农药生物活性测定实验指导说课讲解.doc

Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。农药生物活性测定实验指导-农药生物活性测定实验指导游红编实验一供试目标昆虫的饲养一、 棉铃虫的饲养实验目的：1、 明确标准目标昆虫饲养在生物测定中的意义；2、 了解常见目标昆虫的饲养条件及方法；二、 学习棉铃虫的饲养方法。实验原理：杀虫剂生物测定必须使用大量、群体整齐、健康程度一致，龄期一致的标准目标昆虫，才能保证对杀虫剂毒力的反应准确。因此，进行杀虫剂生物测定必须采用人工饲养标准目标昆虫，以保证供试昆虫的充分供应，这是农药毒力试验工作中的最基本的组成部分。饲养目标昆虫的种类，除采用农作物害虫外，仓库害虫、卫生害虫及其他繁殖力强，便于饲养的昆虫也可采用，通过饲养条件的控制，促使供试目标昆虫尽量达到生理状况一致，以减少试验中的误差。三、 棉铃虫（HelicoverpaarmigeraH.）属鳞翅目夜蛾科。食性杂，可长年饲养。但因幼虫在三龄期以后有相互残杀习性，故必须单头饲养。对该虫可采用天然植物饲料，如棉蕾铃、青豌豆、新鲜玉米和辣椒等。若连续大量饲养，须用人工饲养。主要仪器及试材：1、 试虫：棉铃虫；2、 饲养用具：养虫室，培养皿（15cm），培养皿（5cm）,养虫缸，纱布等。3、 饲料：（1）、饲料组成：熟大豆粉（g）20.0玉米粉（g）30.0大麦粉（g）30.0抗坏血酸（g）1.0干酵母（g）8.0琼脂（g）3.5苯甲酸钠（g）0.8棉油(ml)0.536醋酸(ml)6.010甲醛(ml)1.0水(ml)200(2)、配制方法：四、 取总水量30的水，加入玉米粉等成分搅拌；另取70的水，以溶解琼脂，冷却至70时与上述成分混合搅拌；饲料均匀倒入培养皿（15cm）内，厚度1.01.5cm，冷却后备用。实验方法与步骤：1、 饲养条件：养虫室温度保持2628，相对湿度60%70%，12小时光照。2、 饲养方法：（1）、在培养皿（16cm）放入约0.30.5mm厚的饲料若干块，将附有卵块的纱布放入皿内，用黑布将皿口封住，布上压玻璃板，缸下部对着光源，孵化的幼虫可很快到饲料上取食。（2）、待幼虫长到2龄后，移入装有人工饲料的培养皿（5cm）内，每皿一头，幼虫在内取食，直至老熟。（3）、幼虫进入预蛹期，即转移到装有无菌细土的养虫缸内，必须保持湿润，以利入土化蛹和蛹的存活。五、 （4）、成虫羽化后，雌雄配对，放入养虫缸内，缸内放一个内有10%蜂蜜液的培养皿，皿内放脱脂棉，以便蛾子从润湿的棉上吸取蜂蜜。养虫缸上蒙上纱布，并用橡皮筋扎好。蛾子在缸内交尾产卵，每日将产于纱布上的卵连同纱布取下，并换新纱布和蜂蜜。实验注意事项：1、 注意饲养室及饲养用具的清洁、消毒。2、 注意饲养环境的控制，棉铃虫的幼虫在3龄后具有自相残杀习性，应单独饲养。六、 在棉铃虫饲养过程中，应注意及时更换新鲜的饲料，以防饲料变干。配制好的饲料必须在低温下储存。实验结果处理：1、 每日观察记录棉铃虫的取食、生长情况，并认真填写观察记录。七、 观察棉铃虫的蜕皮生长情况，记录各龄期的生长时间长短及试虫的平均体重。思考题：1、 标准目标昆虫的饲养在生物测定工作中有何意义？在棉铃虫的饲养过程中应该注意那些问题？并对其饲养条件和方法提出改进意见。一、 实验二杀虫剂初步毒力测定实验目的：1、 通过本试验学习掌握杀虫剂室内毒力初筛试验的操作技术。2、 观察昆虫中毒征象特征兴奋、击倒、抽搐、麻痹、昏迷、死亡等。二、 明确标准目标昆虫代表性的实用意义。实验原理：为了初步确定某些化学物质是否对某些害虫具有毒杀能力，应首先进行一次淘汰试验，或叫初筛试验，又称初步综合杀虫毒力试验。