分子生物学技术在医学检验中的应用进展讲课稿.doc

Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。分子生物学技术在医学检验中的应用进展-分子生物学技术在医学检验中的应用进展摘要 分子生物学技术是医学检验的重要诊疗手段。本文概述医学检验中常用的分子生物学技术，列举其在临床病原微生物检验、肿瘤诊断及评估、遗传病诊断、免疫系统疾病诊断中的具体应用，分析分子生物学技术应用中应注意的问题，并对发展趋势进行预测。关键词 分子生物学技术；医学检验；应用；进展分子生物学是以核酸、蛋白质等生物大分子为研究对象的学科，分子生物学技术即建立在核酸生化基础上的一类研究手段，现已广泛应用于医学检验中。研究内容也从DNA鉴定、扩展到核酸及表达产物分析，技术不断进步为原微生物检验、肿瘤诊断及评估、遗传病诊断、免疫系统疾病诊断提供重要依据和创新思路。现就分子生物学技术在医学检验中的应用进展进行综述，试分析应注意的问题及预测发展趋势。1 医学检验中常用的分子生物学技术概述分子生物学技术的核心是聚合酶链反应(PCR)，能在最短的时间内扩增。由此衍生出新PCR技术，如原位PCR技术、实时定量PCR、链置换扩增技术、LCR、NASBA、TAS等。此外，生物芯片技术、核酸探针技术、生物传感器、SELEX技术、循环核酸分析技术都极大的完善了检验技术，直接解释生命规律，在临床诊断和治疗中意义重大。2 分子生物学技术在临床中的具体应用2.1 病原微生物检验 PCR和生物芯片技术用于病原微生物检验术与传统的培养鉴定、免疫测定相比，其具有高的敏感性，较短的耗时和更广的适用范围1。PCR通过向反应管中加入特异性引物可同时鉴定出单种或多种病原体，即便存在大量死菌也能得到准确结果，不受混合标本和微生物生长时间的限制。生物芯片技术则以其更高的灵敏性和高效率，同时检测出上百种病原微生物，可用于快速查找样本的耐药基因指导临床用药。2.2 肿瘤及遗传病诊断 研究证实肿瘤及遗传病几乎都存在着一定的基因缺陷，只要找到人体中与基因相互作用的结合点，从基因水平诊断就能准确诊断。通过基因芯片判定靶基因P53抑癌基因的突变，通过分子蛋白质组学、生物传感器和流式细胞术诊断肿瘤特异性标志物。在遗传病中，分子生物技术能识别患病家族基因存在的特定多态性，常用技术有DNA限制性片段长度多态性分析，单链构象多态性分析，荧光原位杂交染色体分析，酶基因调控和微阵列技术。2.3 免疫系统疾病诊断 免疫系统疾病诊断关键是确定基因水平上的调控表达。如在人类免疫缺陷病毒的研究中，分子生物纳米技术即以抗体为基础，用免疫分析和磁性修饰的方法来检测免疫物质，通过酶、荧光剂、同位素把特异的抗体抗原与纳米磁性微球固定，既能自动检测人免疫缺陷病毒1型和2型抗体，为人类防治病毒性疾病提供了有力的武器。3 分子生物学技术在检验应用的新进展现阶段分子生物学新技术的发展方兴未艾，给人们提供了探索人类生命科学的工具，推动了检验学发展。分子生物技术最显著的医学成就是对遗产病中的致病基因的准确定位及克隆，早在1998年就完成了遗传性耳聋的基因克隆；2003年SARS肆虐时，科学家就研制出专门诊断该病的基因芯片；2004年后实现了用多重PCR技术对我国新生儿多发的地中海贫血、苯丙酮尿症、G6DP缺乏症的产前和病例诊断；近年来，遗传标记技术的进步，结合现有分子学研究技术，加速了遗传基因图谱的制作和相关疾病的基因检测和鉴定，从而为医学检验的加速发展提供了有效的载体。4 存在问题及发展趋势现阶段面临的问题主要是技术相对复杂和仪器要求太高、药品和反应盒昂贵等2，限制了临床推广。首先，合理选用检验项目的问题，分子生物学方法具有高特异性和高灵敏性，但临床中仍要根据实际需要选用经济合理的检验项目，如结核菌培养和涂片镜检就能达到目的，不必舍廉选贵，增加患者负担。其次，疾病诊断过度依赖检验结果问题，应将临床资料综合考虑，不能仅靠分子生物学技术检验结果就妄下诊断，忽略标本取样和检验过程中的操作不当及病程发展规律造成的假阳性或是假阴性，贻误病情。