分子生物学问答题教学文案.doc

Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。分子生物学问答题-分子生物学问答题（一）、病毒、原核、真核基因组的特点？答：1、病毒基因组的特点： 种类单一；单倍体基因组：每个基因组在病毒中只出现一次；形式多样；大小不一；基因重叠；动物/细菌病毒与真核/原核基因相似：内含子；具有不规则的结构基因；基因编码区无间隔：通过宿主及病毒本身酶切；无帽状结构；结构基因没有翻译起始序列。2、原核基因组的特点：为一条环状双链DNA；只有一个复制起点；具有操纵子结构；绝大部分为单拷贝；可表达基因约50%，大于真核生物小于病毒；基因一般是连续的，无内含子；重复序列很少。3、真核基因组的特点：真核生物基因组远大于原核生物基因组，结构复杂，基因数庞大，具有多个复制起点；基因组DNA与蛋白质结合成染色体，储存于细胞核内；真核基因为单顺反子，而细菌和病毒的结构基因多为多顺反子；基因组中非编码区多于编码区；真核基因多为不连续的断裂基因，由外显子和内含子镶嵌而成；存在大量的重复序列；功能相关的基因构成各种基因家族；存在可移动的遗传因素；体细胞为双倍体，而精子和卵子为单倍体。（二）、乳糖操纵子的作用机制？答：1、乳糖操纵子的组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列O，一个启动子P和一个调节基因I。2、阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时，I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O处，乳糖操纵子处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时，乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。所以，乳糖操纵子的这种调控机制为可诱导的负调控。3、CAP的正性调节：在启动子上游有CAP结合位点，当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时，cAMP浓度升高，与CAP结合，使CAP发生变构，CAP结合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP结合位点，激活RNA聚合酶活性，促进结构基因转录，调节蛋白结合于操纵子后促进结构基因的转录，对乳糖操纵子实行正调控，加速合成分解乳糖的三种酶。4、协调调节：乳糖操纵子中的I基因编码的阻遏蛋白的负调控与CAP的正调控两种机制，互相协调、互相制约。（三）、真核生物转录水平的调控机制？答：真核生物在转录水平的调控主要是通过反式作用因子、顺式作用元件和RNA聚合酶的相互作用来完成的，主要是反式作用因子结合顺式作用元件后影响转录起始复合物的形成过程。1、 转录起始复合物的形成：真核生物RNA聚合酶识别的是由通用转录因子与DNA形成的蛋白质-DNA复合物，只有当一个或多个转录因子结合到DNA上，形成有功能的启动子，才能被RNA聚合酶所识别并结合。转录起始复合物的形成过程为：TFD结合TATA盒；RNA聚合酶识别并结合TFD-DNA复合物形成一个闭合的复合物；其他转录因子与RNA聚合酶结合形成一个开放复合物。在这个过程中，反式作用因子的作用是：促进或抑制TFD与TATA盒结合；促进或抑制RNA聚合酶与TFD-DNA复合物的结合；促进或抑制转录起始复合物的形成。2、 反式作用因子：一般具有三个功能域（DNA识别结合域、转录活性域和结合其他蛋白结合域）；能识别并结合上游调控区中的顺式作用元件；对基因的表达有正性或负性调控作用。3、 转录起始的调控：反式作用因子的活性调节：表达式调节反式作用因子合成出来就具有活性；共价修饰磷酸化和去磷酸化，糖基化；配体结合许多激素受体是反式作用因子；蛋白质与蛋白质相互作用蛋白质与蛋白质复合物的解离与形成。反式作用因子与顺式作用元件的结合：反式作用因子被激活后，即可识别并结合上游启动子元件和增强子中的保守性序列，对基因转录起调节作用。反式作用因子的作用方式成环、扭曲、滑动、Oozing。反式作用因子的组合式调控作用：每一种反式作用因子结合顺式作用元件后虽然可以发挥促进或抑制作用，但反式作用因子对基因调控不是由单一因子完成的而是几种因子组合发挥特定的作用。（四）、真核生物转录后水平的调控机制？答：（1）、5，端加帽和3，端多聚腺苷酸化的调控意义：5，端加帽和3，端多聚腺苷酸化是保持mRNA稳定的一个重要因素，它至少保证mRNA在转录过程中不被降解。