这种试验不涉及毒杀方式和毒杀能力的大小，因此，不严格限制用药量和均匀度，一般采用较高的浓度，尽量发挥综合毒效（包括胃毒、触杀、薰蒸等作用）。三、 一般农药初筛毒力测定方法，根据试虫对象不同，多采用浸渍法、喷雾法、喷粉法、饲料混药法等。每处理需试虫15-30头，可以不设重复，每次试验均要设空白对照，施药时要注意各处理用药等量均匀一致，设置温度一般在20-28，相对湿度60-80%，通气良好。一般液剂在0.1-1%，粉剂1-10%。主要仪器及试材：1、 试虫：小菜蛾（3龄）。2、 供试药剂：药剂A、药剂B。四、 试验器材：养虫室、potter喷雾塔、量筒、镊子、吸管、烧杯、培养皿、毛笔等。实验方法与步骤1、 药剂配制：将A、B药剂配成0.1%的溶液备用。2、 试虫移取：取小菜蛾3龄幼虫集中混匀后，用毛笔刷入培养皿，每处理10头，重复一次。3、 喷布质量检定用9cm的白色园纸片来检查喷雾雾滴的大小和喷布是否均匀一致，如不符合要求，可调节喷头及位置，使喷布质量达到基本要求。4、 处理方法：采用喷雾法，选用potter喷雾塔，喷布药液前，用清水及欲喷洒的药液大量喷布。换药前需将受药盘及雾化室底部用布充分擦净，然后大量喷布试验的药液。五、 在接有小菜蛾的培养皿中加入一定新鲜菜叶后，用移液管吸取3ml药液进行喷布，约10秒后，待药液全部沉降，取出培养皿，做好标记，空白对照只喷洒清水。待药剂干后，将试虫连同饲料置于恢复室内培养24小时后检查结果。实验注意事项：1、 目标试虫的选择：应选用具有一定的代表性及经济价值，耐药性较强、生长健壮、自然死亡率底，虫龄虫体大小一致，最好采用人工饲养的试虫。2、 环境条件的选择：温度在20-28，相对湿度在60%-80%，通气良好。六、 处理设计：每处理需试虫15-30头，可以不设重复，每次试验均要设空白对照，施药时要注意各处理用药等量均匀一致。实验结果处理：处理24小时，48小时后，检查死活虫数，计算死亡率及校正死亡率，并比较不同药剂的毒力大小。试虫死活标准，一般以能正常活动或飞翔的或能正常行动的作为活虫，其余中毒的均为死虫。表1杀虫剂初步毒力试验记载表试验药剂浓度(或剂量)处理方法供试昆虫试虫数处理24小时处理48小时死虫数死亡率(%)校正死亡率(%)死虫数死亡率(%)校正死亡率(%)七、 思考题：1、 将筛选药剂的毒力试验结果记入杀虫剂初步毒力试验记载表，并写成报告。一 杀虫剂初步毒力测定在杀虫剂的筛选中有什么重要意义。实验三杀虫剂毒杀作用方式的测定实验目的：二 学习和掌握杀虫剂毒杀作用方式的测定技术。实验原理：三 经初筛试验后选出杀虫毒力高的农药，需进一步测定它的毒杀作用方式触杀、胃毒、薰蒸、内吸、忌避以及毒杀作用强度等，进一步明确不同类型杀虫剂的杀虫特性。主要仪器及试材：1 供试昆虫：小菜蛾（4龄）四 供试药剂：药剂A、药剂B实验方法与步骤：（一） 触杀作用方式的测定：触杀作用方式的测定是用来判断毒剂通过昆虫体壁进入虫体的触杀毒效。常用的方法有浸渍法、药膜法、直接喷撒法、微量点滴法等。本实验采用药膜法来鉴定农药的触杀毒力作用。1 实验仪器及用具：养虫室、滤纸（9cm）、培养皿（9cm）、培养皿（5cm）、具塞小试管等。2 实验方法与步骤：（1） 药剂的配制：使用丙酮，将药剂A和B分别配制成1000g/ml、100g/ml、10g/ml三个浓度，每浓度5ml，装入具塞小试管。（2） 使用药膜法对小菜蛾（4龄）幼虫进行触杀作用毒力测定。（3） 制作滤纸药膜：取一张直径为9cm的滤纸，放插在报纸上的三支大头针上，不使其接触物体表面，吸取0.5ml丙酮药液，围绕滤纸外缘逐渐向内滴加，使丙酮药液均匀分布在滤纸上，同法每药剂浓度及丙酮对照各制备3张滤纸药膜。