高效液相色谱分析技术 (2)精选文档.ppt
高效液相色谱分析技术2022/10/20本讲稿第一页，共四十页 HPLC是是利利用用样样品品中中的的溶溶质质在在固固定定相相和和流流动动相相之之间间分分配配系系数数的的不不同同，进进行行连连续续的的无无数数次次的的交交换换和和分分配配而而达达到到分分离的过程。离的过程。ABCABC进样进样流动相流动相流动相流动相固定相固定相流动相流动相一一.基本原理基本原理2022/10/20本讲稿第二页，共四十页按按溶溶质质（样样品品）在在两两相相分分离离过过程程的的物物理理化化学学性性质质可可以以作作如如下下的的分类：分类：分配色谱：分配色谱：分配系数分配系数亲和色谱：亲和色谱：亲和力亲和力吸附色谱：吸附色谱：吸附力吸附力离子交换色谱：离子交换色谱：离子交换能力离子交换能力凝胶色谱（体积排阻色谱）：凝胶色谱（体积排阻色谱）：分子大小而引起的体积排阻分子大小而引起的体积排阻2022/10/20本讲稿第三页，共四十页分配色谱分配色谱又可分为：又可分为：正相色谱正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。：固定相为极性，流动相为非极性。反相色谱反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。：固定相为非极性，流动相为极性。用的最多，约占用的最多，约占6070。固定相固定相又分为两类：又分为两类：一类是使用最多的一类是使用最多的微粒硅胶微粒硅胶；另一类是使用较少的另一类是使用较少的高分子微球高分子微球;优点是优点是强度大、化学惰性、使用强度大、化学惰性、使用pH范围大范围大 (pH=114)；缺点是缺点是柱效较小，常用于离子交换色谱和柱效较小，常用于离子交换色谱和 凝胶色谱。凝胶色谱。2022/10/20本讲稿第四页，共四十页微微粒粒硅硅胶胶占占所所有有柱柱填填料料的的80,它它是是近近代代高高效效液液相相色色谱技术中最重要的柱填料类型。谱技术中最重要的柱填料类型。使用使用微粒硅胶微粒硅胶注意事项：注意事项：pH使用范围是使用范围是27.5，若过碱（若过碱（pH8），硅胶会粉碎或溶解；），硅胶会粉碎或溶解；若过酸（若过酸（pH1），键合相的化学键会断裂。），键合相的化学键会断裂。硅胶键合相的硅胶键合相的优点优点：硅胶的强度大硅胶的强度大 化学稳定性好化学稳定性好微粒硅胶的了孔结构和表面积易人为控制微粒硅胶的了孔结构和表面积易人为控制 2022/10/20本讲稿第五页，共四十页按键合到微粒硅胶基质上的官能团可分为：按键合到微粒硅胶基质上的官能团可分为：正相柱正相柱：填料为：填料为极性极性，官能团为，官能团为CN、NH2等等反相柱反相柱：填料为：填料为非极性非极性，官能团为烷烃，例如：，官能团为烷烃，例如：C18(ODS)、C8、C4等。等。“C18”柱柱“万能柱万能柱”填填料料 “C18”柱柱即即十八烷基硅烷键合硅胶十八烷基硅烷键合硅胶填料（填料（Octadecylsilyl简称简称ODS），为最常用的），为最常用的“万能柱万能柱”填料，可完成高效液相色谱填料，可完成高效液相色谱7080的分析任务。的分析任务。2022/10/20本讲稿第六页，共四十页流动相：流动相：1.正相色谱正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序是：常用的流动相及其冲洗强度的顺序是：正己烷乙醚乙酸乙酯异丙醇正己烷乙醚乙酸乙酯异丙醇2.反相色谱反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度如下：最常用的流动相及其冲洗强度如下：H2O甲醇乙腈乙醇丙醇异丙醇四氢呋喃甲醇乙腈乙醇丙醇异丙醇四氢呋喃 最最常常用用的的流流动动相相组组成成是是：“甲甲醇醇H2O”和和“乙乙腈腈H2O”，由由于于乙腈的剧毒性，通常优先考虑乙腈的剧毒性，通常优先考虑“甲醇甲醇H2O”流动相。流动相。