六六六微生物降解途径的研究进展-1知识讲解.doc

Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。六六六微生物降解途径的研究进展-1-六六六微生物降解途径的研究进展曹礼张浩黄科谷涛洪青*李顺鹏(南京农业大学生命科学学院农业部农业环境微生物重点实验室南京210095)摘要：六六六是一种曾在世界范围内广泛应用的有机氯杀虫剂，具有高毒性和长残留性,在发达国家被限制或禁止使用，但是一些发展中国家和地区仍然被继续使用。即使在一些停用六六六多年的国家，六六六的残留依然存在。本文概述了六六六的各同分异构体的结构、六六六降解菌的多样性和六六六四种主要同分异构体（-、-、-、-HCH）的微生物降解的最新研究进展，为六六六污染地区进行经济可行的生物修复提供参考。关键词：六六六；降解途径；lin基因；高残留AdvancesinmicrobialdegradationpathwayofhexachlorocyclohexaneCaoLiZhangHaoHuangKeGuTaoHongQing*LiShunpeng(DepartmentofMicrobiology,KeyLabofAgriculturalEnvironmentalMicrobiology,MinistryofAgriculture,CollegeofLifeSciences,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095)Abstract：Hexachlorocyclohexane(HCH)isanotorioushalogenatedorganicinsecticide，whichwasonceusedwidelythroughouttheworldforagriculturalandpublichealthpurposes.Hexachlorocyclohexane(HCH)isabroadspectruminsecticidestillusedasacheapbuteffectiveinsecticideinsomeofthedevelopingcountries,thoughdevelopedcountrieshavebannedorcurtaileditsusebecauseofitshightoxicityandrecalcitrantpersistenceintheenvironment.EveninthosecountrieswheretheuseofHCHhasbeendiscontinuedforanumberofyears,theproblemofresiduesofallisomersofHCHremainsbecauseofitspersistence.Inthisarticle,wesummarizedtheconfigurationofHCH-isomers，thediversityofmicroorganismsdegradingHCH，thecurrentprogressregardingmainlyfourHCH-isomers（-,-,-and-HCH）biodegradationpathway.Keywords:Hexachlorocyclohexane；Degradationpathway；lingenes；Highpersistence基金项目：国家自然科学基金项目(No.31070099);*通讯作者：洪青，Tel:86-25-84398685,E-mail:hongqing作者简介：曹礼(1977-)，男，安徽阜阳人，博士研究生，研究方向为环境微生物学与环境工程。E-mail:caolicldr六六六又名六氯环己烷（hexachlorocyclohexane，HCH），是一种有机氯杀虫剂，在上个世纪七十年代前在世界范围内被广泛使用1-5。六六六在环境中的自然降解缓慢，在环境中的半衰期长达几十年，甚至上百年，所以六六六的三种异构体(-,和-HCH)于2010年被联合国环境规划署（UnitedNationsEnvironmentProgramme，简称UNEP）列入持久性有机污染物(persistentorganicpollutants，简称POPs)名单6。在工业上，六六六通过苯和氯气在紫外线照射下合成而得，它是一种含有各种异构体的混合物，被称为工业级六六六3。工业级六六六理论上有8种同分异构体，图1为-、-、-、-、-、-和-HCH的结构，这些异构体由于氯原子在环己烷环上不同的空间排列而有不同的性质7。但是我们通常所说的六六六异构体一般包括五种异构体，即-HCH(6070%),-HCH(512%),-HCH(1012%)，-HCH(610%)和-HCH (34%)6，其他三种异构体因为含量极少又不重要，一般不包括在所谓的六六六总量内。图1六六六七种主要的异构体的氯原子在环己烷环上的空间排列FIG.1AxialversusequatorialarrangementsofchlorineatomsinthefivemajorisomersofHCHplusthelesscommon-and-isomers.Notethata-HCHalsoexistsintwoenantiomeric(and)forms.六六六的广谱毒性和长残留性引起世界范围内广泛关注。Weber等5科学家在2008年估计，全世界共合成了400600万吨六六六释放到环境中，在规模上相当于其它所有持续性有机污染物（POPs）释放数量的总和。据报道，六六六异构体的残留在世界许多国家的空气、水、土壤、食物、牛奶、鱼类和哺乳动物中被检出，甚至人的血液和脂肪组织中，也有六六六残留8-9。