（4） 将凉干后的滤纸药膜放在培养皿底，每浓度重复三次，操作时避免手摸，随即每张药膜放入试虫20头，任其爬行15-30min。（5） 处理完毕后，将处理过的试虫置于27，干净的环境中，并饲喂新鲜的饲料，24小时后检查死虫数，以物触其虫体无任何反应者为死亡。（二） 胃毒作用方式的测定：胃毒作用方式的测定是用来判断毒剂通过昆虫取食进入消化道的毒杀能力，测定方法是把药加入饵料中饲喂昆虫，或将药液注入昆虫的口腔内，迫使全部吞食，较理想的方法是夹毒叶片法。其基本原理是在两片叶中夹入均匀分散的药剂，制成夹毒叶片饲喂昆虫，药剂随昆虫取食进入消化道而发生毒杀作用。1 实验仪器及用具：养虫室、微量注射器、培养皿（5cm）、淀粉糊、镊子、剪刀、具塞小试管等。2 实验方法：（1） 药剂的配制：使用丙酮，将药剂A和B分别配制成1000g/ml、100g/ml、10g/ml三个浓度，每浓度5ml，装入具塞小试管。（2） 将菜叶剪成直径2cm的小片若干张，用微量注射器将丙酮药液定量（10ul）点滴在叶片上，待丙酮挥发后，用淀粉糊涂在无药的叶片上，用镊子移于带药的叶片上，将上下两张叶片粘合制成夹毒叶片，饲喂试虫，另喂无毒叶片为对照，每浓度处理试虫20头，重复三次。24小时后观察试虫的死亡情况。（三） 内吸作用方式的测定：内吸作用方式的测定是药剂接触植物的某一部分，如根、茎、叶或种子等，渗入到植物的内部组织，随植物体液传导至全株，在一定的时间内，当昆虫取食带毒的植物或吸取带毒的汁液，而产生致毒反应。本实验采用根部内吸法。1 实验仪器及用具：养虫室、烧杯、吸管、培养皿（5cm）、剪刀、植物苗等。2 实验方法：（1） 药剂的配制：将药剂A和B分别配制成1000g/ml、100g/ml、10g/ml的水溶液各50ml，注入烧杯中。（2） 将植物苗的根部插入药液中，以清水为对照，2小时后，取植物苗的上部未接触药液的叶片饲喂试虫，每浓度处理试虫20头，重复三次，24小时后观察试虫死亡情况。（四） 薰蒸作用方式的测定：薰蒸作用方式的测定是在适当温度下，在固定的空间蒸发成气态，并达到一定的浓度，与试虫接触，在短时间内能杀死试虫。本实验采用培养皿简易薰蒸测定法。1 实验仪器及用具：养虫室、培养皿（9cm）、培养皿（5cm）、吸管、纱布烧杯等。2 实验方法：（1） 药剂的配制：将药剂A和B分别配制成1000g/ml、100g/ml、10g/ml的水溶液各20ml，注入烧杯中。（2） 取直径相同的9cm的磨口培养皿，皿底放10ml的药剂，用双层纱布密盖皿底，其上放试虫20头，每浓度重复三次，以清水为对照。2小时后，将试虫转入培养皿（5cm）中，培养24小时后，观察试虫死亡情况。五实验注意事项：1、目标试虫的选择：应选用具有一定的代表性及经济价值，耐药性较强、生长健壮、自然死亡率底，虫龄虫体大小一致，最好采用人工饲养的试虫。2、环境条件的选择：温度在20-28，相对湿度在60%-80%，通气良好。2、 处理设计：每处理需试虫15-30头，重复三次，每次试验均要设空白对照，施药时要注意各处理用药等量均匀一致。实验方法的选择：根据实验原理选择适宜的实验方法，尽可能避免其他毒杀作用方式的干扰。六实验结果处理：观察死活虫数，计算死亡率及校正死亡率，判断药剂毒作用方式。试虫死活标准，一般以能正常活动或飞翔的或能正常行动的作为活虫，其余中毒的均为死虫。七思考题：1、将筛选药剂的毒力试验结果记入试验记载表，并写成报告。2、根据实验结果判断药剂的毒杀作用方式。2、 农药杀虫作用方式的测定，在生产实践中有何意义。3、 比较触杀作用方式的测定中，常用的浸渍法、药膜法、直接喷撒法、微量点滴法的优缺点。