2022/10/20本讲稿第七页，共四十页u流动相的选择原则是：流动相的选择原则是：样品易溶，且溶解度尽可能大样品易溶，且溶解度尽可能大 化学性质稳定，不损坏柱子化学性质稳定，不损坏柱子 不妨碍检测器检测，紫外波长处无吸收不妨碍检测器检测，紫外波长处无吸收 粘度低，流动性好粘度低，流动性好 易于从其中回收样品易于从其中回收样品 无毒或低毒，易于操作无毒或低毒，易于操作 易于制成高纯度，即色谱纯易于制成高纯度，即色谱纯 废液易处理，不污染环境废液易处理，不污染环境2022/10/20本讲稿第八页，共四十页HPLC 的组成的组成 Pump 泵泵 Injector/Autosampler 进样器进样器/自动进样器自动进样器 Column 色谱柱色谱柱 Detector 检测器检测器 Data System/Integrator 数据系统数据系统/积分仪表积分仪表All of these components can have problems and require troubleshooting.所有这些部件都可能出现故障而需要检修。所有这些部件都可能出现故障而需要检修。二、二、HPLC故障诊断故障诊断2022/10/20本讲稿第九页，共四十页HPLC出现故障可以从多方面入手出现故障可以从多方面入手1.从部件的运转情况推测，如压力、流速从部件的运转情况推测，如压力、流速的变化的变化2.从色谱图的异常情况推测，如出峰时间、从色谱图的异常情况推测，如出峰时间、峰形峰形3.从数据结果中分析从数据结果中分析2022/10/20本讲稿第十页，共四十页1.1.从压力变化判断从压力变化判断（Pressure）压力无压力无压力高压力高压力低压力低压力不稳定压力不稳定2022/10/20本讲稿第十一页，共四十页现象判断故障排除面版灯不亮电源不通检查电源接头松脱拧紧接头泵头漏液接口太松拧紧泵头螺丝泵密封垫磨损更换密封垫泵不送溶剂泵头有气泡排气泡，溶剂需脱气使用的溶剂黏性太高换低黏性溶剂溶剂贮液器中过滤器脏清洗贮液瓶、过滤器，排空阀打开关闭排空阀控制器设定不正确设置正确流动相不够补足流动相1.1 压力无压力无2022/10/20本讲稿第十二页，共四十页现象判断故障排除压力值高滤头污染清洗连接管路进样阀阻塞冲洗，必要时更换泵流速设定太高设定正确的流速流动相使用不恰当使用恰当的流动相缓冲结晶盐沉淀冲洗样品与流动相不互溶稀释或改变流动相柱温太低升高温度色谱柱性能下降换柱1.2 压力高压力高2022/10/20本讲稿第十三页，共四十页现象判断故障排除压力值低泵流速设定太低设定正确的流速色谱柱选择不恰当更换恰当的色谱柱柱温过高降低柱温系统漏液检查漏液位置并维修流动相使用不当改变流动相1.3 压力低压力低2022/10/20本讲稿第十四页，共四十页1.4压力不稳定压力不稳定现象判断故障排除压力变化重现性好采用梯度洗脱所引起的压力是正常泵内有气泡溶剂脱气不适当排气泡，溶剂需脱气压力波动泵密封垫损坏更换密封垫溶剂混合器故障清洗或更换混合器漏液连接口太松拧紧接口管路损坏更换2022/10/20本讲稿第十五页，共四十页 基线漂移、噪声基线漂移、噪声 峰形异常峰形异常（前沿、拖尾、变宽、分叉、无峰、负峰、鬼峰）保留时间变化保留时间变化2.从色谱图的异常情况推测2022/10/20本讲稿第十六页，共四十页现象判断故障排除基线漂移测定的波长选择有误流动相含有紫外吸收化合物导致基线漂移检测器污染清洗检测器溶剂贮槽污染清洗贮槽更换新流动相冲洗柱子前次分析的样品中有强保留的物质用强度合适的溶剂清洗色谱柱2.1 基线漂移、噪声基线漂移、噪声2022/10/20本讲稿第十七页，共四十页现象判断故障排除无规则基线噪音系统不稳或未达到平衡延长平衡时间系统泄漏检查并进行维修流动相污染或分解清洗溶剂贮液瓶、过滤器、使用HPLC级试剂流动相混合不均维修或更换混合器柱污染、填料流失或阻塞冲洗柱或更换柱检测池被污染或系统内有气泡用甲醇或其他强极性的溶剂冲洗流通池检测器灯能量不足更换灯2.1 基线漂移、噪声基线漂移、噪声2022/10/20本讲稿第十八页，共四十页现象判断故障排除规则基线噪音流动相、检测器或泵内有气泡流动相脱气，冲洗系统除去检测器或泵内的空气室温不稳使用柱温箱、将系统置于恒温、空气对流小的环境泵入口管路松或阻塞检查泵入口管路在同一水平上有其他设备关掉仪器，检查干扰是否来自于外部流动相混合不完全使流动相混合均匀或使用低黏度的溶剂2.1 