实验一蛋白质的等电点测定和沉淀反应精品文稿.ppt

实验一蛋白质的等电点测定和沉淀反应第1页，本讲稿共28页一、实验目的一、实验目的1 1、了解蛋白质的两性解离性质、了解蛋白质的两性解离性质2 2、学习测定蛋白质等电点的一种方法、学习测定蛋白质等电点的一种方法3 3、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识4 4、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义5 5、了解蛋白质变性与沉淀的关系、了解蛋白质变性与沉淀的关系 第2页，本讲稿共28页二、实验原理二、实验原理n蛋白质是蛋白质是两性电解质两性电解质。在蛋白质溶液中存在下列平。在蛋白质溶液中存在下列平衡：衡：n蛋白质分子的解离状态和解离程度受蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱溶液的酸碱度度影响。影响。第3页，本讲稿共28页n当溶液的当溶液的pHpH为一定值时，蛋白质极性基团解离的正为一定值时，蛋白质极性基团解离的正负离子数相等，净电荷为负离子数相等，净电荷为0 0，此溶液的，此溶液的pHpH值为该值为该蛋白蛋白质的等电点质的等电点。n不同蛋白质具有各自特定的等电点，与该蛋白质的不同蛋白质具有各自特定的等电点，与该蛋白质的组成结构有关。组成结构有关。n在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用性质的变化测定各种蛋白质的等电点。用性质的变化测定各种蛋白质的等电点。n常用方法常用方法：测其溶解度最低时的溶液：测其溶解度最低时的溶液pHpH值。值。问题：蛋白质等电点的测定还有哪些方法问题：蛋白质等电点的测定还有哪些方法?第4页，本讲稿共28页n本实验通过本实验通过观察不同观察不同pHpH溶液中酪蛋白的溶解度溶液中酪蛋白的溶解度来测定其等电点来测定其等电点。n用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制各种不同配制各种不同pHpH值的缓冲液。向各缓冲溶液中值的缓冲液。向各缓冲溶液中加入酪蛋白后，加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的沉淀出现最多的缓冲液的pHpH值值即为酪蛋白的等电点即为酪蛋白的等电点。第5页，本讲稿共28页n在水溶液中，蛋白质分子由于表面生成在水溶液中，蛋白质分子由于表面生成水水化层化层和和双电层双电层而成为稳定的亲水胶体。而成为稳定的亲水胶体。n在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因因失去电荷和脱水失去电荷和脱水而沉淀。而沉淀。n蛋白质的沉淀反应可分为两类。蛋白质的沉淀反应可分为两类。第6页，本讲稿共28页可逆的沉淀反应可逆的沉淀反应 l蛋蛋白白质质分分子子的的结结构构尚尚未未发发生生显显著著变变化化，除除去去引引起起沉沉淀淀的的因因素素后后，蛋蛋白白质质的的沉沉淀淀仍仍能能溶溶解解于于原原来来的的溶溶剂剂中中，并保持其天然性质而不变性。并保持其天然性质而不变性。l如如：盐盐析析作作用用、低低温温下下用用乙乙醇醇（丙丙酮酮）短短时时间间作作用用于于蛋白质。蛋白质。l提纯蛋白质时，常利用此类反应。提纯蛋白质时，常利用此类反应。问题：提纯蛋白质时常用的沉淀方法有哪些问题：提纯蛋白质时常用的沉淀方法有哪些?第7页，本讲稿共28页 不可逆沉淀反应l蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。l加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。问题：这些不可逆的沉淀反应有哪些应用问题：这些不可逆的沉淀反应有哪些应用?第8页，本讲稿共28页l蛋蛋白白质质变变性性后后，有有时时由由于于维维持持溶溶液液稳稳定定的的条件仍然存在（如电荷），并不析出。条件仍然存在（如电荷），并不析出。