你认为在内吸杀虫作用方式测定中，哪些措施可以排除触杀、薰蒸作用的影响。表2毒杀作用方式实验结果记载表试验药剂浓度(或剂量)实验方法试虫种类重复次数供试虫数处理24小时死虫数死亡率(%)校正死亡率(%)实验四杀虫剂精密毒力测定微量点滴法一实验目的：1、学习和掌握触杀毒力精密测定技术微量点滴法。2、学习农药生物测定数据的处理方法绘图法，最小二乘法和机率值分析法，求出致死中量（LD50）和致死中浓度（LC50）。3、明确杀虫剂杀虫毒力表示方法的意义和应用。二实验原理：在进行农药杀虫作用方式的实验后，了解某些化合物具有触杀作用的基础上，为了明确其触杀强度以及比较几种药剂的触杀毒力大小时，需采用精密触杀毒力测定技术来求出它的致死中量（或致死中浓度）。目前许多有机合成杀虫剂大多数都具有触杀作用，因而触杀毒力测定具有一定的重要性，测定方法虽然很多，但基本上可分为两大类：一是全部施药法：如定量喷粉法、定量喷雾法和用一定浓度药液浸渍法等。其优点是操作方便，比较符合实际施药情况。但药剂容易被试虫吞食产生胃毒作用。二是局部施药法：是目前比较精确的触杀毒力测定方法。一般包括药膜法和微量点滴法。微量点滴法是将一定浓度和容积的药液点滴在试虫体的一定部位，溶剂挥发后，药剂即可自体壁进入体内发挥触杀作用，药剂不致被试虫吞食。本实验采用微量点滴法来测定农药的触杀毒力作用。三主要仪器及试材：1、试虫：棉铃虫（3龄）2、药剂：氯氰菊酯等3、实验仪器及用具：养虫室、毛细管点滴器、分析天平、滤纸、通针、培养皿（5cm）、容量瓶、具塞小试管及试管架、镊子、移液管、丙酮等。四实验方法与步骤：（一）试验前的准备工作1、试虫的移取：选取3龄棉铃虫，大小均匀一致的个体，放在垫有吸水纸的培养皿内，每皿10头，为一个处理。每个处理重复三次，分别在分析天平上称重，求出平均体重，备用。2、称药配药：将试药小心地移入洗净干燥的称量瓶中，在分析天平上准确称取一定量试药，放入小烧杯内，加少量丙酮溶解，再移入容量瓶中，加丙酮定容。摇匀即为母液，备用。3、毛细管点滴器的质量检定：检查毛细管微量点滴器是否通畅，并练习使用。（二）预备试验为了确定合适的施药浓度（或剂量）（要求试虫死亡率分布在20-80%范围内），在正式试验前，必须先用几个浓度或剂量（范围较大）进行试点滴，根据死亡结果，确定最合适的点滴浓度，预备试验所用试虫可以减少一半左右。（三）正式试验步骤1、药液的配制：根据预备试验结果，将容量瓶中的母液按等比级数用丙酮稀释成5个浓度，如1.6、0.8、0.4、0.2、0.1g/l等。每浓度5ml，装入具塞小试管。并以丙酮为对照。2、称重：将选好的试虫，在分析天平上称重，每个浓度为一个处理，每个处理10头试虫，重复三次，将每10头试虫放在垫有吸水纸的干净培养皿内，待处理。3、点滴：使用毛细管点滴器对棉铃虫（3龄）幼虫进行触杀毒力测定。首先进行预备练习，以毛细管点滴器吸丙酮点滴在滤纸上，反复多次，以点滴的大小均匀一致，每次均有为熟练。然后点滴虫体，先对照，再从低浓度到高浓度，每个浓度点滴虫体的中胸背部，每虫一滴，每浓度20头，重复三次。点滴药液量根据试虫大小确定，一般以试虫接受药液不从体壁上流失为宜。棉铃虫3龄幼虫，点滴量为0.3-0.5l，各处理试虫的点药量应一致。4、培养：处理完毕后，将处理过的试虫置于27的环境中，饲喂新鲜饲料，24小时，48小时后检查死虫数，以物触其虫体无任何反应者为死亡。五实验注意事项：1、目标试虫的选择：应选用具有一定的代表性及经济价值，耐药性较强、生长健壮、自然死亡率底，虫龄虫体大小一致，最好采用人工饲养的试虫。2、环境条件的选择：温度在20-28，相对湿度在60%-80%，通气良好。