简单，快速，应用起来方便的方法或者产品。比如溶胶的缓冲液中添加指示剂，可以指示溶胶的溶液pH值就是很方便的设计；离心过柱就比离心沉淀要简单方便等等；（4）柱子的载量：就是每次回收最多能回收的产物的量。这个自然是越大越好了，因为对于纯化柱或者一定量的纯化介质，过量的产物吸附不了就是被浪费掉了，如果有时需要回收比较大量的产物，大载量就很有优势；通常我们使用的胶回收试剂盒中的柱子的载量是一定的，每个纯化柱最多可以回收30ug的DNA，所以切胶时胶块不宜太大，否则容易造成部分DNA的损失；2. 胶回收方法和分类：（1）柱回收试剂盒：可谓目前最简单快速的回收方法。回收柱上具有硅胶膜，在高盐、低pH的条件下可以高效、可逆地吸附DNA片段，将其它杂质与DNA分开，在低盐、高pH的条件下可以将吸附在硅胶膜上的DNA洗脱收集，达到纯化的目的；只需要将电泳凝胶中的产物条带切下，用溶解Buffer彻底溶解，上包埋有纯化填料的纯化柱，离心，再洗涤一次，离心后用洗脱缓冲液洗脱。全程不过10多分钟，得到的产物溶液可以直接用于后续实验。这个方法几乎不需要什么技巧就能得到稳定的结果，也是目前最多商品化试剂盒选择的方法，但是这个方法可以回收50bp40kb的DNA片段，不适用于更大片段DNA的回收。后面要介绍的很多方法在柱回收试剂盒推出后都渐渐要淘汰了，因为比较费时费力，而且回收的产物纯度也不比试剂盒，有条件还是选择试剂盒，比自己慢慢摸索要更能节约宝贵的青春。（2）玻璃奶/纯化填料胶回收试剂盒：这个方法比前面的方法更为灵活，可以根据每次回收实验时预期回收量来调整纯化填料的量，使得实验不受限于柱子的载量，也不会造成浪费。前面的操作步骤和上者一样，将电泳凝胶的条带切下，Buffer溶解，（区别在于这里）加入纯化填料吸附混合，快速离心沉淀去上清，洗涤沉淀后，干燥沉淀，最后用洗脱液纯化介质中吸附的片断释放出来，离心，取上清，就是回收的产物。这个方法适合各种不同大小的片断，特别是大片断的回收，但是操作就较前者复杂一些，涉及到多次离心沉淀和取上清，有可能会误吸了微量的沉淀；另外干燥的程度也有点技巧，干过了不好洗脱，没干透又影响结果。后来的改进版本有将混合了纯化介质后的凝胶溶解液加入到一种离心过滤柱上，这种柱子不带纯化填料，只有一层过滤膜，离心过滤后，填料在柱子里，溶液被甩掉，这样就避免了上述的问题。（3）低熔点琼脂糖：传统手工操作方法之一，低熔点琼脂糖制备凝胶，电泳后切割目的条带，在TE溶液中65度保温融化，用传统的酚氯仿抽提，乙醇沉淀。这个方法需要用到酚氯仿等有机试剂，由于乙醇沉淀需时较长，现在用的人已经不多了。最好的低熔点琼脂糖为GTG级别（遗传技术级），电泳后，直接将条带切下65度保温融化，就可以直接在融化的琼脂糖DNA混合物中加酶进行后继实验，可以在凝胶中进行各种酶反应，实验条件温和，非常适合大片断的回收。（4）透析袋电洗脱法：烦，简直不堪回首。切下的条带放在充满TAE的透析袋中，再电泳一段时间，让DNA走出凝胶，走向溶液中，再反向电泳一会儿，将附在透析带上的DNA赶回溶液中，取溶液部分，再用TAE洗洗袋子，合并溶液后传统方法酚抽沉淀，那块胶通常还要再染色看看残留，只有在万不得已的非常大的片断时才会考虑此法。这也是丙烯酰胺电泳凝胶产物回收的方法之一。（5）DEAE纤维素膜纸片法和其它改良法：早期实验室最常用方法之一。将DEAE纤维素膜裁成小条活化处理。电泳后在目的条带前切一刀，将比条带略宽的DEAE纤维素膜插入切口，不留气泡，继续电泳一会儿，条带上的DNA被膜片截留，取出膜片冲洗后转移到离心管中加缓冲液65度保温洗脱，直到膜上没有DNA了，将溶液用酚氯仿抽提沉淀。这个方法不适合做较大的DNA，因为洗脱比较困难。小结：常规片断级（DNA片段为100bp-10kb）：主流方法是柱回收试剂盒；大片段级（DNA片段>7kb）：可选方法是玻璃奶/纯化填料胶回收试剂盒，电洗脱；小片段级（DNA片段<100bp）：柱回收试剂盒。3. 一些需要注意的实验技巧：（1） DNA回收纯度取决于纯化介质对DNA吸附的特异性、洗涤杂质是否彻底；而DNA回收率和浓度则与elution buffer的体积，以及buffer在柱子上停留的时间有关。