（2）、mRNA选择性剪接对基因表达调控的作用（3）、mRNA运输的控制（五）、受体的特点？答：1、高度专一性；2、高度亲和性；3、可逆性；4、可饱和性；5、特定的作用模式（六）、表皮生长因子介导的信号传导途径？答：表皮生长因子受体是一个典型的蛋白酪氨酸激酶受体，这个信号转导途径的主要步骤是：1、 受体二聚化的形成及其磷酸化：表皮生长因子与受体的结合使受体发生二聚化，从而改变受体构象，使蛋白酪氨酸激酶活性增强，受体自身的几个蛋白酪氨酸残基在激酶的作用下发生磷酸化。2、 募集接头蛋白Grb2：表皮生长因子受体自身被磷酸化后，不仅其激酶活性增强，而且其构象发生变化，从而适合与含SH2结构域的蛋白分子相结合。Grb2是作为接头蛋白结合到受体上。3、 调控分子SOS的活化：SOS含有可与SH3结构域相结合的富含脯氨酸基序，当Grb2结合到磷酸化的表皮生长因子受体后，它的两个SH3结构域即可结合SOS，使之活化。4、 低分子量G蛋白Ras的活化：SOS可促进Ras释放GDP，结合GTP的反应，使Ras激活。活化的Ras作用其下游分子Raf，使之活化。Raf是MAPK级联反应的第一个分子，由此启动了MAPK的三级激活过程。5、 MAPK的级联激活：Raf是一种MAPKKK，它作用于MEK，使之磷酸化而激活，活化的MEK在作用于MAPK家族的ERK1，使之磷酸化激活由此完成了三级激活。6、 转录因子的磷酸化及转录调控作用：活化的ERK可以转至细胞核内，使某些转录调控因子发生磷酸化，从而影响基因的转录。（七）、cAMP信号转导途径？答：1、组成：胞外信息分子（主要是胰高血糖素、肾上腺素和促肾上腺皮质激素），受体，G蛋白，AC，cAMP,PKA。2、途径：? 信号分子与受体结合，引起受体构象变化? 受体活化G蛋白? 活化后的G蛋白激活腺苷酸环化酶（AC）? AC催化ATP生成cAMP? cAMP活化PKA，PKA使目标蛋白磷酸化，调节代谢酶的活性或调节基因的表达（八）、IP3-Ca2+信号途径：? 信号分子与受体结合，引起受体构象变化? 受体活化G蛋白? 活化后的G蛋白激活PLC? PLC水解PIP2生成IP3和DG? IP3使钙通道打开，细胞内Ca2+升高? Ca2+与CaM结合，激活Ca2+-CaM依赖的蛋白激酶? Ca2+-CaM依赖的蛋白激酶使目标蛋白磷酸化。（九）、分子克隆中常用的工具酶及良好载体的条件？答：（1）、常用的工具酶1、 限制性核酸内切酶：是细菌产生的一类能识别和切割双链DNA分子内特定的碱基顺序的核酸水解酶。2、 DNA连接酶：将两段DNA分子拼接起来的酶。3、 DNA聚合酶：催化单核苷酸链延伸。4、 逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶，这是一种有效的转录RNA成为DNA的酶，产物DNA又称互补DNA。5、 末端脱氧核糖核酸转移酶：将脱氧核糖核酸加到DNA的3末端。6、 碱性磷酸酶：催化去除DNA、RNA等的5磷酸基团。7、 依赖DNA的RNA聚合酶：识别特异性启动子，RNA转录。（2）、良好载体的条件1、必须有自身的复制子；2、载体分子上必须有限制性核酸内切酶的酶切位点，即多克隆位点，以供外源DNA插入；3、载体应具有可供选择的遗传标志，以区别阳性重组子和阴性重组子；4、载体分子必须有足够的容量；5、可通过特定的方法导入细胞；6、对于表达载体还应具备与宿主细胞相适应的启动子、前导顺序、增强子、加尾信号等DNA调控元件。（十）、蓝-白筛选的原理？答：某些质粒带有大肠杆菌的半乳糖苷酶基因片段，在半乳糖苷酶基因的基因区外又另外引入了一段含多种单一限制酶位点的DNA序列。这些位点上如果没有克隆外源性DNA片段，在质粒被导入lac-的大肠杆菌后，质粒携带的半乳糖苷酶基因将正常表达，与大肠杆菌的半乳糖苷酶基因互补，产生有活性的半乳糖苷酶，加入人工底物X-gal和诱导剂IPTG后，出现蓝色的菌落。如果在多克隆位点上插入外源DNA片段，将使lacZ基因灭活，不能生成半乳糖苷酶，结果菌落出现白色。由于这种颜色标志，重组克隆和非重组克隆的区分一目了然。十一）SANGER双脱氧链终止法的原理？答：DNA链中核苷酸以3,5-磷酸二酯键连接，合成DNA所用的底物是2-脱氧核苷三磷酸。2,3ddNTP与普通dNTP不同，它们在脱氧核糖的3位置缺少一个羟基。在DNA聚合酶作用下通过三磷酸基团掺入到延伸的DNA链中，但由于没有3羟基，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，因此，正在延伸的DNA链不能继续延伸。