再者，上级部门管理不足问题，国家相关部门要担任监管的职责，参考国际惯例，制定符合我国医学检验现状的实验操作管理规章制度，严格培训检验人员，规范试剂的准入和仪器的管理，最大程度保证检验结果的可信度。虽然分子生物技术在临床推广应用中存在着许多尚待解决的问题，但是它仍然显现出了快速发展的趋势。未来其发展会倾向于：现有、仅停留在实验室的分子生物学技术逐步向临床实用型改进，降低实验投入、简化操作步骤，推进实验过程全自动化的实施降低人为因素对结果的影响，根据临床实际修正技术，提高检验的特异性和敏感性。积极推进实验室建设，加大仪器和检验人员的培训投入，为分子生物学的临床应用提供必要的基础保障，以先进的、可持续性的实验检验手段为临床提供可靠的依据。参考文献1 YuregirOO,SahinFI,YilmazZ,etal.Fluorescentinsituhybrid-izationstudiesinmultiplemyelomaJ.Hematology,2009,14(2):90-94.2 李鹏.现代分子生物学技术在医学检验中的应用J.临床和实验医学杂志,2007,3(6):161.PCR在现代医学检验中的应用关键词：医学检验应用PCR现代医学检验王耿新刘德亮王志群陈献业山东省青岛市肿瘤医院青岛266042聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction,PCR）又称体外基因扩增技术或DNA扩增技术。自1985年美国PE-Cetus公司的K.BMullis等人首创了PCR技术之后，它以相当惊人的速度被广泛地应用于医学及分子生物学等各个领域。现今，PCR技术已成为一种对标本中特定的DNA片段进行分析研究和检测鉴定的重要方法。近20年来PCR技术在生物医学等各个研究领域和临床应用中发挥了重大的作用，在病原体鉴定、遗传病诊断、免疫学研究、癌基因探索及治疗等方面都作出了相应的贡献。1.PCR技术的基本原理与特点1-2PCR技术的基本原理是模仿DNA体内复制的机制，在体外进行扩增特异的DNA片段。它主要是由三个基本步骤组成的循环反应。首先是变性，用加热的方法使双链DNA解链成两股单链；其次是复性，用降温的办法使这两股单链按碱基互补的原则分别与加入的两条人工合成的寡聚核苷酸链（引物）结合成双链；最后是延伸，在合适的缓冲液、镁离子及脱氧核苷酸存在的条件下，用DNA聚合酶进行催化，按碱基配对的原则合成互补链。引物从3'端进行延伸，合成的方向为5'端（一条人工合成的引物）至3'端，从而合成与模板DNA结构相同的片段。重复上述三步骤，变性复性引物延伸的过程，经过约30个周期的循环（每三个步骤为一周期，约需2-3分钟），1-2小时就能将所需基因扩增几百万倍，使极微量的所需DNA达到极易检测的水平。其扩增效率公式为：Y=（1+X）n，式中Y为扩增数目，X为放大效率，n为循环次数。PCR技术具有敏感性高、特异性强、操作简便、快速省时等特点。其灵敏度可达到Pg级，甚至达到fg级3水平，而被扩增的基因片段能与原基因片段保持不变。PCR技术操作简便、快速而易掌握，并且对标本要求不高。用过去的方法完成一项试验少则几周，多则几个月。应用全自动DNA扩增仪，整个PCR过程均由电脑控制，只需数小时即可完成整个试验过程，用极微量的粗制标本就可获取目的产物。2.常用的几种PCR及主要用途4-52.1定量PCR：用于mRNA定量及转录水平的研究。2.2抗原捕获PCR（AC-PCR）：用于病毒感染的检测。2.3不对称PCR（AsymmetricPCR）：用于制备探针或测序。2.4彩色PCR（CCA-PCR）“用于检测某些多型别病毒的混合感染。2.5原位逆转录PCR（InSituRT-PCR）：定位检测细胞中RNA病毒感染。2.6逆转录PCR（RT-PCR）：用于克隆cDNA、检测RNA病毒、cDNA探针。2.7反向PCR（invertedPCR）：用于扩增已知基因片段两侧的未知序列。2.8膜PCR（membrane-boundPCR）：可去除污染的杂质或PCR产物残留，检测低丰度靶DNA。2.9间接原位PCR（IndirectInSituPCR）：定位检测细胞中DNA病毒感染，是目前应用较广泛的一种原位PCR技术，其特异性比直接PCR强。