即使一些远离六六六生产和使用基地，甚至从来没有生产和使用过六六六的地方，诸如北极、南极和太平洋的环境中也被检测出有六六六的残留8-9。虽然六六六已经在很多国家和地区被限制生产和使用，但是在印度和一些热带国家与地区，六六六仍然在生产使用6，所以它在全世界的残留污染问题依然存在。在六六六微生物降解途径的研究方面，主要的四种异构体均取得了不同程度的进展。其中-HCH与-HCH的微生物降解途径已被阐明，-HCH和-HCH微生物降解的研究是目前环境微生物研究领域的热点，而-HCH的微生物降解途径研究较少而未见报道。1降解六六六的微生物通过微生物对六六六污染环境进行生物修复一直是世界各国环境工作者关注的焦点。通过富集培养分离出许多能够降解HCH的微生物,包括细菌、真菌等4，10。第一株被报道的好氧六六六降解菌是在十九世纪八十年代由日本科学家分离获得，然后其它国家也陆续有相关菌株的报道和研究。-HCH的微生物降解研究较少，其降解微生物和降解途径未见报道。目前好氧降解菌虽然来自全球不同，但大多数集中在Sphingobium。第一株被报道的好氧降解菌是在十九世纪八十年代由日本科学家分离获得，然后其它国家也陆续开展研究。目前大部分对六六六降解的研究主要集中在30个菌株中的三株4:从日本分离到的SphingobiumjaponicumUT2611，从法国分离到的SphingobiumfrancenseSp+12和从印度分离到的SphingobiumindicumB90A13（最初将这三株菌株均鉴定为Sphingomonaspaucimobilis，直到2005年才将它们重新鉴定为Sphingobium属的三个新种14）。其它六六六的降解菌，分别分离筛选于德国、西班牙、中国、日本和印度等被六六六污染的土壤中4，这些六六六的降解菌，在六六六降解的早期阶段有不同的底物特异性。国内报道的六六六菌株主要有BI菌株15和Sphingomonassp.BHC-A菌株16。2六六六的厌氧微生物降解途径的研究进展有关六六六的厌氧降解的报道始于十九世纪六十年代，随后厌氧降解六六六各种异构体的微生物也陆续被发现4，10，最初认为六六六的生物降解主要是一种厌氧的过程，并且、和异构体的六六六的生物降解也被发现，由于异构体的六六六在环境中相对而言最不稳定，至今仍没有报道异构体的六六六的厌氧降解。在六六六厌氧降解途径中，不同的异构体通过一系列厌氧反应最终生成苯或氯苯17-19（如图2）。目前已有报道苯的厌氧矿化20-21，虽然苯和氯苯在好氧条件下很容易被矿化，但是氯苯的厌氧矿化依然未见报道。据我们所知，没有任何厌氧降解六六六的相关基因和酶被报道。而好氧降解六六六的相关基因（lin基因）已经被分离并成功异源表达，并逐渐引起政府部门、企业和科研机构的关注，以发展生物修复技术去改造被六六六污染的地区。图2-和-HCH厌氧代谢途径FIG.2Consensusanaerobicdegradationpathwayof-and-HCH.Notethattwointermediatesthathavebeenproposedbutnotyetobservedempiricallyareshowninsquarebrackets.ThestructuresofTCCHandDCCHareshownintheplanarformatbecausetheirstereochemistrieshavenotbeenestablished.3-和-六六六的好氧微生物降解途径的研究进展-HCH降解途径及其相关基因的研究是上世纪九十年代以来微生物降解研究的热点。日本学者通过近十五年的努力首先从SphingobiumjaponicumUT26克隆到了16个与-HCH降解直接相关基因，在2005年提出了一条完整的-HCH降解途径22-23。如图3，脱氯化氢酶基因（linA）；1,4-TCDN脱氯酶基因（linB）；2,5-DDOL脱氢酶基因（linC）和2,5-DDOL脱氢酶基因linX组成了-HCH生物降解的上游阶段。调节基因（linR）；2,5-DCHQ还原性脱氯酶基因（linD）；氯代对苯二酚1,2双加氧酶基因（linE）和MA还原酶基因（linF）组成了-HCH生物降解的下游阶段23。LinE和LinEb都有催化CHQ生成2,6-DCHQ的活性，但是LinE和LinEb在UT26中主要参与CHQ到2,6-CHQ的反应24。编码琥珀酰辅酶A:3-羰基己二酸辅酶A转移酶基因（linGH）、-酮己二酸硫解酶基因（linJ）以及参与linGH基因表达的调节基因linI虽然也已经被鉴定，但是其表达类型待定23。在六六的上游代谢途径中，有三个代谢产物，即2,5-DCHQ、1,2,4-TCB和2,5-DCP，只有2,5-DCHQ可以在下游代谢途径中进一步被转化，而1,2,4-TCB和2,5-DCP不能被SphingobiumjaponicumUT26进一步降解，称为末端死产物。另外，SphingobiumjaponicumUT26中的脱氯化氢酶（LinA）；1,4-TCDN脱氯酶（LinB）定位在细胞的周质空间25，而两个末端死产物1,2,4-TCB和2,5-DCP在细胞的周质空间一旦产生，将对SphingobiumjaponicumUT26细胞有毒害作用26。现在已经证明，在UT26中有四个基因（linKLMN）编码的ABC转运系统作为一个疏水性物质尤其对2,5-DCP的转运泵来解除这种毒害27。SphingobiumindicumB90A和Sphingomonassp.BHC-A中也存在类似SphingobiumpaucimobilisUT26的-HCH降解途径。