在DNA合成反应混合物的4种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP，链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止竞争，产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于引物末端到出现过早链终止位置间的距离。在4组独立酶反应中分别采用4种不同的ddNTP，结果将产生4组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的A、C、G或T位置。（十二）、核酸分子杂交的原理？答：具有互补序列的两条单链核酸分子在一定的条件下（适宜的温度及离子强度等）碱基互补配对结合，重新形成双链；在这一过程中，核酸分子经历了变性和复性的变化，以及在复性过程中个分子间键的形成和断裂。杂交的双方是待测核酸和已知序列。（十三）、影响杂交的因素？答：1、核酸分子的浓度和长度：核酸浓度越大，复性速度越快。探针长度应控制在50-300个碱基对为好。2、温度：温度过高不利于复性，而温度过低，少数碱基配对形成的局部双链不易解离，适宜的温度是较TM值低25度。3、离子强度：在低离子强度下，核酸杂交非常缓慢，随着离子强度的增加，杂交反应率增加。高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，所以进行序列不完全同源的核酸分子杂交时必须维持杂交反应液中的盐浓度和洗膜液中的盐浓度。4、杂交液中的甲酰胺：甲酰胺能降低核酸杂交的TM值。它有以下优点：在低温下探针更稳定；能更好地保留非共价结合的核酸。5、核酸分子的复杂性：是指存在于反应体系中的不同顺序的总长度。两个不同基因组DNA变性后的相对杂交速率取决于样品浓度绝对一致时的相对复杂性（即DNA中的碱基数）。6、非特异性杂交反应：在杂交前应对非特异性杂交反应位点进行封闭，以减少其对探针的非特异性吸附作用。（十四）、探针的种类和优缺点？答：1、cDNA探针：通过逆转录获得cDNA后，将其克隆于适当的克隆载体，通过扩增重组质粒而使cDNA得到大量的扩增。提取质粒后分离纯化作为探针使用。它是目前应用最为广泛的一种探针。2、基因组探针：从基因组文库里筛选得到一个特定的基因或基因片段的克隆后，大量扩增、纯化，切取插入片段，分离纯化为探针。3、寡核苷酸探针：根据已知的核酸顺序，采用DNA合成仪合成一定长度的寡核苷酸片段作为探针。4、RNA探针：采用基因克隆和体外转录的方法可以得到RNA或反义RNA作为探针。（十五）、探针的标记法？答：1、缺口平移法：此法是利用适当浓度的DNase在DNA双链上随机切割单链，造成单链切口。切口处产生一个5末端和3末端，3末端就可以作为引物，在大肠杆菌DNA聚合酶的催化下，以互补的DNA单链为摸板，依次将dNTP连接到切口的3末端的羟基上，合成新的DNA单链；同时DNA聚合酶的53的核酸外切酶活性在切口处将旧链从5末端逐步切除，新合成链不断延伸，从而使原DNA分子上的部分核苷酸残基被标记的核苷酸所取代。2、随机引物法：随机引物是人工合成的长度为6个寡核苷酸残基的寡聚核苷酸片段的混合物。对于任何一个用作探针的DNA片段，随机引物混合物中都会有一些六核苷酸片段可以与之结合，起到DNA合成引物的作用。将这些引物与变性的DNA单链结合后，以4种dNTP（其中一种是标记物标记的dNTP）为底物，合成与探针DNA互补的切带有标记物的DNA探针。3、PCR标记法：在PCR反应底物中，将一种dNTP换成标记物标记的dNTP，这样标记的dNTP就在PCR反应的同时掺入到新合成的DNA链上。4、末端标记法：只是将DNA片段的一端进行标记。（十六）、PCR的基本原理？答：PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理是依据细胞内DNA半保留复制的机理，以及体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链，单链DNA与人工合成的引物退火，然后耐热DNA聚合酶以dNTP为原料使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。PCR全过程每一步的转换是通过温度的改变来控制的。需要重复进行DNA模板解链、引物与模板DNA结合、DNA聚合酶催化新生DNA的合成，即高温变性、低温退火、中温延伸个步骤构成PCR反应的一个循环，此循环的反复进行，就可使目的DNA得以迅速扩增。DNA模板变性：模板双链DNA?单链DNA，94。