较大的洗脱体积可以提高回收率，充分洗脱，但是会造成产物浓度太低不好用。Qiagen建议使用50ul的洗涤液，正对加入膜中央（避免加在管壁上而不能充分接触纯化介质），可以完全浸润回收柱上的纯化膜。最低建议采用30ul洗脱液。有人试过用1525ul洗脱2次，觉得这样第一次浓度高第二次比较充分，其实没有必要，只要适当延长在柱上停留的时间，就有助于提高得率。Qiagen的Protocol说明：30ul停留1分钟要比50ul停留1分钟回收浓度高1.7倍；（2）充分离心（保证速度和时间）有助于提高得率和纯度，减少残留对后继实验的影响（这个方法要注意不是所有试剂盒都可以使用，因为有些试剂盒的纯化柱填料松一些，离心有时可能导致少量填料脱落）；（3）切胶的时候要尽量减少切胶体积（不超过400mg），由于柱子的载量有限，如果胶块实在太大而预期DNA总量不超过10ug，可以用大一点的管溶解，分几次上柱离心吸附后再洗涤；（4）紫外照射时间不要太长，因为紫外线对DNA（特别是对于较大的片段）有影响；（5）溶胶要彻底，55度下上下颠倒几次有助于快速溶解，溶解完全后溶液的颜色指示溶液的pH值，如果变色需要调pH值以防止实验失败；（6）需要用ddH2O或者TE洗脱的，注意pH在7.08.5之间的回收率最高。回收率和片断大小多少有关，较大的片断（7kb以上）回收率会有所降低，洗脱液预热到55度再加入纯化柱膜中央，并将纯化柱和EP管于55度水浴中静置2分钟，有助于提高产率。三、实验材料、试剂和仪器：1. 材料：含目的基因片段的琼脂糖凝胶切块；2. 试剂：胶回收试剂盒（含Binding Buffer、Wash Buffer、Elution Buffer、纯化柱等）；3. 手术刀片、离心机、水浴锅、微量移液器、1.5mL EP管、VDS、电子天平等。四、实验步骤：（详见说明书）1. 在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶块（注意用有机玻璃板遮挡紫外灯，误伤眼睛），计算凝胶重量（提前纪录1.5mL离心管重量），该重量作为一个凝胶体积（100mg=100µL体积）；2. 每100mg的凝胶加入400uL的Binding Buffer，混合均匀后于55水浴10min，每23min混合几次；直至凝胶完全熔化；3. 将溶胶液转移到spin柱（置于2mL离心管）中，10000rpm离心1min，弃流出液；4. 将spin柱置于2mL离心管，加500µL Wash Buffer（确认已加入指定体积的无水乙醇），10000rpm离心1min，弃流出液；5. 重复步骤4；6. 将spin柱置于2mL离心管，10000rpm离心空甩1min；7. 将spin柱置于1.5mL离心管中，在硅胶膜中央加30µL Elution Buffer，55静置2min，10000rpm离心1min收集并于-20保存。五、实验结果：可用电泳检测回收结果。六、分析讨论：1. 切胶用的刀片要干净，可用酒精擦拭后在酒精灯上烧一下，防止上面有其它的DNA片段，影响结果；2. 切胶的体积要尽量小；3. 切胶要迅速，避免紫外灯照射时间过长，会有可能打断大片段；4. 溶胶要彻底，55下要充分混匀；5. 胶回收后最好尽快进行后续的与载体的连接步骤，或放于-20短期保存，时间太长PCR产物末端的A容易脱落，导致与载体无法连接。实验五：外源DNA与载体的连接一、实验目的：1. 了解载体的特征及蓝白斑筛选的原理；2. 掌握将目的DNA连接到载体中的有效方法。二、实验原理：1. TA克隆：TA克隆系统是由Invitrogen公司（San Diego，CA）发展而来的商业性试剂盒，它主要用于PCR产物的克隆和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3-T突出端的载体（见下图），在连接酶作用下，可以快速地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中，TA克隆没有方向性。2. 蓝白斑筛选的原理：蓝白斑筛选是一种基因工程常用的重组菌筛选方法。