3、处理设计：每处理需试虫15-30头，重复三次，每次试验均要设空白对照，施药时要注意各处理用药等量均匀一致。4、实验中对照（CK）的死亡率最好小于10%，大于20%时实验必须重做。5、药液的配制中，要求不少于5个浓度梯度，各处理的死亡率在20-80%之间为最好。6、点滴操作过程中，点滴力度适宜，应避免力度过大而导致虫体损伤。并随时检查点滴器是否通畅。六实验结果处理：观察死活虫数，计算死亡率及校正死亡率，并将结果记入表中。如自然死亡率超过20%，说明试虫群体生活力差或试验方法有问题，应重做。为了求得供试药剂的致死中量、需要根据用药浓度及体积求出每头试虫的受药量，并换算出单位虫体重的受药量。每头试虫受药量（微克）=每微升药液中含药剂微克数×每头试虫受药微升数根据测定结果，以单位体重受药量（或每头受药量）的对数值为x，校正死亡率换算成机率值为y，求毒力回归方程y=a+bx，并求致死中量（LD50）值，且进行可靠性检验。七思考题：1、求出药量对数死亡率机率值毒力回归方程，求出供试药剂的致死中量。2、为什么要以致死中量或致死中浓度作为比较药剂毒力的标准。3、在实验过程中哪些地方容易出误差，如何克服。表3杀虫剂精密毒力测定原始数据记录表供试药剂浓度(%)每微升药液中含有药剂微克数每头试虫接受药液微升数每头试虫接受药量(微克)试虫平均体重(克)单位虫体重接受药量(微克药量/克虫体重)死亡率（%）校正死亡率（%）对照表4杀虫剂精密毒力测定数据换算表供试药剂单位虫体重接受药量或每头试虫受药量(微克药量/克虫体重)药量对数值校正死亡率（%）死亡率机率值毒力回归方程相关系数LD50实验五杀菌剂最低抑制浓度测定法一实验目的：学习和掌握杀菌剂最低抑制浓度测定法的基本原理和实验方法。二实验原理：杀菌剂最低抑制浓度测定法，即药剂与培养基混合，药剂的浓度逐渐降低，找出抑制病菌生长的最低浓度，比较药剂对供试菌毒力的大小。测定方法包括混合法、划线培养法、载菌培养基移植法。本实验采用载菌培养基移植法，即把药剂混合在培养基中，制成平面，然后把繁殖有供试菌种的载菌培养基小块放置在含药液培养基表面上，如果药剂浓度适当，则载菌培养基小块上的菌落不能扩展到含药液的培养基上。三主要仪器及试材：1、 实验药剂：多菌灵，百菌清等；2、 供试菌种：棉花炭疽病菌等（培养皿菌种）；实验器皿：培养皿、容量瓶、移液管、无菌水、PDA培养基注：以上器皿须经灭菌。超净工作台、灭菌锅、培养箱、打孔器、酒精灯等。四实验方法与步骤：1、 药液的配制：使用无菌水，将多菌灵配制成1000、500、200、50、20(g/ml)5个浓度，另设一个无菌水对照。2、 混药培养基平面的制作：将培养基（已灭菌）熔化，在无菌的条件下，取培养基9ml，加入1ml配制的药液于灭菌的培养皿，充分混合均匀，制成混药培养基平面，每浓度重复三次。3、 接种：使用打孔器打取菌块，用镊子将载菌的培养基小块放置在含药液的培养基表面，作好标签后，恒温培养。五实验注意事项：1、本实验要注意无菌操作，整个实验操作过程在无菌操作台上完成。2、药液和培养基混合时注意培养基的温度（70-80），并保证混合均匀；接种（菌块）前要冷却，接种时菌块的菌丝面向上。3、用打孔器打菌块时注意打孔器温度不要太高，以免影响菌种的生长。4、用打孔器打菌块时应在菌落的外缘打菌块，因外缘的生长力强，且差异小。六实验结果处理：供试菌培养2-3天后，检查病菌生长情况。培养皿内无病菌生长者用“-”号表示，有病菌生长者用“+”号表示，在“+”与“-”之间的药剂浓度即为抑制病菌所需药剂的最低浓度，一般取中间浓度为准。如果对照无病菌生长，此实验必须重做。七思考题：1、将最低抑制浓度检查结果记载于结果记载表中，并根据实验结果完成实验报告。2、比较各种药剂对病菌的毒力。