退火：引物单链DNA?杂交链，引物的Tm值。引物的延伸：温度至70左右，TaqDNA聚合酶以种dNTP为原料，以目的DNA为模板，催化以引物末端为起点的53DNA链延伸反应，形成新生DNA链。新合成的引物延伸链经过变性后又可作为下一轮循环反应的模板PCR，就是如此反复循环，使目的DNA得到高效快速扩增。（十七）、PCR引物设计的基本要求？答：1、引物长度一般为1530个核苷酸。过短影响PCR的特异性，过长会提高相应退火温度，使延伸温度超过TaqDNA聚合酶最适温度74,影响产物的生成。2、引物的碱基尽可能随机，避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积现象。3端不应有连续3个G和C。否则会使引物和模板错误配对。G+C含量一般占45-55。3端和5端引物具有相似的Tm值,Tm值计算公式：Tm4(G+C)+2(A+T)3、引物自身不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。引物的连续互补序列，一般不超过3bp。4、两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3端的互补重叠。5、引物与非特异扩增区的序列的同源性不超过70，引物3末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。6、引物3端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对。引物3端最佳碱基选择是G和C，形成的碱基配对比较稳定。7、引物与模板结合时，引物的5端最多可以游离十几个碱基而不影响PCR反应的进行。8、引物的5端可以修饰，如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列包括起始密码子、终止密码子等（十八）、PCR的反应条件？答：1、PCR反应的缓冲液：? Tris-HCl缓冲液? KCl促进引物的退火，浓度太高时会抑制TaqDNA聚合酶活性。? 加入BSA或明胶有利于保护TaqDNA聚合酶活性。? 必要时加入适量二甲基亚砜(DMSO)或甲酰胺利于破坏模板二级结构，提高PCR反应特异性。2、镁离子浓度一般用量1.5-2.0mmol/L，TaqDNA聚合酶活性需要Mg2+。Mg2+浓度过低，会显著降低酶活性。Mg2+浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。Mg2+浓度还会影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度，从而影响扩增片段的产率。 3、底物浓度工作浓度20-200umol/L，dNTPs浓度过高可加快反应速度，也增加碱基的错配率和实验成本。降低浓度会导致反应速度下降，可提高反应的特异性。在PCR反应中，4种dNTP必须以等摩尔浓度配制，以减少PCR反应的错配误差并提高使用效率。4、TaqDNA聚合酶75-80时具有最高的聚合酶活性，150个核苷酸/秒；具有良好的热稳定性，95仍有活性，应用浓度一般为1-2.5u/100ul反应体积。5、引物0.1-0.5umol/L。引物浓度偏高会引起错配或非特异性扩增、生成引物二聚体，使目的DNA片段产率下降。退火温度与引物Tm值有关，引物Tm值在55-80范围较为理想。6、反应温度和循环次数（十九）、影响大肠杆菌系统外源基因表达的因素？答：1、启动子的强弱；2、基因的剂量；3、影响RNA转录和翻译效率的因素：SD序列、mRNA；4、外源基因密码子的选择；5、表达产物的大小；6、表达产物的稳定性。（二十）、大肠杆菌系统表达外源基因必须具备的条件？答：1、要求外源基因的编码区不能含有内含子；2、表达的外源片段要位于大肠杆菌启动子的下游，并形成正确的阅读框架；3、转录出的mRNA必须有与大肠杆菌16SrRNA3，末端相匹配的SD序列，才能被有效的翻译成蛋白质。4、蛋白产物必须稳定，不易被细胞内蛋白酶快速降解，且对宿主无害。（二十一）、真核细胞表达外源基因的条件？答：1、首先必须具备哺乳动物细胞表达的功能元件。要求哺乳动物细胞表达载体带有能在真核细胞中表达外源基因的真核转录调控元件；2、注意选择转染的受体细胞，不同类型的细胞具有不同的特性；3、注意选择适当的选择标记。（二十二）、转基因动物的概念、原理及应用？答：1、概念：是指用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，并能稳定传代的一类动物。