实验四离心技术及物质代谢实验精品文稿.ppt

实验四离心技术及物质代谢实验第1页，本讲稿共33页离心技术离心技术概念概念：根据物质沉降系数、质量、浮力因素等的不同，应用离心力使物质分离、浓缩、提纯的方法。应用应用：分离、提纯、鉴别生物高分子；分离线粒体、染色体、微粒体、溶酶体等亚细胞物质。第2页，本讲稿共33页基本原理基本原理 F F：粒子在离心场中所受的离心力：粒子在离心场中所受的离心力 a a：粒子旋转的加速度：粒子旋转的加速度 m m：沉降粒子的有效质量：沉降粒子的有效质量 ：粒子旋转的角速度：粒子旋转的角速度 r r：粒子的旋转半径：粒子的旋转半径(cm)(cm)，l离心力F=第3页，本讲稿共33页RCF(relativecentrifugalforce)：相对离心力rpm(revolutionsperminute)：每分钟转速 低速离心时常以转速低速离心时常以转速“rpm”rpm”来表示来表示 高速离心时则以高速离心时则以“g”g”表示表示 l相对离心力离心力相对于重力的倍数，单位是g第4页，本讲稿共33页l沉降系数（沉降系数（S S）:超速离心时，颗粒在离心场中超速离心时，颗粒在离心场中的沉降速度用沉降系数来表示，即物质在单位的沉降速度用沉降系数来表示，即物质在单位离心力场下的沉降速度离心力场下的沉降速度。单位：Svedberg，1S=10-13sv是是物质特有的物理常数，可间接反应分子量是是物质特有的物理常数，可间接反应分子量的大小。的大小。v离心分离技术的基本理论数据，与物质的大小、离心分离技术的基本理论数据，与物质的大小、形状、密度及介质的密度、粘度都有关，通过形状、密度及介质的密度、粘度都有关，通过对离心力和离心介质的选择，即可分离纯化出对离心力和离心介质的选择，即可分离纯化出不同质量大小和物理形状的物质。不同质量大小和物理形状的物质。第5页，本讲稿共33页另外，对某些生物高分子或亚细胞器组分的化学结构、分子另外，对某些生物高分子或亚细胞器组分的化学结构、分子量尚不了解时，可用沉降系数对其物理特性进行初步描述，量尚不了解时，可用沉降系数对其物理特性进行初步描述，将其区别开来，如原核生物的核蛋白体将其区别开来，如原核生物的核蛋白体RNARNA（rRNArRNA）分为）分为5S5S、16S16S、23S23S，即是根据其在离心场中的行为来进行分类。，即是根据其在离心场中的行为来进行分类。第6页，本讲稿共33页 离心机的类型和主要构造离心机的类型和主要构造l 类型类型 工业用离心机工业用离心机离心机离心机 制备性离心机制备性离心机 实验用离心机实验用离心机 分析性离心机分析性离心机 普通离心机普通离心机：6000rpm 6000rpm 高速离心机：高速离心机：6000600020000rpm20000rpm 超速离心机：超速离心机：20000rpm20000rpm制备性离心机制备性离心机第7页，本讲稿共33页l主要构造主要构造转头转头，离心管和管帽离心管和管帽，制冷系统，真空系，制冷系统，真空系 统，制动装置，指示表盘统，制动装置，指示表盘第8页，本讲稿共33页转头转头 1 1角式转头角式转头第9页，本讲稿共33页 2 2荡平式转头：荡平式转头：这种转头是由吊着的这种转头是由吊着的4 4或或6 6个自由活动的吊桶个自由活动的吊桶(离心套管离心套管)构成。构成。3 3区带转头：区带转头：区带转头无离心管，主要由一个转子桶和可旋开的顶盖组成。区带转头无离心管，主要由一个转子桶和可旋开的顶盖组成。4 4垂直转头：垂直转头：其离心管是垂直放置的。其离心管是垂直放置的。5 5连续流动转头：连续流动转头：转头与区带转头类似，由转子桶和有入口和出口的转头盖及附属装置组转头与区带转头类似，由转子桶和有入口和出口的转头盖及附属装置组成。成。最大额定转速最大额定转速 一定的使用限度，使用一定次数或一一定的使用限度，使用一定次数或一 定时间后递减定时间后递减10%10%。第10页，本讲稿共33页离心管离心管不锈钢和不锈钢和塑料塑料离心管，管帽防止样品溢出。离心管，管帽防止样品溢出。