3.PCR技术在医学检验中的地位现代医学研究证明，人类疾病多数是直接或间接与基因有关6，如肿瘤、糖尿病和心血管疾病等。在医学实验诊断中我们经历了生化和免疫诊断的发展过程，由于各类扩增技术的出现使我们进入了基因诊断的新时代并成就了现代意义基因诊断的崛起。这将改变以往对疾病的表型认识和表型诊断，从本质上认识疾病和诊断疾病。在各类扩增技术中，PCR的地位尤为突出。目前，全世界利用PCR技术诊断感染性疾病每年达几千万人次，其费用早已大幅下降，说明PCR有着巨大的潜在市场。美国临床检验标准化委员会于1995年颁布了关于感染性疾病分子诊断应用范围、条件和质量控制细则等准则文件7。而国际临床化学学会于1998年又发布了关于分子扩增在临床诊断中应用的质量评估基础的文件并对PCR操作的各个环节进行了详细论述8。由此可见，两个权威性文件也都肯定了PCR技术在医学检验方面的重要性。基因诊断可能将是以后的发展方向并作为疾病的常规诊断技术。4.PCR技术在医学检验中的应用4.1PCR技术在肿瘤方面的应用目前，肿瘤发病的分子机制尚不完全清楚。研究表明，人类许多常见的肿瘤疾病与某些病毒病因及肿瘤相关基因的遗传学改变有着密切的关系。PCR技术的肿瘤病毒病因、肿瘤相关基因、肿瘤相关抑癌基因等研究方面已取得可喜成果。据有关资料表明1，4前列腺癌、结肠癌和Kaposi肉瘤等与人巨细胞病毒（CMV）有关；鼻咽癌和Burkitt淋巴瘤与EB病毒有关；原发性肝癌与乙型肝炎病毒（HBV）有关；泌尿道肿瘤和食道肿瘤等与人乳头瘤病毒（HPV）有关。人类肿瘤病毒病因中较为重要的一类病毒是HPV，其中大部分只与良性增生有关，只有16、18、31、35、39等十余型与恶性肿瘤关系密切。PCR在检测HPV，尤其是第16、18型有无感染，对子宫颈癌的早期诊断及预防有着显著的意义。目前，已知肿瘤相关基因有上百多种，但较常见的是ras家族的H-ras、K-ras和N-ras三种癌基因。它们的结构相似，其表达产物是P21蛋白。在不同肿瘤中ras家族癌基因的H-ras、K-ras点突变多集中在第12和61号密码子上，而N-ras在第13号密码子上多发生突变。PCR在癌基因的研究方面主要是ras基因与肿瘤的关系。现已查明与ras基因突变有关1，2，4，9，10的肿瘤有几十种。如：各种急性慢性白血病、精原细胞癌、恶性黑色素瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、胰腺病、肺癌、膀胱癌、结肠癌、子宫瘤等。Rb基因11是人类最早（1986年）发现的抑癌基因，其后又相继发现了P53、WT1、NF1、DCC、MCC、APC、P16和P21等抑癌基因。在遗传性视网膜母细胞瘤研究中发现位于13号染色体上Rb基因的缺失与癌变有关。在许多常见肿瘤，如骨肉瘤、肺癌、膀胱癌、乳腺癌等恶性肿瘤中，常发现该基因失活11。在对P53基因的研究中12-14发现该基因的突变和缺失是许多肿瘤发生的原因，这些肿瘤主要有子宫颈癌、肝癌、成骨肉瘤等。遗传学改变主要是引起癌基因激活和抑癌基因的失活，使基因发生突变、缺失、增加和易位等而导致了细胞癌变。PCR不但能有效地检测基因的突变、重排、易位等，而且能准确检测癌基因表达量，可据此进行肿瘤早期诊断、鉴别、分型、分期、治疗及预后评估等。近年，刚兴起的荧光定量逆转录（RT）-PCR10在肿瘤诊断、治疗和微转移以及微小残留病灶检测等方面具有广泛的应用价值。研究表明，癌细胞或癌前期细胞在进入血液循环以后，通过定量RT-PCR检测外周血肿瘤特异性标志物mRNA，可进行实体肿瘤的筛查，检测肿瘤术后及淋巴转移阴性的病人外周血肿瘤细胞的数量，以便估计肿瘤的复发和转移，制订合理的治疗方案。另外，定量RT-PCR还可用于肿瘤耐药基因（MDR1）10表达水平检测，为临床筛选化疗药物及治疗方法提供依据。4.2PCR技术在遗传病方面的应用PCR技术首次临床应用10就是从检测镰状细胞和-地中海贫血的基因突变开始的。十几年来，该技术在遗传病诊断的临床应用方面获得了极大的成功。