3、讨论本实验方法的特点。表5杀菌剂最低抑制浓度测定结果记载表供试菌种供试药剂药剂浓度（g/ml）供试病菌生长情况有无杂菌备注123对照实验六杀菌剂抑菌圈测定法一实验目的：1、 了解杀菌剂抑菌圈测定法的基本原理及应用范围；2、熟悉杀菌剂抑菌圈测定法的实验方法。二实验原理：抑菌圈法又叫水平扩散法，此法最早曾广泛应用于抗菌素的效价测定，随后也被用于农业杀菌剂的毒力测定。其基本原理是在已接种供试菌的琼脂培养基上施以少量抗菌性物质或杀菌剂，使其接触培养基或病原菌，经过适当时间的培养后，接触部分的周围由于抗菌物质或杀菌剂的渗透扩散作用，杀死病菌的营养体（菌丝体）、繁殖体（孢子）或抑制其在培养基上生长，而产生抑菌圈。实验证明，在一定浓度范围内的药剂浓度与抑菌圈直径大小有一定的关系，即杀菌剂在一定范围内抑制菌圈直径或其平方与浓度的对数成直线函数关系，以抑菌圈直径或直径平方为纵轴，药剂浓度的对数为横轴，可绘成直线。如果被测的几种药剂所绘成的直线相互平行，则可根据一定浓度下抑菌圈大小进行不同药剂毒力大小的比较。抑菌圈法已被国际上通用的抗菌素效价测定方法。三主要仪器及试材：1、 供试菌种：棉花炭疽病菌；2、 供试药剂：多菌灵，百菌清等；3、实验器皿：无菌水，容量瓶，移液管，培养皿（9cm，5cm），PDA培养基，牛津杯（或滤纸片（0.5cm），镊子，注：以上器皿需经灭菌，超净工作台、灭菌锅、培养箱、分析天平，显微镜，接种环，记号笔，酒精灯等。四实验方法与步骤：1、 药液配制：使用无菌水，将多菌灵和百菌清分别配制成160、80、40、20、10g/ml，定容至10ml。以无菌水为对照。2、 制备菌悬液：取培养7天左右的供试试管菌种，加入少量无菌水（约6-8ml），用接种环轻刮斜面培养基上的孢子和菌丝体，制备孢子悬液，将孢子悬液用无菌双层纱布过滤于灭菌三角瓶内，并用灭菌棉塞塞口。然后用灭菌吸管吸取少量孢子悬液于载玻片上，在低倍（15×10）显微镜下检查每个视野中孢子数目，要求在80个左右。3、 制备载菌培养基平面：将熔化的培养基（已灭菌）冷却到45-50时，在无菌条件下，吸培养基9ml，加入1ml菌液于灭菌的培养皿内，充分混合均匀，制成载菌培养基平面。4、 药剂处理：在载菌培养基平面上放置牛津杯，（或将配好的药剂倒入灭菌的小培养皿内，用消毒镊子将已灭菌的滤纸片放入药液中浸泡1分钟后取出，放在消毒滤纸上，使滤纸片上多余的药剂被吸去，在无菌条件下，放入载菌培养基平面上）。共需要4只载菌培养皿，2只为一组，分成二组。在每只培养皿放6个牛津杯（或滤纸片），放置位置如下图所示，图中O代表牛津杯（或滤纸片），1，2，3，4，5分别代表配制的160、80、40、20、10g/ml5种药剂浓度，每个牛津杯内加入药液0.2ml，并作好标记。图1牛津杯（或滤纸片）在培养基上的排列培养：处理的培养皿，先放置在2-4的冰箱内4-6小时，待药剂在培养基中充分扩散后，再放入28培养。五实验注意事项：1、本实验要注意无菌操作，整个实验操作过程在无菌操作台上完成。2、药液和培养基混合时注意培养基的温度（45-50，温度过高会烫死病菌，过低培养基会凝固），并保证混合均匀。3、检查结果时十字交叉量抑菌圈直径，取其平均值。（以毫米为单位）六实验结果处理：处理的培养皿，先放置在2-4的冰箱内4-6小时，待药剂在培养基中充分扩散后，再放入28培养，30-40小时后检查结果，用尺十字交叉测量抑菌圈直径（以毫米为单位），取平均值。将每个培养皿中的40g/ml的抑菌圈直径（共8个）求出总平均值；求出每组（2个）培养皿中40g/ml直径（共4个）的平均值。总平均值与各组平均值的差数即为该组培养皿的校正值。