基线漂移、噪声基线漂移、噪声2022/10/20本讲稿第十九页，共四十页2.2.1峰前沿峰前沿现象判断故障排除峰前沿柱性能下降更换色谱柱保护柱失效换柱芯进样体积太大或样品浓度太高降低进样体积或稀释样品浓度2022/10/20本讲稿第二十页，共四十页2.2.2 峰拖尾峰拖尾现象 判断故障排除峰拖尾定量环与阀连接处出现死区更换定量环进样量太大减少进样量色谱柱或保护柱被污染清洗，必要时更换色谱柱选择不当，试样与固定相间有作用选择恰当的色谱柱样品在流动相中溶解度小选择恰当的流动相2022/10/20本讲稿第二十一页，共四十页2.2.3 峰展宽峰展宽现象判断故障排除峰展宽进样体积或浓度过大减小进样体积、稀释样品流动相流速太低调节流速柱、流动相选择不当选择恰当的色谱柱或流动相缓冲液浓度太低增加浓度漏夜检查漏夜的位置并维修出现两个或多个未被完全分离的物质的峰选择其它色谱条件以改善分离效果检测器时间常数太大使用较小的时间常数2022/10/20本讲稿第二十二页，共四十页2.2.4 峰分叉峰分叉现象判断故障排除峰分叉柱性能下降更换色普柱保护柱失效换柱芯色谱柱或保护柱被污染清洗，必要时更换进样体积太大或样品浓度太高降低进样体积或降低样品浓度样品不稳定有部分分解防止试样组分的分解样品溶剂不溶于流动相改变溶剂或采用流动相溶解样品2022/10/20本讲稿第二十三页，共四十页2.2.5 无峰无峰现象判断故障排除无峰检测器选择或参数设置不当，样品无吸收正确选择检测器，如样品无紫外吸收就不应选UV检测器样品降解检查样品配制过程进样器故障，如注射器泄漏，定量环堵塞检查进样器样品浓度太低，而检测灵敏度不高适当提高样品浓度和进样量，并提高检测灵敏度检测器与数据处理装置连接故障检查并正确连接2022/10/20本讲稿第二十四页，共四十页2.2.6 负峰负峰现象判断故障排除出现所有负峰连接数据处理系统信号线接反正确连接记录仪或检测器信号极性相反改变极性设置出现一个或几个负峰使用的流动相吸收高 使用流动相稀释样品自动进样器注射进空气清洗自动进样器2022/10/20本讲稿第二十五页，共四十页 2.2.7 鬼峰鬼峰现象判断故障排除色谱图出现鬼峰样品中未知物处理样品样品前处理时产生降解或混入杂质用标准品对照、检查样品处理过程，换新样品前一次进样的洗脱物增加分析时间或梯度洗脱、提高流速、两次进样间用强溶剂冲洗色谱柱流动相中含有稳定剂或稳定剂变化使用无防腐溶剂注射器、六通阀、柱子、检测器或管路污染清洗2022/10/20本讲稿第二十六页，共四十页现象判断故障排除保留时间不重复系统不同或更换流动相时未达到平衡分析之前应有足够的时间使系统平衡溶剂配比不合适调节溶剂配比流速变化重新设定流速,检查泵是否正常工作室温波动大使用柱温箱柱被污染冲洗柱或更换柱2.3 保留时间变化保留时间变化2022/10/20本讲稿第二十七页，共四十页3.从数据结果中分析3.1 定量结果定量结果现象判断故障排除精密度降低样品预处理时样品降解或混入杂质用标准品对照、检查样品处理过程，换新样品保留时间改变，峰形不正常见“峰形不正常”的故障排除方法检测器响应故障检查检测器2022/10/20本讲稿第二十八页，共四十页现象判断故障排除精密度降低峰积分不正确重新设置参数进样问题（对外标法）（1）如使用注射器的手动进样器，需确保进样操作的重复性（2）如使用自动进样器需确保正确的进样体积，注射器不含空气，样品瓶有足够的样品，系统不泄漏准确度降低样品蒸发样品密封保存在适当的温度下样品前处理不当检查样品的处理过程内标物配置不当配置新的内标物3.1 定量结果定量结果2022/10/20本讲稿第二十九页，共四十页现象判断故障排除峰不能分辨改变保留时间见“保留时间改变”的故障排除数据处理装置的参数不正确适当输入参数，进标准样，提高准确度无峰改变保留时间故障排除方法数据处理装置的参数不正确重新适当输入参数，进标准样，提高准确度鬼峰见“鬼峰”可能的原因见“鬼峰”的故障排除方法3.2 定性结果定性结果2022/10/20本讲稿第三十页，共四十页温度：1030；相对湿度80；最好是恒温、恒湿，远离高电磁干扰、高振动设备，有良好的通风设施。