它的特点是“分子及细胞水平操作，组织及动物整体水平表达”。2、基本原理：将目的基因或基因组片段用显微注射等方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中，使目的基因整合到基因组中，然后将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植入受体动物的输卵管或子宫中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物，人们可以通过分析转基因和动物表型的关系，揭示外源基因的功能；也可以通过转入外源基因培育优良的动物品种。3、应用：建立用于研究外源基因表达调控体系；建立医学中常用的疾病模型；培育动物新品种；药理学和药用蛋白的生产研究。（二十三）、基因敲除的基本程序？答：通过DNA同源重组，使得胚胎干细胞特定的内源基因被破坏而造成功能丧失，然后通过胚胎干细胞介导得到该基因丧失的小鼠模型的过程称为基因敲除。1、 打靶载体的构建：同源序列要足够长，要含有筛选用的标志基因。2、 胚胎干细胞的体外培养3、 打靶载体导入胚胎干细胞4、 同源重组胚胎干细胞的筛选5、 基因敲除胚胎干细胞注射入胚泡6、 胚泡植入假孕小鼠的子宫中7、 杂交育种获得纯合的基因敲除动物（二十四）、DNA芯片的原理？答：DNA芯片技术就是一种大规模的集成的固相核酸分子杂交，以大量已知碱基序列的寡核苷酸片段为探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后通过定性定量分析得出待测样品的基因序列及表达的信息。其方法包括芯片的制备、样品的准备、分子杂交和检测分子。（二十五）、诱变剂的作用机制？答：1、碱基的类似物诱发突变2、改变DNA的化学结构3、结合到DNA分子上诱发移码突变4、紫外线及其他射线引起的DNA分子的变化（二十六）、突变类型及其遗传效应？答：1、突变类型： 点突变：DNA大分子上一个碱基的变异。分为转换和颠换。 缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。 插入：一个原来没有的碱基或一段原来没有的核苷酸链插入到DNA大分子中间。 倒位：DNA链内重组，使其中一段方向倒置。2、突变的遗传效应：遗传密码的改变：错义突变、无义突变、同义突变、移码突变 对mRNA剪接的影响：一是使原来的剪接位点消失；二是产生新的剪接位点。 蛋白质肽链中的片段缺失：（二十七）、基因治疗的策略？答：1、基因置换或称基因矫正：特定的目的基因导入特定的细胞，通过定位重组，让导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因，不涉及基因组的任何改变。分子生物学试题及答案.（二十八）细胞凋亡的特点和癌症发生的关系?答:细胞凋亡是生物界广泛存在的一种基本生命现象，如同细胞生长、发育、增殖一样，起着十分重要的作用。目前认为，诱导凋亡的细胞外刺激必须通过细胞内一系列信号传递，造成选择性的在核小体之间断裂是其重要标志之一。 细胞凋亡是以细胞核浓缩、染色体DNA被以核小体为单位切成梯状片段（ladder）、细胞缩小，最终形成细胞凋亡小体等形态变化为特征。不引起周围细胞的溶解。细胞凋亡是在细胞群中散发，阶段性进行，并且依存于的供给和、蛋白质的合成，是主动排除机制。不仅在个体发育时和卵细胞退缩等生理状态下可观察到，而且在自身免疫性疾病、神经变质性疾病、缺血性疾病等很多疾病及病理状态下也可观察到。细胞凋亡的生物学功能（1）清除无用的或多余的细胞，人脑在发育过程中有95%的细胞死亡。（2）除去不再起作用的细胞。如蝌蚪变态时的尾部细胞死亡；哺乳动物子宫内膜上皮细胞在月经期死亡。（3）除去发育不正常的细胞。如脊椎动物视觉系统的发育，没有形成正确神经元连接的神经元被清除掉。（4）除去一些有害细胞，胸腺细胞在离开胸腺之前被诱导死亡一、名词解释1cDNA与cccDNA：cDNA是由mRNA通过反转录酶合成的双链DNA；cccDNA是游离于染色体之外的质粒双链闭合环形DNA。2标准折叠单位：蛋白质二级结构单元螺旋与折叠通过各种连接多肽可以组成特殊几何排列的结构块，此种确定的折叠类型通常称为超二级结构。几乎所有的三级结构都可以用这些折叠类型，乃至他们的组合型来予以描述，因此又将其称为标准折叠单位。3CAP：环腺苷酸（cAMP）受体蛋白CRP（cAMPreceptorprotein），cAMP与CRP结合后所形成的复合物称激活蛋白CAP（cAMPactivatedprotein）4回文序列：DNA片段上的一段所具有的反向互补序列，常是限制性酶切位点。