用校正值来校正本组其他浓度的抑菌圈直径（比总平均值小的加上校正值，比总平均值大的则减去校正值）。以药剂浓度对数为横轴，以抑菌圈直径为纵轴绘制曲线，如果各曲线平行，根据药量反应曲线上的中等浓度比较不同的的药剂的抑菌圈大小，以此来判定药剂毒力大小。七思考题：1、将实验结果记载于抑菌圈测定结果记载表上，整理的结果在方格纸上或对数纸上绘成药量反应曲线。以药剂浓度对数为横轴，以抑菌圈直径为纵轴绘成曲线。如果各曲线平行，根据药量反应曲线上的中等浓度比较不同的药剂的抑菌圈大小，以此来判断药剂毒力。并完成实验报告。2、水平扩散法包括哪些试验方法，各有何特点。3、影响试验结果有哪些关键因子，应从哪些地方注意操作才能避免。表6抑菌圈测定结果记载表供试菌种供试药剂组别药剂浓度抑菌圈直径（mm）平均值总平均值校正值校正后的数值g/ml对数值第一组第二组实验七杀菌剂温室盆栽实验棉籽药剂拌种实验一实验目的：1、了解杀菌剂温室盆栽实验的基本原理及应用范围；2、熟悉杀菌剂药剂拌种实验的实验方法。二实验原理：药剂拌种的作用是杀死或抑制附着在种子表面或潜育在种子内部的病菌，保护幼苗不被病菌侵染而发病。药剂拌种可用于多种作物，如禾谷类小麦、高粱、玉米等可用药剂拌种防治附着在种子表面的黑穗病和黑粉病菌；用于棉花种子上，可防治棉花炭疽、立枯病菌等。室内药剂拌种试验的方法有两种：1）、利用人工保存菌种处理种子，将带菌种子用药剂进行处理，处理后的种子放在有琼脂培养基的培养皿中或放在细菌难以生长的培养基中，并放在病菌适宜的温度下保持7-10天，观察种子周围有无此病菌生长，是何状态，判断药剂效果。2）、利用天然带菌种子，以各种不同药剂处理后，播种在盆钵土壤内，一定时间后观察种子发芽率、发病率、苗高及有无病斑。本实验采用的供试种子是棉花种子，供试菌种为棉花炭疽病菌，用第一种方法进行人工接种，制成带菌种子。三主要仪器及试材：1、 供试药剂：多菌灵等2、 供试病菌：棉花炭疽病菌3、 供试种子：棉籽实验器皿：温室（或生化培养箱）、超净工作台、灭菌锅、培养箱、分析天平，烧杯，搪瓷盘，显微镜，无菌水，移液管，培养皿（9cm），PDA培养基注：以上器皿需经灭菌，镊子，接种环，记号笔，酒精灯等。四实验方法与步骤：1、选种：选取粒大、饱满、色泽一致、健壮无病虫的棉花种子，每个处理称取20克，共称8份。2、温汤浸种：将挑选的棉花种子（留1份作对照）放在温水（45左右）浸泡一下湿润绒毛，然后捞出棉籽放入50-55温水中烫30分钟，并不断上下翻动棉籽，使受热均匀。30分钟后捞出棉籽，凉至七成干。3、菌液拌种：取在棉杆上培养15天（或在试管斜面上培养7天）的棉花炭疽病菌，用无菌水制成孢子悬浮液，用纱布过滤，在显微镜下检查孢子数目，低倍镜下每个视野30-100个左右，共制备150ml菌液。将晾至七成干的棉花种子（留1份不拌菌液作对照）放入装有一定量菌液的烧杯中，用玻棒搅拌，使棉籽表面均匀的附着棉花炭疽病菌的孢子，取出晾至七成干，分别进行药剂处理。4、药剂处理：分别称取多菌灵等药剂，药量分别为种子重量的0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，按种子重量分别计算所需药量。用分析天平称取所需药剂，放入拌种容器内，再加入晾至7成干的带菌棉籽（留1份不拌药剂作对照），用玻棒搅拌使药剂均匀附着在棉籽上。5、种子的培育：（1）室内培养基培养带菌种子：将融化的马铃薯培养基均匀地倒入灭菌的培养皿内（每个培养皿15ml），凝固后放入药剂处理的种子，每皿放10粒，每处理设三个重复。对照共三个：1）、未经任何处理的棉籽；2）、温汤浸种未拌菌液的种子；3）、温汤浸种拌菌液但未拌药剂的种子。