野生型大肠杆菌产生的-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖）切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。有色物质可以使整个培养菌落产生颜色变化，而颜色变化是鉴定和筛选的最直观有效的方法。-互补：适用于蓝白斑筛选的基因工程菌为-半乳糖苷酶缺陷型菌株，这种宿主菌的染色体基因组中编码-半乳糖苷酶的基因突变，造成其编码的-半乳糖苷酶失去正常N段一个146个氨基酸的短肽（即肽链），从而不具有生物活性，即无法作用于X-gal产生蓝色物质。用于蓝白斑筛选的载体具有一段称为lacz的基因，该基因包括：一段-半乳糖苷酶的启动子、编码肽链的区段、一个多克隆位点（MCS），MCS位于编码肽链的区段中，是外源DNA的选择性插入位点。虽然上述缺陷株基因组无法单独编码有活性的-半乳糖苷酶，但当菌体中含有带lacz的质粒后，质粒lacz基因编码的肽链和菌株基因组表达的N端缺陷的-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整-半乳糖苷酶相同的作用于X-gal生成蓝色物质的能力，这种现象即-互补。操作中，添加IPTG（异丙基-D-硫代吡喃半乳糖苷）以激活lacz中-半乳糖苷酶的启动子，在含有X-gal的固体平板培养基中菌落呈现蓝色。以上是携带空载体的菌株产生的表型。当外源DNA（即目的片段）与含lacz的载体连接时，会插入进MCS，使肽链读码框破坏，这种重组质粒不再表达肽链，将它导入宿主缺陷菌株则无互补作用，不产生活性-半乳糖苷酶，即不可分解培养基中的X-gal产生蓝色，培养表型即呈现白色菌落。 实验中，通常蓝白筛选是与抗性筛选一同使用的。含X-gal的平板培养基中同时含有一种或多种载体所携带抗性相对应的抗生素，这样，一次筛选可以判断出：未转化的菌体不具有抗性，不生长；转化了空载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落；转化了重组质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。3. 连接反应的温度在37时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12-16，连接12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。三、实验材料、试剂和仪器：1. 材料：经胶回收纯化的目的基因片段；2. 试剂：T-载体、T4-DNA连接酶（或含有连接酶的连接buffer）、ddH2O；3. 仪器：制冰机、PCR小管、微量移液器、离心机。四、实验步骤：以宝生物的T-载体试剂盒为例1. 在PCR小管中加入T-载体试剂盒中的Solution I溶液2.5 L；2. 再加入经胶回收纯化的目的基因2 L；3. 最后加入T-载体0.5 L；4. 用移液器混匀后离心机轻甩，16过夜连接。五、实验结果：连接实验结果成果与否需要通过转化实验才能确定。六、分析讨论：1. Taq酶能够在PCR产物的3末端加上一个非模板依赖的A，但如果放置时间过长，A会脱落，则不能与载体连接，所以目的基因经胶回收后，要尽快完成连接反应；2. 试剂盒中的Solution I溶液因含有连接酶，避免反复冻融，在首次使用时应分装至2.5 L/管，用时冰上融化。3. 如果使用Promega公司的pGEM-T载体系统，则需要T4-DNA连接酶，连接反应条件为4过夜连接。实验六：感受态细胞的制备一、实验目的：掌握CaCl2法制备感受态细胞的原理及方法。二、实验原理：1. 基因片段在体外只是一段核酸分子，是化学物质，无法表现出遗传物质的生命活性。只有当其存活于活细胞后，生命的特征才能充分展示出来。大肠杆菌是目前最成熟的克隆受体，其遗传突变材料也是最丰富的，针对其开发的载体也是最完善的。遗传物质的转移有三种方式：转化、转导和转染。