5micRNA：互补干扰RNA或称反义RNA，与mRNA序列互补，可抑制mRNA的翻译。6核酶：具有催化活性的RNA，在RNA的剪接加工过程中起到自我催化的作用。7模体：蛋白质分子空间结构中存在着某些立体形状和拓扑结构颇为类似的局部区域8信号肽：在蛋白质合成过程中N端有1536个氨基酸残基的肽段，引导蛋白质的跨膜。9弱化子：在操纵区与结构基因之间的一段可以终止转录作用的核苷酸序列。10魔斑：当细菌生长过程中，遇到氨基酸全面缺乏时，细菌将会产生一个应急反应，停止全部基因的表达。产生这一应急反应的信号是鸟苷四磷酸(ppGpp)和鸟苷五磷酸（pppGpp）。PpGpp与pppGpp的作用不只是一个或几个操纵子，而是影响一大批，所以称他们是超级调控子或称为魔斑。11上游启动子元件：是指对启动子的活性起到一种调节作用的DNA序列，-10区的TATA、-35区的TGACA及增强子，弱化子等。12DNA探针：是带有标记的一段已知序列DNA，用以检测未知序列、筛选目的基因等方面广泛应用。13SD序列：是核糖体与mRNA结合序列，对翻译起到调控作用。14单克隆抗体：只针对单一抗原决定簇起作用的抗体。15考斯质粒：是经过人工构建的一种外源DNA载体，保留噬菌体两端的COS区，与质粒连接构成。16蓝-白斑筛选：含LacZ基因（编码半乳糖苷酶）该酶能分解生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入后，LacZ基因不能表达，菌株呈白色，以此来筛选重组细菌。称之为蓝-白斑筛选。17顺式作用元件：在DNA中一段特殊的碱基序列，对基因的表达起到调控作用的基因元件。18Klenow酶：DNA聚合酶I大片段，只是从DNA聚合酶I全酶中去除了53外切酶活性19锚定PCR：用于扩增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分别用多聚dC和已知的序列作为引物进行PCR扩增。20融合蛋白：真核蛋白的基因与外源基因连接，同时表达翻译出的原基因蛋白与外源蛋白结合在一起所组成的蛋白质。二、填空1  DNA的物理图谱是DNA分子的（限制性内切酶酶解）片段的排列顺序。2  RNA酶的剪切分为（自体催化）、（异体催化）两种类型。3原核生物中有三种起始因子分别是（IF-1）、（IF-2）和（IF-3）。4蛋白质的跨膜需要（信号肽）的引导，蛋白伴侣的作用是（辅助肽链折叠成天然构象的蛋白质）。5启动子中的元件通常可以分为两种：（核心启动子元件）和（上游启动子元件 ）。6分子生物学的研究内容主要包含（结构分子生物学）、（基因表达与调控）、（DNA重组技术）三部分。7证明DNA是遗传物质的两个关键性实验是（肺炎球菌感染小鼠）、（T2噬菌体感染大肠杆菌）这两个实验中主要的论点证据是：（生物体吸收的外源DNA改变了其遗传潜能）。8hnRNA与mRNA之间的差别主要有两点：（hnRNA在转变为mRNA的过程中经过剪接，）、（mRNA的5末端被加上一个m7pGppp帽子，在mRNA3末端多了一个多聚腺苷酸(polyA)尾巴）。9蛋白质多亚基形式的优点是（亚基对DNA的利用来说是一种经济的方法）、（可以减少蛋白质合成过程中随机的错误对蛋白质活性的影响）、（活性能够非常有效和迅速地被打开和被关闭）。10蛋白质折叠机制首先成核理论的主要内容包括（成核）、（结构充实）、（最后重排）。11半乳糖对细菌有双重作用；一方面（可以作为碳源供细胞生长）；另一方面（它又是细胞壁的成分）。所以需要一个不依赖于cAMPCRP的启动子S2进行本底水平的永久型合成；同时需要一个依赖于cAMPCRP的启动子S1对高水平合成进行调节。有G时转录从（S2）开始，无G时转录从（S1）开始。12DNA重组技术也称为（基因克隆）或（分子克隆）。最终目的是（把一个生物体中的遗传信息DNA转入另一个生物体）。典型的DNA重组实验通常包含以下几个步骤：提取供体生物的目的基因（或称外源基因），酶接连接到另一DNA分子上（克隆载体），形成一个新的重组DNA分子。将这个重组DNA分子转入受体细胞并在受体细胞中复制保存，这个过程称为转化。对那些吸收了重组DNA的受体细胞进行筛选和鉴定。对含有重组DNA的细胞进行大量培养，检测外援基因是否表达。13、质粒的复制类型有两种：受到宿主细胞蛋白质合成的严格控制的称为（严紧型质粒），不受宿主细胞蛋白质合成的严格控制称为（松弛型质粒）。14PCR的反应体系要具有以下条件：a、被分离的目的基因两条链各一端序列相互补的DNA引物（约20个碱基左右）。b、具有热稳定性的酶如：TagDNA聚合酶。