而关于-HCH的降解，目前的报道显示六六六的a和异构体有相似的代谢途径，只有第一个脱氯酶催化的反应不同，它和-HCH采用相同的途径28。图3-HCH在SphingobiumjaponicumUT26中的降解途径Fig.3Proposeddegradationpathwaysof-HCHinS.japonicumUT26.1,-HCH;2,-五氯环己烯（-PCCH）；3,1,3,4,6-四氯-1,4-环己二烯(1,4-TCDN)；4,1,2,4-三氯苯(1,2,4-TCB)；5,2,4,5-三氯-2,5-环己二烯-1-醇(2,4,5-DNOL)；6,2,5-二氯苯酚(2,5-DCP)；7,2,5-二氯-2,5-环己二烯-1,4-二醇(2,5-DDOL)；8,2,5-二氯对苯二酚（2,5-DCHQ）；9,氯代对苯二酚（CHQ）；10,对苯二酚（HQ）；11,酰氯；12,-羟基己二烯二酸半醛(-HMSA)；13,顺丁烯乙酸（MA）；14,-酮己二酸；15，-酮己二酸辅酶A；16，乙酰辅酶A；17，琥珀酰辅酶A；GSH，谷胱甘肽4-六六六的好氧微生物降解途径的研究进展国际上对于-HCH的微生物降解的研究进展较为缓慢。已分离出的六六六降解菌中，大多数对于和异构体具有良好的降解效果，而对于异构体则没有降解效果，在少数的报道的可以降解异构体的细菌中，大多数对于异构体的降解又极为缓慢，例如SphingobiumjaponicumUT26，在使用高浓度的细胞时才能表现出对异构体极微弱的降解能力29。SphingobiumindicumB90A是目前报道的具有较强降解能力的菌株30。最近，在研究异构体的降解基因方面获得了突破，研究发现在SphingobiumjaponicumUT26中的linB基因编码的酶LinB可以催化-HCH转化为-五氯环己醇(PCHL)，而PCHL则作为终产物不能再被LinB催化降解29。Sphingomonassp.BHC-A对六六六的四种异构体都有很好的降解效果16，如图4，从中克隆到的linB基因（linB2）编码的酶LinB2不仅可以转化-HCH为-PCHL，同时也可以继续催化-PCHL的转化，形成终产物-TDOL31。除此之外，还未见其它关于-HCH的微生物降解方面的报道。图4HCH在Sphingomonassp.BHC-A中的降解途径Fig.4Proposedinitialpathwayfor-HCHdegradation.Compounds:1-HCH,2-PCHL,3-TDOL5-六六六的好氧微生物降解途径的研究进展在六六六四种异构体的微生物降解方面，-HCH是目前研究的最模糊的异构体。主要是一些在厌氧环境下降解方面的报道32-36。目前国际上已经报道的可以降解-HCH的菌株SphingobiumjaponicumUT26，SphingobiumfrancenseSp+和SphingobiumindicumB90A等虽然在好氧条件下对-HCH均有不同程度的降解作用，但是-HCH的完整降解途径还没有解析，相关基因方面的报道更少。1993年YujiNagata报道了来源于UT26菌株的脱氯化氢酶LinA可以转化-HCH为-PCCH37。2001年TrantirekL在研究LinA作用机理的基础上再次报道了LinA可以转化-HCH为-PCCH，并且-PCCH为LinA转化的终产物38。2006年Sharma等报道了SphingobiumindicumB90A中的脱氯酶LinB可以转化-HCH为-PCCH，并继续转化为-TDOL39。而在Sphingomonassp.BHC-A中，如图5，-HCH可以被LinA连续脱氯化氢，转化为-1,4-TCDN，中间产生-PCCH。同时反应体系中的这三种物质（-HCH，-PCCH和-1,4-TCDN）又都可以作为LinB2的底物，通过三种不同的脱氯反应被LinB2转化40。这也是-HCH到目前为止文献报道的最新进展。Fig.5.由LinA和LinB2组成的-HCH的降解途径Fig5Proposeddegradationpathwayof-HCHbyLinAandLinB2.1,-六六六(-HCH);2,-无氯环己烷(-PCCH);3,-1,3,4,6-四氯-1,4-环己二烯(-1,4-TCDN);4,1,2,4-三氯苯(1,2,4-TCB);5,-2,3,4,5,6-五氯环己醇(-PCHL);6,-2,3,5,6-四氯-1,4-环己二醇(-TDOL);7,-2,3,5-三氯-5-环己烯-1,4-二醇(-2,3,5-TCDL);8,-2,4,5-三氯-2,5-环己二烯-1-ol(-2,4,5-DNOL);9,-2,5-二氯-2,5-环己二烯-1,4-二醇(-DDOL);10,2,5-二氯苯酚l(2,5-DCP).6结论从六六六开始使用到现在6070年的时间里，六六六的高毒性和长期的残留性已经引起了广泛的关注。在各种去除六六六污染的措施中，通过微生物对六六六污染环境进行的生物修复因其高效、安全、成本低、无二次污染等优点而具有美好的发展前景。目前，菌株SphingobiumjaponicumUT26和SphingobiumindicumB90A的全基因组测序已经完成，随着研究的深入，六六六代谢途径的解析，尤其对-HCH和-HCH代谢途径的彻底阐明、六六六新的降解基因的研究、以及降解酶构象和动力学的研究等，将会有新的进展，这将大大有助于对六六六的污染产品或地区开展高效而彻底的修复工作。