它能用于检测已知基因序列的任何遗传病基因的突变，如倒位、缺失/插入、动态突变、部分高发的点突变及表达量的异常等都可通过基因分析直接检测用于临床进行诊断，像地中海贫血、血友病、杜氏肌营养不良症、脆X综合征、苯丙酮尿症等这些遗传性疾病。PCR在遗传病诊断及遗传病预防与产前基因诊断方面具有明显的应用价值，PCR产物直接测序已成为检测遗传病基因突变的常用方法。另外，PCR在鉴定编码抗生素耐药性基因10，尤其是在细菌不携带同源性序列且取单个菌落进行PCR扩增时，具有较高的特异性和敏感性。4.3PCR技术在感染性疾病方面的应用目前PCR在医学检验中对感染性疾病的诊断10，15极具突出，只要核酸序列是清楚的，就可以检测到任何有限的病原体。一般实验室可检出10-100个基因拷贝，而目前，病原体抗原检测方法一般需要105107个病原体才能检测到。PCR技术的运用解决了免疫学检测的“窗口期”问题，可判断疾病是否处于隐性或亚临床状态。再者，抗体检测不能判定是现症感染还是既往感染时，也需要用PCR方法来确定。另外，病原体感染后的发病时间和病情轻重均与病原体数量有关。如艾滋病（AIDS）由人免疫缺陷病毒（HIV）感染后，可根据HIV检测的含量预知发病的时间。因为AIDS潜伏期的长短和临床症状的轻重与血液中的病毒量呈显著相关。在其它病毒性疾病中也多半存在类似情况，这均需PCR来定量说明。PCR在HBV定量研究中表明，HBV载量与肝炎的发生、发展、预后以及与药物疗效有关，并证明定量PCR是鉴别HBV感染各期的良好工具。该技术能有效地确定血清HBeAg转阴和非活动性携带者病人的HBVDNA水平，而常规杂交法则对这些低病毒血症的HBVDNA探测不到。在抗病毒治疗中，通过定量PCR检测HBV的载量，来观察拉咪呋啶及多种联合用药治疗慢性乙型肝炎的疗效具有指导意义。PCR对某些传染性疾病疫苗接种后感染的鉴别也是极为重要的。例如：腮腺炎病毒疫苗接种后感染的病例时有发生，是疫苗引起的还是野生型腮腺炎病毒引起的，这就需要一种行之有效的方法来进行鉴别，以往的血清学、病毒培养及探针杂交等方法都很难做到。过去，对结核病等其他分支杆菌病的诊断方法虽然很多，但均不够理想。简便易行的方法经常查不到抗酸杆菌，也无法鉴别结核杆菌与其他分支杆菌。用分支杆菌培养的方法且阳性率较低又耗时，而麻风杆菌在体外又不能培养，主要靠感染组织的涂片或切片镜检。其他方法，如血清学、气相色谱等方法的敏感性及特异性都不够理想，PCR技术的运用使上述问题得到了解决。还有PCR技术在技术性病监控和性病病原体的检测方面也正在扩大，并列为监控手段和作为检测的金标准。5.PCR技术在医学检验应用中的问题5.1假阳性通常PCR在医学检验应用中所面临的问题之一是扩增产物污染带来的假阳性，而实验室污染又是假阳性的主要因素。只要实验室被扩增产物污染，扩增片段随时都可能污染新的样本并又被同一PCR反应体系扩增出来而产生假阳性。解决的根本措施就是在封闭状态下进行扩增和产物分析。近年发展了一种荧光定量PCR技术，从根本上解决了PCR扩增产物污染和不能定量的问题。该技术把基因扩增PCR、分子杂交和光化学融为一体，实现了对PCR扩增产物进行全过程的封闭，并进行实时动态检测和自动分析结果，进一步提高了其特异性。由于造成假阳性的因素相对单一，因此假阳性并不是困惑检验工作的主要原因。5.2假阴性PCR假阴性的原因相对较为复杂，主要包括有仪器设备的质量、试剂开壳剂和操作问题、PCR产物的电泳检测时间及有关PCR反应的关键环节等。PCR仪本身的质量问题能使扩增效率下降或造成非特异性扩增而出现假阴性或假阳性。离心机的质量问题或使用不正确，可造成离心标本模板不能分离而产生假阴性。试剂开壳剂和操作问题造成标本DNA没有暴露出来，致使扩增无法进行而导致假阴性。PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，大于48h后带型不规则甚致消失不出现扩增条带而程现假阴性。PCR反应的关键环节有模板核酸的制备、引物的质量与特异性、酶的质量及PCR循环条件等，在这些环节中操作不当都可引起假阴性。