c、dNTPd、作为模板的目的DNA序列15PCR的基本反应过程包括：（变性）、（退火）、（延伸）三个阶段。16、转基因动物的基本过程通常包括：将克隆的外源基因导入到一个受精卵或胚胎干细胞的细胞核中；接种后的受精卵或胚胎干细胞移植到雌性的子宫；完成胚胎发育，生长为后代并带有外源基因；利用这些能产生外源蛋白的动物作为种畜，培育新的纯合系。17杂交瘤细胞系的产生是由（脾B）细胞与（骨髓瘤）细胞杂交产生的，由于（脾细胞）可以利用次黄嘌呤，（骨细胞）提供细胞分裂功能，所以能在HAT培养基中生长。18随着研究的深入第一代抗体称为（多克隆抗体）、第二代（单克隆抗体）、第三代（基因工程抗体）。19目前对昆虫病毒的基因工程改造主要集中于杆状病毒，表现在引入（外源毒蛋白基因 ）；（扰乱昆虫正常生活周期的基因）；（ 对病毒基因进行修饰）。20哺乳类RNA聚合酶启动子中常见的元件TATA、GC、CAAT所对应的反式作用蛋白因子分别是（TFIID）、（SP-1）和（CTF/NF1）。21RNA聚合酶的基本转录因子有、TF-A、TF-B、TFII-D、TF-E他们的结合顺序是：  （D、A、B、E）。其中TFII-D的功能是（与TATA盒结合）。22与DNA结合的转录因子大多以二聚体形式起作用，转录因子与DNA结合的功能域常见有以下几种（ 螺旋-转角-螺旋）、（锌指模体）、（碱性-亮氨酸拉链模体）。23限制性内切酶的切割方式有三种类型分别是（在对称轴5'侧切割产生5'粘端）、（在对称轴3'侧切割产生3'粘端（在对称轴处切割产生平段）。24质粒DNA具有三种不同的构型分别是：（ SC构型）、（ oc构型）、（L构型 ）。在电泳中最前面的是（SC构型）。25外源基因表达系统，主要有（大肠杆菌）、（酵母）、（昆虫）和（哺乳类细胞表）。26转基因动物常用的方法有：（逆转录病毒感染法）、（DNA显微注射法）、（胚胎干细胞法）。三、简 答1  分别说出5种以上RNA的功能？转运RNA  tRNA       转运氨基酸        核蛋白体RNA rRNA       核蛋白体组成成       信使RNA  mRNA       蛋白质合成模板       不均一核RNA hnRNA      成熟mRNA的前体       小核RNA  snRNA      参与hnRNA的剪接小胞浆RNA  scRNA/7SL-RNA 蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组成成分反义RNA anRNA/micRNA    对基因的表达起调节作用核酶   RibozymeRNA    有酶活性的RNA2原核生物与真核生物启动子的主要差别？原核生物TTGACA-TATAAT-起始位点     -35  -10真核生物增强子-GC-CAAT-TATAA5mGpp起始位点        -110 -70 -253对天然质粒的人工构建主要表现在哪些方面？天然质粒往往存在着缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，必须对之进行改造构建：a、加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择,通常是抗生素基因。b、增加或减少合适的酶切位点，便于重组。              c、缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量。d、改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝。e、根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件            4举例说明差示筛选组织特异cDNA的方法？制备两种细胞群体，目的基因在其中一种细胞中表达或高表达，在另一种细胞中不表达或低表达，然后通过杂交对比找到目的基因。                  例如：在肿瘤发生和发展过程中，肿瘤细胞会呈现与正常细胞表达水平不同的mRNA，因此，可以通过差示杂交筛选出与肿瘤相关的基因。也可利用诱导的方法，筛选出诱导表达的基因。 5杂交瘤细胞系的产生与筛选？脾B细胞+骨髓瘤细胞，加聚乙二醇（PEG）促进细胞融合，HAT培养基中培养（内含次黄嘌呤、氨基蝶呤、T）生长出来的脾B-骨髓瘤融合细胞继续扩大培养。          细胞融合物中包含：脾-脾融合细胞：不能生长，脾细胞不能体外培养。骨-骨融合细胞：不能利用次黄嘌呤，但可通过第二途径利用叶酸还原酶合成嘌呤。氨基蝶呤对叶酸还原酶有抑制作用，因此不能生长。