第11页，本讲稿共33页l离心操作的注意事项离心操作的注意事项使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡平衡离心管和其内容物，转头中绝对不能装载单数的管离心管和其内容物，转头中绝对不能装载单数的管子，当转头只是部分装载时，管子必须互相对称地子，当转头只是部分装载时，管子必须互相对称地放在转头中，以便使负载均匀地分布在转头的周围。放在转头中，以便使负载均匀地分布在转头的周围。每个转头各有其最高允许转速和使用累计期限，使每个转头各有其最高允许转速和使用累计期限，使用转头时要查阅说明书，不得过速使用。用转头时要查阅说明书，不得过速使用。第12页，本讲稿共33页v装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说明进行，根据装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说明进行，根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管，有的离心管无待离心液体的性质及体积选用适合的离心管，有的离心管无盖，盖，液体不得装得过多液体不得装得过多，以防离心时甩出，造成转头不平，以防离心时甩出，造成转头不平衡、生锈或被腐蚀衡、生锈或被腐蚀;而制备性超速离心机的离心管，则常常而制备性超速离心机的离心管，则常常要求必须将液体装满，以免离心时塑料离心管的上部凹陷变要求必须将液体装满，以免离心时塑料离心管的上部凹陷变形。形。v若要在低于室温的温度下离心时。转头在使用前应放置若要在低于室温的温度下离心时。转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内在冰箱或置于离心机的转头室内预冷预冷。v离心过程中不得随意离开离心过程中不得随意离开第13页，本讲稿共33页物质代谢实验物质代谢实验v实验二十一、糖酵解中间产物的鉴定实验二十一、糖酵解中间产物的鉴定v血清胆固醇测定血清胆固醇测定v血清甘油三酯测定血清甘油三酯测定v实验二十、邻甲苯胺法测血糖含量实验二十、邻甲苯胺法测血糖含量第14页，本讲稿共33页实验二十一实验二十一、糖酵解中间产物的鉴定、糖酵解中间产物的鉴定【实验目的实验目的】检测糖酵解中间产物磷酸丙糖的生成。检测糖酵解中间产物磷酸丙糖的生成。【实验原理实验原理】第15页，本讲稿共33页v糖酵解的反应过程见下图：糖酵解的反应过程见下图：第16页，本讲稿共33页将酵母液（含有葡萄糖及糖酵解的全部酶）在一定的介将酵母液（含有葡萄糖及糖酵解的全部酶）在一定的介质中（适宜的质中（适宜的pHpH，必要的金属离子等）进行保温，在酵母，必要的金属离子等）进行保温，在酵母液中酶体系的作用下，酵母液中原来含有的糖就进行酵解反液中酶体系的作用下，酵母液中原来含有的糖就进行酵解反应，当反应进行到生成二分子磷酸丙糖，进一步变化是在应，当反应进行到生成二分子磷酸丙糖，进一步变化是在3 3磷酸甘油醛脱氢酶磷酸甘油醛脱氢酶催化下进行的催化下进行的，SHSH为为3 3磷酸甘油磷酸甘油醛脱氢酶的必需基团，加入醛脱氢酶的必需基团，加入一碘醋酸可与此酶的一碘醋酸可与此酶的SHSH起起反应反应，从而使酶失去活性，酵解反应就停留在磷酸丙糖，从而使酶失去活性，酵解反应就停留在磷酸丙糖阶段。阶段。酶酶-SH+ICH2COOH-SH+ICH2COOH酶酶S-CH2COOH+HIS-CH2COOH+HI第17页，本讲稿共33页然后以然后以硫酸肼硫酸肼为稳定剂，保护磷酸丙糖不致自发分为稳定剂，保护磷酸丙糖不致自发分解，使其不能向其他方向变化，结果磷酸丙糖在反应解，使其不能向其他方向变化，结果磷酸丙糖在反应体系中堆积，从而与体系中堆积，从而与2 2，4 4二硝基苯肼二硝基苯肼反应生成相反应生成相应的应的苯腙苯腙，后者在碱性溶液中溶解呈，后者在碱性溶液中溶解呈紫红色紫红色，可，可借此鉴定丙糖之生成。借此鉴定丙糖之生成。第18页，本讲稿共33页第19页，本讲稿共33页v【实验方法实验方法】v取试管取试管3 3支，编号，按下表进行操作支，编号，按下表进行操作v记录三管所发生的情况，并加以简要的分析记录三管所发生的情况，并加以简要的分析vCCL3COOHCCL3COOH的作用：强酸，使糖酵解的全部酶失活。