参考文献1BreivikK,PacynaJM,MunchJ.Useof-,-,-hexachlorocyclohexaneinEurope,19701996J.SciTotalEnviron,1999,239:151163.2LiYF.Globaltechnicalhexachlorocyclohexaneusageanditscontaminationconsequencesintheenvironment:from1948to1997J.SciTotalEnviron,1999,232:121158.3RupLal,GunjanPandey,PoojaSharma,etal.BiochemistryofmicrobialdegradationofhexachlorocyclohexaneandprospectsforbioremediationJ.MicrobiolMolRev,2010,(74)1:5880.4VijgenJ,LFYi,MForter,RLal,etal.ThelegacyoflindaneandtechnicalHCHproductionJ.OrganohalogComp,2006,68:899904.5WeberRC,GausM,TysklindP,etal.Dioxin-andPOP-contaminatedsitescontemporaryandfuturerelevanceandchallengesJ.Environ.Sci.Pollut.Res.2008,15:363393.6JVijgen,P.C.Abhilash,YiFanLi,etal.Hexachlorocyclohexane(HCH)asnewstockholmconventionPOPsaglobalperspectiveonthemanagementofLindaneanditswasteisomersJ.EnvironSciPollutRes,2011,18:152162.7WillettKL,UlrichEM,HitesRA.DifferentialtoxicityandenvironmentalfateofhexachlorocyclohexaneisomersJ.EnvironSciTechnol,1998,32:219722078IwataHS,TanabeN,SakaiA,etal.Geographicaldistributionofpersistentorganochlorinesinair,waterandsedimentsfromAsiaandOceania,andtheirimplicationsforglobaldistributionfromlowerlatitudesJ.Environ.Pollut.,1994,85:1533.9WalkerK,DAVallero,RGLewis.FactorsinfluencingthedistributionoflindaneandotherhexachlorocyclohexanesintheenvironmentJ.Environ.Sci.Technol.1999,33:43734378.10张海燕，李梅，邱星辉。持久性有机污染物-六六六生物降解研究进展J.微生物学通报,2005,34(5):96-969.11ImaiR,NagataY,SenooK.Dehydrochlorinationof-hexachlorocyclohexane(-BHC)by-BHC-assimilatingPseudomonaspaucimobilisJ.AgricBiolChem,1989,53:2015-2017.12DograC,PalR,LalS,etal.OrganizationoflingenesandIS6100amongdifferentstrainsofhexachlorocyclohexane-degradingSphingomonaspaucimobilis:evidenceforhorizontalgenetransferJ.JBacteriol,2004,186:2225-2235.13SahuSK,PatnaikKK,SharmilaM,etal.Degradationofalpha-,beta-,gamma-hexachlorocyclohexanebyasoilbacteriumunderaerobicconditionsJ.ApplEnvironMicrobiol,1990,56:3620-3622.14PalR,BalaS,DadhwalM.Hexachlorocyclohexane-degradingbacterialstrainsSphingomonaspaucimobilisB90A,UT26andSp+havingsimilarlingenesrepresentthreedistinctspecies,Sphingobiumindicumsp.nov.,Sphingobiumjaponicumsp.nov.andSphingobiumfrancensesp.nov.,andreclassificationofSphingomonaschungbukensisasSphingobiumchungbukensecomb.novJ.IntJSystEvolMicrobiol,2005,55:1965-1972.15刘继芳，逄焕成,严慧峻,等.农业用微生物对六六六污染土壤进行生物修复的初步试验研究J.农业与环境生物学报,2003,22:677-680.16马爱芝,武俊,汪婷,等.六六六(HCH)降解菌Sphingomonassp.BHC-A的分离和降解特性的研究J.