三、三、HPLC的的日常维护与保养日常维护与保养HPLC的日常操作条件：2022/10/20本讲稿第三十一页，共四十页六通阀进样器的使用及保养六通阀进样器的使用及保养泵的保养泵的保养柱的保养柱的保养紫外灯的保养紫外灯的保养HPLC的日常维护与保养的日常维护与保养2022/10/20本讲稿第三十二页，共四十页 工作原理工作原理 手手柄柄位位进进样样(Load)(Load)位位置置时时，样样品品经经微微量量进进样样针针从从进进样样孔孔注注射射进进定定量量环环，定定量量环环充充满满后后，多多余余样样品品从从放放空孔排出；空孔排出；将将手手柄柄转转动动至至进进样样(Inject)(Inject)位位置置时时，阀阀与与液液相相流流路路接接通通，由由泵泵输输送送的的流流动动相相冲冲洗洗定定量量环环，推推动动样样品进入液相分析柱进行分析。品进入液相分析柱进行分析。六通阀进样器的使用及保养六通阀进样器的使用及保养2022/10/20本讲稿第三十三页，共四十页手柄转动要手柄转动要快速快速：手柄处于Load和Inject之间时，由于暂时堵住了流路，流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上引起损坏，所以应尽快转动阀，不能停留在中途。部部分分装装液液法法进样时，进样量最多为定量环体积的75 并且要求每次进样体积准确、相同；完完全全装装液液法法进样时，进样量最少为定量环体积的3至至5倍倍，这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。六通阀进样器的使用及保养六通阀进样器的使用及保养2022/10/20本讲稿第三十四页，共四十页样品必须样品必须过滤过滤，样品溶液均要用，样品溶液均要用0.45(0.22)m的滤膜的滤膜过滤过滤,防止微粒阻塞进样阀和减少对进样阀的磨损。防止微粒阻塞进样阀和减少对进样阀的磨损。进样结束进样结束冲洗冲洗进样器：通常用不含盐的稀释剂、水或不进样器：通常用不含盐的稀释剂、水或不含盐的流动相冲洗，在进样阀的含盐的流动相冲洗，在进样阀的Load和和Inject位置反复位置反复冲洗，再用无纤维纸擦净注射器针头的外侧。冲洗，再用无纤维纸擦净注射器针头的外侧。六通阀进样器的使用及保养六通阀进样器的使用及保养2022/10/20本讲稿第三十五页，共四十页泵的保养：使用流动相尽量要清洁使用流动相尽量要清洁进液处的砂芯过滤头要经常清洗进液处的砂芯过滤头要经常清洗流动相交换时要防止沉淀流动相交换时要防止沉淀避免泵内堵塞或有气泡避免泵内堵塞或有气泡每次分析结束后，要反复冲洗进样口，每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染防止样品的交叉污染2022/10/20本讲稿第三十六页，共四十页柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净净要注意流动相的脱气要注意流动相的脱气避免使用高粘度的溶剂作为流动相避免使用高粘度的溶剂作为流动相进样样品要提纯；严格控制进样量进样样品要提纯；严格控制进样量柱的保养：2022/10/20本讲稿第三十七页，共四十页每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱柱若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭闭柱的保养：2022/10/20本讲稿第三十八页，共四十页紫外灯的保养：在分析前、柱平衡得差不多时，打开检在分析前、柱平衡得差不多时，打开检测器；在分析完成后，马上关闭检测器测器；在分析完成后，马上关闭检测器样品池要保养样品池要保养2022/10/20本讲稿第三十九页，共四十页请选择内容请选择内容结束一、基本原理一、基本原理Basic principle 二、故障诊断二、故障诊断HPLC System Troubleshooting三、日常维护三、日常维护HPLC System Maintenance2022/10/20本讲稿第四十页，共四十页
