微生物操作规程.doc
微生物操作规程分为四步骤：一、 培养基的配置二、 灭菌三、 接种四、 培养一、 培养基的配置（做一个样品）1、 平板计数琼脂：称量 2.35 g平板计数琼脂于250ml锥形瓶中，用100ml量筒加入100ml水，带上硅胶塞，摇匀。（标记为1号瓶）2、 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤：称量3.56 g样品于250ml锥形瓶中，用100ml量筒加入100ml水，带上硅胶塞，摇匀。然后将配制的肉汤分别吸10ml至带有小导管的小试管中。用10ml吸管吸10ml肉汤放在小试管中，一共要7支。带上小胶塞。(标号分别为10,10,10,100,100,100，空白)3、 生理盐水：称量0.85g氯化钠至250ml锥形瓶中，用100ml量筒加入100ml水，带上硅胶塞，摇匀。用量筒量取90ml生理盐水放入锥形瓶，剩下的生理盐水用10ml吸管从里面取出9ml生理盐水，放9ml至小试管中。（90ml生理盐水标志为2号瓶，9ml试管中的生理盐水标志为3号管）二、 灭菌灭菌操作规程;温度121（压力0.1MPa）、时间30分钟。使用前检查灭菌锅水是否足够。将需平板计数琼脂（1号瓶）、7支带小导管的试管（里面含10ml的肉汤）、90ml生理盐水（2号瓶）、9ml生理盐水（3号管）、包扎好的试管3支、包扎好的培养皿5个放入灭菌锅，盖上盖子拧紧螺栓（对角互拧）。（当压力升至0.05MPa时候，打开开关，打开放气阀，等气出完后再关上放气阀，操作两次，待压力升至0.15MPa，关掉电源。等压力降到0.1MPa时，再插上电源。待压力升至0.15MPa（红线）时又关上电源，等压力降到0.1MPa时，再插上电源，重复操作，使压力在0.1MPa0.15MPa之间保持30分钟，30分钟后关掉电源，等压力降到0时，打开放气阀，然后拧开螺栓，拿出平板计数琼脂（1号瓶）、7支带小导管的试管（里面含10ml的肉汤）、90ml生理盐水（2号瓶）、9ml生理盐水（3号管）、包扎好的试管、包扎好的培养皿放入灭菌锅放冷，（平板计数琼脂（1号瓶）、7支带小导管的试管（里面含10ml的肉汤）、90ml生理盐水（2号瓶）、9ml生理盐水（3号管）可用水冲冷）。等各配制的东西冷却后进行操作。注意：平板计数琼脂到不烫手的时候才可以倒，太热把细菌都杀掉了，太冷的话会凝结，要把握好温度。使用过程中应小心手被烫伤。接种、培养在接种前要检查各器具是否齐全。玻璃瓶里面75%的消毒酒精和棉花。酒精灯的酒精量、剪刀、镊子、打火机、笔、电子秤或夹盘天平（包括砝码）1、打开超净工作台电源，将要使用的放进工作台（待检样品不能放进去），开启紫光灯15分钟，关掉紫光灯再等10分钟，打开照明灯、风力开到最大。（通风橱一定要记得打开）。2、点燃酒精灯，取一定的酒精棉将手全面灭菌（注意离火一定距离）。取三角瓶内的生理盐水，在酒精灯前，小心旋开塞子，立即在火上灼烧瓶口，后放在天平上去皮。3、取待检样品（样品应封存好），用酒精棉充分擦拭剪刀和镊子、然后在酒精灯上灼烧至干，用经消毒冷却的剪刀剪取10g样品放入三角瓶（2号瓶）。4、将放有样品的三角瓶（2号瓶）摇匀，然后取出培养皿先在火焰边灼烧，然后放至桌面，将灭菌的吸管的报纸撕掉，取1ml试液至经灼烧的培养皿中（要两个，做平行样）。，将这两个培养皿分别写上10倍。5、用另一支经灼烧后的吸管，从放有样品的三角瓶中（A）吸取1ml样品，让入装有9ml生理盐水的小试管(3号管)中，用试管由上至下向试管内吹气，再由下至上向试管内吹气，使样液充分混匀，混匀后，取1ml试液至经灼烧的培养皿中（要两个，做平行样），将这两个培养皿分别写上100倍。6、将放有样品的三角瓶（A）摇匀，然后将带小导管的试管(10)支的塞取下，管口在火焰中灼烧，放入试管架中，从放有样品的三角瓶中（2号瓶）吸取1ml样液放至带小导管的试管(10)中，然后带上胶塞。其他两支标有（10）的试管都要按上述操作（要在火焰边操作）7、将带小导管的试管（100）的塞取下，管口分别在火焰中灼烧，放入试管架中，从经稀释100倍的小试管(3号管)中吸取1ml放置带小导管的试管（100）中，然后带上胶塞。其他两只标有（100）的试管都要按上述操作。8、倒平板，平板计数琼脂的温度应掌握在温度在在烫手与不烫手之间（如过热，可用冷水冷却，温度过低则需要重新加热）。将1号瓶中的平板计数琼脂取下胶塞，瓶口立即放到酒精灯上灼烧，打开培养皿的一部分，将琼脂倒入标有10倍（两个）、100倍（两个）的培养皿、空白培养皿（1个）中，轻轻的摇匀培养皿，使之混匀并充分覆盖整个平板底部。9、讲经凝固的培养皿（5个）、带小导管的试管（7支）分别放入培养箱中培养，培养皿的培养温度为37度，时间为48小时。带导管的试管的培养温度为37度，时间为24小时.10、观察小导管是浮起，培养皿中的一点一点的有多少个，然后计数。 注意事项：操作过程中尽量使手不离开工作台，一定要开通风橱，操作人员应尽量少说话。吸耳球在每次使用前都应在火前上方捏放几次。剪刀、镊子在使用前一定要进行灭菌。