微生物学报,2005,45(5):728-732.17BelandFA,SOFarwell,AERobocker,etal.ElectrochemicalreductionandanaerobicdegradationoflindaneJ.JAgricFoodChem,1976,24:753756.18BoyleAW,MMHaggblom,LYYoung.Dehalogenationoflindane(-hexachlorocyclohexane)byanaerobicbacteriafrommarinesedimentsandbysulfate-reducingbacteriaJ.FEMSMicrobiolEcol,1999,29:379387.19MiddeldorpPJ,MJaspers,AJBZehnder,etal.BiotransformationofhexachlorocyclohexaneundermethanogenicconditionsJ.EnvironSciTechnol,1996,30:23452349.20EdwardsEA,DGrbic-Galic.CompletemineralizationofbenzenebyaquifermicroorganismsunderstrictlyanaerobicconditionsJ.ApplEnvironMicrobiol,1992,58:26632666.21Rooney-VargaJN,RTAnderson,JLFraga,etal.Microbialcommunitiesassociatedwithanaerobicbenzenedegradationinapetroleum-contaminatedaquiferJ.ApplEnvironMicrobiol,1999,65:30563063.22NagataY,MiyauchiK,TakagiM.Completeanalysisofgenesandenzymesfor-hexachlorocyclohexanedegradationinSphingomonaspaucimobilisUT26J.JIndMicrobiolBiotechnol,1999,23:380390.23EndoR,KamakuraM,MiyauchiK,etal.Identificationandcharacterizationofgenesinvolvedinthedownstreamdegradationpathwayof-hexachlorocyclohexaneinSphingomonaspaucimobilisUT26J.JBacteriol,2005,187:847-853.24YujiNagata,RyoEndo,MichihiroIto,etal.Aerobicdegradationoflindane(-hexachlorocyclohexane)inbacteriaanditsbiochemicalandmolecularbasisJ.ApplMicrobiolBiotechnol,2007,76:741752.25NagataY,FutamuraA,MiyauchiK,etal.Twodifferenttypesofdehalogenase,LinAandLinB,whichareinvolvedinthe-HCHdegradationinSphingomonaspaucimobilisUT26,arelocalizedinperiplasmicspacewithoutmolecularprocessingJ.JBacteriol,1999,181:54095413.26EndoR,OhtsuboY,TsudaM,etal.Growthinhibitionbymetabolitesof-hexachlorocyclohexaneinSphingobiumjaponicumUT26J.BiosciBiotechnolBiochem,2006,70:1029103227EndoR,OhtsuboY,TsudaM,etal.IdentificationandcharacterizationofgenesencodingaputativeABC-typetrans-porteressentialfortheutilizationof-hexachlorocyclohexaneinSphingobiumjaponicumUT26J.JBacteriol,2007,189:37123720.28RupL,CharuD,ShwetaM,etal.Diversity,distributionanddivergenceoflingenesinhexachlorocyclohexane-degradingSphingomonadsJ.TrendsBiotechnol,2006,(24):121-130.29NagataY,ProkopZ,SatoY,etal.Degradationof-hexachlorocyclohexanebyhaloalkanedehalogenaseLinBfromSphingomonaspaucimobilisUT26J.ApplEnvironMicrobiol,2005,71:2183-2185.30DerMeerJR,HolligerC,LalR.CloningandcharacterizationoflingenesresponsibleforthedegradationofhexachlorocyclohexaneisomersbySphingomonaspaucimobilisstrainB90AJ.ApplEnvironMicrobiol,2002,68:6021-6028.31WuJun,HongQing,HanPeng,etal.AGenelinB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