转化是一种遗传转移方式，在自然界普遍存在，1928年Griffith首次在肺炎链球菌中发现，即来自一个细菌细胞（供体）的DNA（片段）被另一个细胞（受体）所吸收，并在受体细胞中生存下来。对DNA的吸收，一般发生在受体生长周期中的一个短暂阶段。细胞处于能够吸收外源DNA的状态称感受态（competence），处于感受态的细胞称作感受态细胞（competent cell），经转化获得外源遗传物质的细胞称转化子（transformant）。在大肠杆菌中还没有发现明确的与感受态有关的遗传因子，因此大肠杆菌的感受态需要物理或化学的诱导才能产生。常用的有CaCl2转化法和电转化法。2. 最经典的大肠杆菌转化是通过CaCl2来诱导感受态的形成，其操作核心是将大肠杆菌细胞在CaCl2水溶液中浸泡一段时间，经过处理后，Ca2+可与DNA结合形成羟基钙磷酸复合物吸附在菌体细胞表面，使大肠杆菌细胞对DNA的吸附能力显著提高，转化效率可达107109转化子/ug DNA，同时Ca2+还能抗DNase，防止外源DNA被降解。所谓感受态是让细胞胀起来，使细胞膜流动性差；热击后立即冰浴，使菌体表面晶格结构被破坏，形成孔洞，外源DNA进入细胞实现转化。3. 常用的大肠杆菌受体菌株有DH5、TG1、XL-1 Blue、JM109和TOP10等。4. 在制备感受态时，所用的操作都必须在冰浴中进行，保持细胞的最低生物活性。感受态在4可维持1-2天，在10%甘油溶液下于70可长期保存。为了提高转化效率，在CaCl2处理时可辅助使用Mg2+、Co2+和Ru2+等二价阳离子或二甲基亚砜（DMSO）。三、实验材料、试剂和仪器：1. 材料：菌株E.coli（DH5）；2. 试剂：（1）LB培养基：蛋白胨 (10g/L)、酵母提取物 (5g/L)、NaCl (10g/L)、1M NaOH (1 mL/L)；（2）灭菌的0.1M CaCl2；3. 器材及设备：微量移液器、振荡恒温培养箱、制冰机、1.5mL离心管、离心机。四、实验步骤：1. 取20 L-20保存的大肠杆菌（DH5）的甘油菌，加入到5 mLLB培养基中，在37，200rpm条件下过夜培养1216小时，以活化菌体；2. 第二天早上将过夜培养的5 mL菌体加入到100 mLLB培养基中扩大培养；3. 37，200rpm，培养约1hr；4. 冰上，将培养好的菌体分装到1.5mL离心管中，每管1 mL菌体；5. 室温条件下，10000rpm离心15s，每管底有1mm2的菌体足矣；6. 每个EP管中加入200 L冰预冷的0.1M CaCl2；7. 轻柔重悬菌体，4冰浴4hr后即可使用；或加入10%甘油，液氮速冻后，-80可保存数月。五、实验结果：感受态制备成功与否需要通过转化实验的结果才能确定。六、分析讨论：1. 使用的CaCl2溶液要灭菌后冰预冷；2. 用于制备感受态细胞的大肠杆菌菌体应在对数生长期收获；3. 质粒液体（连接液）体积不能超过感受态细胞液体体积的10%；实验七：热激转化实验一、实验目的：1. 学习掌握外源DNA热激转化大肠杆菌感受态细胞的原理和方法；2. 将本实验中的外源目的DNA（Es-CHH基因）转化入大肠杆菌DH-5菌株中。二、实验原理：质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作，可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。目前常用的转化方法主要有两种：（1）热激法：大肠杆菌在0的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中部分核酸酶解离，诱导形成感受态；此外，Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基-磷酸钙复合物，黏附在胞膜的外表面；42热激处理，细胞膜的液晶结构发生扰动，出现间隙，促进细胞吸收 DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。（2）电转化法：外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形