l因因此此变变性性蛋蛋白白质质并并不不一一定定都都表表现现为为沉沉淀淀，而而沉淀的蛋白质也未必都已变性沉淀的蛋白质也未必都已变性。第9页，本讲稿共28页三、试剂器材三、试剂器材1 1、实验材料、实验材料n 鸡蛋清鸡蛋清n 牛奶牛奶2 2、仪器设备、仪器设备 n水浴锅水浴锅 n温度计温度计n锥形瓶锥形瓶 n100mL100mL容量瓶容量瓶n吸管吸管n试管及试管架试管及试管架 第10页，本讲稿共28页n0.4%0.4%酪蛋白乙酸钠溶液：酪蛋白乙酸钠溶液：取取20mL20mL牛奶，加入牛奶，加入10mL 10mL 1mol/L NaAC,1mol/L NaAC,用去离子水定容至用去离子水定容至100mL100mLn 1.00 mol/L 1.00 mol/L 醋酸溶液醋酸溶液n 0.10 mol/L 0.10 mol/L 醋酸溶液醋酸溶液n 0.01 mol/L 0.01 mol/L 醋酸溶液醋酸溶液3、试剂第11页，本讲稿共28页n蛋白质溶液：蛋白质溶液：5%5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液（新鲜卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液（新鲜鸡蛋清鸡蛋清:水水=1:9=1:9）n0.2M 0.2M 醋酸醋酸-醋酸钠缓冲液，醋酸钠缓冲液，pH4.7 pH4.7 n3%3%硝酸银溶液硝酸银溶液n5%5%三氯乙酸溶液三氯乙酸溶液n95%95%乙醇乙醇n饱和硫酸铵溶液：饱和硫酸铵溶液：2525，100mL100mL水水76.7g76.7g硫酸铵硫酸铵n0.1 M0.1 M盐酸溶液盐酸溶液n0.1 M0.1 M氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液n0.05 M0.05 M碳酸钠溶液碳酸钠溶液n0.1 M0.1 M醋酸溶液醋酸溶液n甲基红溶液：甲基红溶液：pHpH变色范围为变色范围为4.4-6.24.4-6.2，由红变黄，由红变黄第12页，本讲稿共28页四、实验操作四、实验操作（一）酪蛋白等电点的测定一）酪蛋白等电点的测定（1）取4支试管，按下表顺序分别加入各试剂，混匀。试管号蒸馏水mL0.01M醋酸mL0.1M醋酸mL1.0M醋酸mL18.40.6-28.7-0.338.0-1.047.4-1.6第13页，本讲稿共28页（2 2）向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液）向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL1mL，加一管，加一管，摇匀一管。此时摇匀一管。此时1 1、2 2、3 3、4 4管的管的pHpH依次为依次为5.95.9、5.55.5、4.74.7、3.53.5。观察其混浊度。静置。观察其混浊度。静置1010分钟后，再观察其混浊度。分钟后，再观察其混浊度。最混浊（有颗粒沉淀）的一管最混浊（有颗粒沉淀）的一管pHpH即为酪蛋白的等电点即为酪蛋白的等电点。第14页，本讲稿共28页（二）蛋白质沉淀实验（二）蛋白质沉淀实验第15页，本讲稿共28页1.蛋白质的盐析蛋白质的盐析n加加5%卵清蛋白溶液卵清蛋白溶液5 mL于试管中，再加等量饱和于试管中，再加等量饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。沉淀。n离心，取沉淀，加少量水，观察是否溶解。离心，取沉淀，加少量水，观察是否溶解。n离心后上清液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止，离心后上清液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白。此时析出的沉淀为清蛋白。n离心，取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀离心，取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀能否重新溶解。