的作用：强酸，使糖酵解的全部酶失活。v一碘醋酸的作用：使一碘醋酸的作用：使3 3磷酸甘油醛脱氢酶失活。磷酸甘油醛脱氢酶失活。v硫酸肼的作用：稳定磷酸丙糖，使其不向其它方向转变。硫酸肼的作用：稳定磷酸丙糖，使其不向其它方向转变。第20页，本讲稿共33页试 剂（ml）123pH7.4磷酸盐缓冲液一碘醋酸硫酸肼10CCL3COOH 酵母液水 2.00.5 0.5 1.0 4.0 2.00.5 0.54.01.02.0 4.0 2.0混匀，在3738恒温水浴中保温30分钟一碘醋酸 硫酸肼10CCL3COOH 水 2.0 1.0 1.00.50.51.0 混匀，静置10分钟，离心,3000转/min,10分钟，再取三支试管，对号按下表操作上清液 1mol/LNaOH0.5 0.50.5 0.50.5 0.5混匀，在室温放置10分钟2，4二硝基苯肼 1mol/L NaOH0.5 3.50.5 3.50.53.5第21页，本讲稿共33页v实验注意事项：v成腙反应前，溶液必须先碱化并在室温放置成腙反应前，溶液必须先碱化并在室温放置10min10min，目的是使磷酸丙糖中的磷酸基水解脱去，生成的颜，目的是使磷酸丙糖中的磷酸基水解脱去，生成的颜色比较稳定；色比较稳定；v一碘醋酸和三氯乙酸是酶的抑制剂一碘醋酸和三氯乙酸是酶的抑制剂 ，使用移液，使用移液管后必须管后必须彻底清洗彻底清洗移液管，否则易导致实验失败。移液管，否则易导致实验失败。第22页，本讲稿共33页血清胆固醇测定（酶法）血清胆固醇测定（酶法）v【实验目的实验目的】1.1.了解胆固醇氧化酶法测定血清胆固醇的原理。了解胆固醇氧化酶法测定血清胆固醇的原理。2.2.掌握血清胆固醇测定的临床意义。掌握血清胆固醇测定的临床意义。第23页，本讲稿共33页 血清中总胆固醇包括胆固醇酯血清中总胆固醇包括胆固醇酯(CE,70%)(CE,70%)和游离型胆固醇和游离型胆固醇(FC,30%)(FC,30%)。胆固醇酯酶（胆固醇酯酶（CEHCEH）先将胆固醇酯水解为胆固醇和游离脂肪酸）先将胆固醇酯水解为胆固醇和游离脂肪酸（FFAFFA），胆固醇在胆固醇氧化酶（），胆固醇在胆固醇氧化酶（CODCOD）的作用下氧化生成）的作用下氧化生成4-4-胆甾烯酮和过氧化氢。后者经过氧化物酶（胆甾烯酮和过氧化氢。后者经过氧化物酶（PODPOD）催化与）催化与4-4-氨基安替氨基安替比林（比林（4-AAP4-AAP）和酚反应，生成红色的醌亚胺，其颜色深浅与胆固醇）和酚反应，生成红色的醌亚胺，其颜色深浅与胆固醇的含量呈正比，在的含量呈正比，在500nm500nm波长处测定吸光度，与标准管比较可计波长处测定吸光度，与标准管比较可计算出血清胆固醇的含量。反应式如下：算出血清胆固醇的含量。反应式如下：【实验原理实验原理】第24页，本讲稿共33页1.标本：不溶血的血清或血浆标本。血浆用标本：不溶血的血清或血浆标本。血浆用肝素钠、肝素钠、EDTAEDTA抗凝，不可用草酸盐、氟抗凝，不可用草酸盐、氟化物。化物。2.2.取试管取试管3 3支，编号，按下表操作。支，编号，按下表操作。【实验方法实验方法】加入物（ul）测定管标准管空白管血清10-胆固醇标准液-10-蒸馏水-10酶应用液100010001000第25页，本讲稿共33页【计算计算】A A标本标本 CHOCHO（mmol/Lmmol/L）=标准液浓度标准液浓度 AA标准标准 【标准液标准液】胆固醇胆固醇 5.17mmol/L5.17mmol/L（200mg/dL200mg/dL）【正常参考范围正常参考范围】3.10 3.105.70mmol/L 5.70mmol/L 混匀后，混匀后，3737水浴保温水浴保温1515分钟，在分钟，在500nm500nm波长处比波长处比色，以空白管调零，读取各管吸光度。色，以空白管调零，读取各管吸光度。第26页，本讲稿共33页血清甘油三酯的测定（血清甘油三酯的测定（酶法）酶法）【实验目的实验目的】1 1、了解酶法定量测定血清甘油三酯的基本原理。