另外，Mg2+浓度和物理因素变性等对PCR扩增效率影响也很大。Mg2+浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量。而变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性；退火温度过低，可致非特异性扩增而降低异性扩增效率；退火温度过高，影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率，最终都可导致PCR扩增失败。还有靶序列变异使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增也不会成功。6.PCR技术的应用前景自从PCR技术诞生以来，随着其深入不断的发展与完善，许多与其相关的新类型及改良的新方法在不断的涌现，这些派生出的新类型和新方法解决了以往传统PCR的瓶颈问题。虽然，PCR可对基因分析直接检测用于临床进行诊断，但大部分基因突变还是难以直接检测。近年来，分子诊断技术最大突破就是集扩增、检测和靶定量于一体的实时荧光PCR技术的问世。该技术的出现，对基因检测和基因分型的应用范围将进一步扩大，为PCR的临床应用带来曙光。因此，PCR技术将有极大的发展空间和广泛的应用前景，它将对肿瘤学、遗传学、免疫学、微生物学、寄生虫学和基因治疗等进一步研究及临床应用起着积极重要的作用。在现代医学检验中，PCR的应用将更加广泛和深入。相信在不久的将来，随着PCR技术的更进一步完善，它将作为常规检验方法进行全面普及，发挥更大的作用，为全人类健康做出更大的贡献。参考文献1.杨道理,王宝成主编.DNA扩增技术与医学应用.济南：山东科学技术出版社.1992,51-54,283,396.2.郭永军.聚合酶链式反应在肿瘤研究中的应用.国外医学肿瘤分册.1991,18(1):1-3.3.陈志杰主编.医学检验新技术.济南:山东科学技术出版社.1993：544.4.陈意生,史景泉主编.肿瘤分子细胞生物学.北京：人民军医出版社.2002：190-192,270,287-288.5.杨占秋,刘建军,肖红,等主编.诊断与实验病毒学.郑州:郑州大学出版社.2002:167-169.6.T.D.盖莱哈特,F.S.柯林斯,D.金斯伯格主编.孙开来主译.医学遗传学原理.北京:科学出版社.2001:92-116.7.EnnsRK,BromleySE,DaySP,etal.Moleculardiagnosticmethodsforinfectiousdiseases;approvedguideline.NatlCommitClinLabStand,1995:1-10.8.NeumaierM,BraunA,WagenerC.Fundamentalsofquialityassessmentofmolecularamplificationmethodsinclinicaldiagnostics(IFCCdocument).ClinChem,1998,44:12-26.9.王俊茹,邓国仁,刘为俊.ras基因突变与人类肿瘤.癌症.1993,12(1):82-83.10.卢圣栋主编.生物技术与疾病诊断兼论人类基因治疗.北京：化学工业出版社.2002：83-98,117,142.11.顾健人,曹雪涛,主编.基因治疗.北京：科学出版社.2001:120-121.12.MayWong,JackGruber.ViralInteractionswiththeP53GeneinHumanCancer.JournaloftheNationalCancerInstitute,1994,86(3):177.13.李贷宗,曹宇清,何丽萍,等.人原发性肝癌P53基因缺失和突变.肿瘤.1991,11(5):195.14.陈竺,强伯勤,方福德主编.基因组科学与人类疾病.北京：科学出版社.2001：176.15.TangYW,ProcopGW.PersingDH.Moleculardiagnosticsofinfectiousdiseases.ClinChem.1997,43:2021-2038.-