能否重新溶解。第16页，本讲稿共28页2.重金属离子沉淀蛋白质重金属离子沉淀蛋白质n取取1支试管，加入蛋白质溶液支试管，加入蛋白质溶液2 mL，再加，再加3%硝酸银硝酸银溶液溶液12滴，振荡试管，有沉淀产生。滴，振荡试管，有沉淀产生。n离心倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀离心倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？是否溶解？为什么？第17页，本讲稿共28页3有机酸沉淀蛋白质有机酸沉淀蛋白质n取取1支试管，加入蛋白质溶液支试管，加入蛋白质溶液2 mL，再加，再加1 mL5%三三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成。氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成。n离心倾去上清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀离心倾去上清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解是否溶解。第18页，本讲稿共28页4有机溶剂沉淀蛋白质有机溶剂沉淀蛋白质n取取1支试管，加入支试管，加入2 mL蛋白质溶液，再加蛋白质溶液，再加入入2 mL 95%乙醇。混匀，观察沉淀的生乙醇。混匀，观察沉淀的生成。成。第19页，本讲稿共28页5乙醇引起的变性与沉淀乙醇引起的变性与沉淀取取3支试管，编号，依下表顺序加入试剂：支试管，编号，依下表顺序加入试剂：试剂 mL管号5%卵清蛋白0.1M氢氧化钠0.1M盐酸pH4.7缓冲液95%乙醇111121113111第20页，本讲稿共28页n振摇混匀后，观察各管有何变化。振摇混匀后，观察各管有何变化。n放置片刻，向各管内加水放置片刻，向各管内加水8 mL。在。在2、3号管中各加一滴甲基红，分别用号管中各加一滴甲基红，分别用0.1 M醋醋酸酸溶液及溶液及0.05 M碳酸钠碳酸钠溶液中和。溶液中和。观察颜观察颜色的变化和沉淀的生成色的变化和沉淀的生成。n每管再加每管再加0.1 M盐酸溶液数滴，观察沉淀盐酸溶液数滴，观察沉淀的再溶解。的再溶解。n解释各管发生的全部现象。解释各管发生的全部现象。提示：卵清蛋白等电点4.7第21页，本讲稿共28页n实验结果与分析：实验结果与分析：按照按照实验报告实验报告要求记录实验结果并分析。要求记录实验结果并分析。n研讨：研讨：通过本次实验，有否对该项目改进的合理建议。通过本次实验，有否对该项目改进的合理建议。解释盐析、有机溶剂、等电点、重金属、有机酸沉淀蛋白质的解释盐析、有机溶剂、等电点、重金属、有机酸沉淀蛋白质的不同机理。不同机理。查阅资料，介绍蛋白质等电点的测定方法。查阅资料，介绍蛋白质等电点的测定方法。查阅资料，介绍查阅资料，介绍生物大分子制备常用的沉淀方法。生物大分子制备常用的沉淀方法。蛋白质变性有哪些方面的应用？蛋白质变性有哪些方面的应用？n大组总结交流（大组总结交流（PPT）：）：内容：内容：实验结果与分析，课后研讨题，实验体会等。实验结果与分析，课后研讨题，实验体会等。五、实验结果与报告五、实验结果与报告第22页，本讲稿共28页实验结果实验结果管号pH值混浊度解释现象1234（一）酪蛋白等电点的测定第23页，本讲稿共28页（二）蛋白质沉淀实验 1蛋白质的盐析蛋白质的盐析现象解释蛋白质溶液中加硫酸铵溶液加水上清液中加硫酸铵粉末加水第24页，本讲稿共28页2重金属离子沉淀蛋白质重金属离子沉淀蛋白质现象解释蛋白质溶液中加硝酸银沉淀中加水第25页，本讲稿共28页3有机酸沉淀蛋白质有机酸沉淀蛋白质现象解释蛋白质溶液中加三氯乙酸沉淀中加水第26页，本讲稿共28页4有机溶剂沉淀蛋白质有机溶剂沉淀蛋白质现象解释第27页，本讲稿共28页5乙醇引起的变性与沉淀乙醇引起的变性与沉淀管号操作现象解释1振荡混匀加数滴盐酸2振荡混匀醋酸中和加数滴盐酸3振荡混匀碳酸钠中和加数滴盐酸第28页，本讲稿共28页