骨-脾融合细胞：在HAT中能生长，脾细胞可以利用次黄嘌呤，骨细胞提供细胞分裂功能。 6、利用双脱氧末端终止法（Sanger法）测定DNA一级结构的原理与方法？原理是采用核苷酸链终止剂2，3，-双脱氧核苷酸终止DNA的延长。由于它缺少形成3/5/磷酸二脂键所需要的3-OH，一旦参入到DNA链中，此DNA链就不能进一步延长。根据碱基配对原则，每当DNA聚合酶需要dNMP参入到正常延长的DNA链中时，就有两种可能性，一是参入ddNTP,结果导致脱氧核苷酸链延长的终止；二是参入dNTP,使DNA链仍可继续延长，直至参入下一个ddNTP。根据这一方法，就可得到一组以ddNTP结尾的长短不一的DNA片段。        方法是分成四组分别为ddAMP、ddGMP、ddCMP、ddTMP反应后，聚丙烯酰胺凝胶电泳按泳带可读出DNA序列。                       7、激活蛋白（CAP）对转录的正调控作用？环腺苷酸（cAMP）受体蛋白CRP（cAMPreceptorprotein），cAMP与CRP结合后所形成的复合物称激活蛋白CAP（cAMPactivatedprotein）。当大肠杆菌生长在缺乏葡萄糖的培养基中时，CAP合成量增加，CAP具有激活乳糖（Lac）等启动子的功能。一些依赖于CRP的启动子缺乏一般启动子所具有的典型的-35区序列特征（TTGACA）。因此RNA聚合酶难以与其结合。       CAP的存在（功能）：能显著提高酶与启动子结合常数。主要表现以下二方面：CAP通过改变启动子的构象以及与酶的相互作用帮助酶分子正确定向,以便与-10区结合，起到取代-35区功能的作用。CAP还能抑制RNA聚合酶与DNA中其它位点的结合，从而提高与其特定启动子结合的概率。8、典型的DNA重组实验通常包括哪些步骤？a、提取供体生物的目的基因（或称外源基因），酶接连接到另一DNA分子上（克隆载体），形成一个新的重组DNA分子。                     b、将这个重组DNA分子转入受体细胞并在受体细胞中复制保存，这个过程称为转化。  c、对那些吸收了重组DNA的受体细胞进行筛选和鉴定。          d、对含有重组DNA的细胞进行大量培养，检测外援基因是否表达。       9、基因文库的构建对重组子的筛选举出3种方法并简述过程。抗生素抗性筛选、抗性的插入失活、兰-白斑筛选或PCR筛选、差式筛选、DNA探针  多数克隆载体均带有抗生素抗性基因（抗氨苄青霉素、四环素）。当质粒转入大肠杆菌中后，该菌便获得抗性，没有转入的不具有抗性。但不能区分是否已重组。  在含有两个抗性基因的载体中，如果外源DNA片段插入其中一个基因并导致该基因失活，就可用两个分别含不同药物的平板对照筛选阳性重组子。如pUC质粒含LacZ基因（编码半乳糖苷酶）该酶能分解生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入后，LacZ基因不能表达，菌株呈白色，以此来筛选重组细菌。                        10、说明通过胚胎干细胞获得转基因动物的基本过程？胚胎干细胞（embryonicstemcell,ES）：是胚胎发育期的胚细胞，可以人工培养增殖并具有分化成其它类型细胞的功能。ES细胞的培养：分离胚泡的内层细胞团进行培养。ES在无饲养层中培养时会分化为肌细胞、N细胞等多种功能细胞，在含有成纤维细胞中培养时ES将保持分化功能。             可以对ES进行基因操作，不影响它的分化功能可以定点整合，解决了随机整合的问题。向胚胎干细胞导入外源基因，然后植入到待孕雌鼠子宫，发育成幼鼠，杂交获得纯合鼠。第五讲分子生物学研究法一、重组DNA技术发展史上的重大事件1.40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；2.50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；3.50年代末至60年代，相继提出了"中心法则"和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。年份事件1869FMiescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。1944O.T.Avery证实DNA是遗传物质。1952A.D.Hershey和M.Chase再次证实和噬菌体的遗传物质是DNA。1953J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分