、了解酶法定量测定血清甘油三酯的基本原理。2 2、掌握酶法定量测定血清甘油三酯的实验方法。、掌握酶法定量测定血清甘油三酯的实验方法。第27页，本讲稿共33页 血清中甘油三酯经脂肪酶水解为甘油和脂肪酸，甘油在甘油血清中甘油三酯经脂肪酶水解为甘油和脂肪酸，甘油在甘油激酶（激酶（GKGK）及）及ATPATP存在下，生成存在下，生成3-3-磷酸甘油，尔后，在磷酸甘油氧磷酸甘油，尔后，在磷酸甘油氧化酶（化酶（GPOGPO）作用氧化成磷酸二羟丙酮并生成过氧化氢，过氧化氢与）作用氧化成磷酸二羟丙酮并生成过氧化氢，过氧化氢与底物底物4-4-氨基安替比林和氨基安替比林和ESPASESPAS在过氧化物酶（在过氧化物酶（PODPOD）作用下，生成红）作用下，生成红色亚醌化合物，其颜色深浅与甘油三酯含量成正比。在色亚醌化合物，其颜色深浅与甘油三酯含量成正比。在500nm500nm波长处测波长处测定吸光度，与标准管比较可计算出血清甘油三酯的含量。反应式定吸光度，与标准管比较可计算出血清甘油三酯的含量。反应式如下：如下：甘油三酯甘油三酯 +4H2O +4H2O 脂蛋白脂酶脂蛋白脂酶 甘油甘油 +脂肪酸脂肪酸 甘油甘油 +ATP +ATP 甘油激酶甘油激酶/Mg2+/Mg2+甘油甘油-3-3-磷酸磷酸 +ADP+ADP 甘油甘油-3-3-磷酸磷酸 +O2 +O2 甘油甘油-3-3-磷酸氧化酶磷酸氧化酶 磷酸二羟丙酮磷酸二羟丙酮 +H2O2+H2O2 2H2O2 +ESPAS+4-2H2O2 +ESPAS+4-氨基安替比林氨基安替比林 过氧化物酶过氧化物酶 红色醌亚胺色素红色醌亚胺色素+4H2O+4H2O【实验原理实验原理】第28页，本讲稿共33页1.标本：不溶血的血清或血浆标本。血浆用标本：不溶血的血清或血浆标本。血浆用肝素钠、肝素钠、EDTAEDTA抗凝，不可用草酸盐、氟抗凝，不可用草酸盐、氟化物。化物。2.2.取试管取试管3 3支，编号，按下表操作。支，编号，按下表操作。【实验方法实验方法】加入物（ul）测定管标准管空白管血清10-甘油三酯标准液-10-蒸馏水-10酶应用液100010001000第29页，本讲稿共33页【计算计算】A A标本标本甘油三酯（甘油三酯（mmol/Lmmol/L）=标准液浓度标准液浓度 AA标准标准【标准液标准液】甘油三酯甘油三酯 2.26 mmol/L2.26 mmol/L 【正常参考范围正常参考范围】0.56 0.561.71mmol/L 1.71mmol/L 混匀后，混匀后，3737水浴保温水浴保温1515分钟，在分钟，在500nm500nm波长处比色，波长处比色，以空白管调零，读取各管吸光度。以空白管调零，读取各管吸光度。第30页，本讲稿共33页 葡萄糖在浓酸溶液中（加在含有硼酸的冰醋溶液中），水葡萄糖在浓酸溶液中（加在含有硼酸的冰醋溶液中），水 浴加热至浴加热至100100左右，脱水生成羟甲基呋喃甲醛（或称羟甲基糠醛），后者能与邻甲左右，脱水生成羟甲基呋喃甲醛（或称羟甲基糠醛），后者能与邻甲苯胺缩合生成蓝绿色的化合物，根据颜色深浅并进行苯胺缩合生成蓝绿色的化合物，根据颜色深浅并进行630nm630nm波长比色测波长比色测定其含量。定其含量。实验二十、邻甲苯胺法测血糖含量邻甲苯胺法测血糖含量【实验目的实验目的】掌握邻甲苯胺法测定血糖的原理及方法掌握邻甲苯胺法测定血糖的原理及方法【实验原理实验原理】第31页，本讲稿共33页1 1）取试管四支，按下表操作）取试管四支，按下表操作试剂（ml）测定管（后)标准管空白管血清糖标准蒸馏水邻甲苯胺试剂0.14.00.14.00.14.0【实验方法实验方法】2 2）混匀混匀，置沸水浴中加热，置沸水浴中加热1010分钟，取出立即置冷水中冷却分钟，取出立即置冷水中冷却3 3）用）用630nm630nm波长，以空白管校正吸光度为波长，以空白管校正吸光度为0 0，分别测定各管，分别测定各管吸光度值吸光度值第32页，本讲稿共33页4)4)计算计算【标准液标准液】葡萄糖标准液葡萄糖标准液 0.1 mg/ml0.1 mg/ml 【正常参考范围正常参考范围】3.9 3.96.1mmol/L6.1mmol/L第33页，本讲稿共33页