每个处理完成后，应作好标记，放入25-28下培养7天以后观察种子的发芽率和发病率。（2）温室带菌种子培育的方法：将经过高压灭菌的土壤装入花盆内（每盆装土为花盆的2/3），用自来水浇湿土壤，等水渗透后，用镊子夹取处理的棉籽播种于花盆内，每盆播种20粒，先播对照，再播种药剂处理的种子，然后在种子上盖一层干的灭菌土壤。每个处理作好标记，放在25下培育，经过2周左右观察种子的发芽率和发病率。五实验注意事项：1、植物种子的选择，应选取饱满，大小一致，健康无病虫害的种子。2、药剂拌种一定要均匀。3、种子培育过程中，要注意无菌操作，尽量减少杂菌污染。六实验结果处理：（1）室内培养基培养带菌种子：处理后的棉籽培养7天以后，检查种子的发芽率和发病率。决定种子是否带菌，看种子周围的培养基上有无病菌生长，此病菌是何状态。在培养基上生长的棉花炭疽病菌的孢子为淡红色的粘液（象细菌的菌落，菌丝为灰白色）。如果用肉眼难以鉴别，可以通过镜检确定。观察棉芽的胚根或胚茎上是否长有红色的纵裂痕或褐色病斑，检查结果与对照相比较，确定药效和药剂对种子发芽有无不良影响。（2）温室带菌种子的培育：播种于花盆内的棉籽，经14天左右如幼苗已全部长出就将幼苗全部拔出，用清水冲洗后检查（棉花炭疽病多发生在茎部），轻时为红色的纵裂痕，严重时为褐色病斑以至根腐烂而死，有时子叶也发病，在子叶边缘发生半圆形暗褐色病斑。记载出苗株数，求出出苗率，发病率，死苗率和防治效果，比较不同药剂的防效。七思考题：1、将实验结果记载于测定结果记载表上，并完成实验报告。2、根据试验结果比较不同药剂的防治效果。3、 高浓度下棉籽不出芽或出芽后生长不好，说明是什么原因？对照不出芽或出芽后很快死去又是什么原因？重复间结果是否相差很大，试分析影响的可能因子。表7不同药剂处理棉籽试验结果记载表药剂种类处理方式药剂剂量（种子重量的%）种子总数发芽率%发病率%防治效果备注123平均123平均123平均室内处理盆载处理实验八、除草剂室内毒力测定小杯法测定除草剂毒力一实验目的：学习种子发芽法测定除草剂生物活性的方法。二实验原理：种子发芽法是根据种子发芽率、根与茎的生长量、伸长度或形态的变化在一定范围内与药剂剂量呈相关性而测定除草剂的生物活性，种子发芽法适用于醚类、酰胺类、氨基甲酸酯类、激素类等除草剂，所用植物种子主要有小麦、油菜、水稻、稗草等。主要试验方法包括黄瓜幼苗形态法，小杯法，高粱法和稗草中胚轴法等。本实验采用小杯法进行除草剂室内毒力测定。三主要仪器及试材：1、供试药剂：稳杀得、杀草丹等2、供试植物：稻种等3、实验器皿：温室（或生化培养箱），分析天平，烧杯（150毫升、50毫升），移液管，洗耳球，玻棒，记号笔，镊子，培养皿（12cm）等四实验方法与步骤：1 选种：选取大小、色泽一致，健康无病虫害的稻种，在28条件下浸种24小时，催芽48小时，致种子破胸露白即可。2 药液的配制：将药剂配制成0.5、1.0、2.0、4.0、8.0g/ml5个浓度的药液各50毫升于烧杯中，以水为空白对照。3 制作发芽床：取50ml的烧杯，在底部放一张圆滤纸片（如果用小麦、油菜等旱地作物为试材时，需在滤纸下面放入10-20粒小玻璃球或者大砂粒）。4滴加药液：用5ml移液管分别将所测药液自低至高浓度滴加于铺有滤纸的小烧杯中，写好标记，重复4次。5播种：用镊子挑取萌发一致的催芽种子，每杯中放入水稻种子10粒，均匀放在烧杯内滤纸上并作好标记。6培养：将处理过的小烧杯放入28培养室内培养，白天给予日光灯光照，注意每天加一定量的蒸馏水，以补足其水分蒸发（或用150ml烧杯扣在50ml烧杯上）。7观察测量：约5天后药效症状明显时，分别测量株高（或称鲜重），计算株高（或鲜重）抑制率。五实验注意事项：1、植物种子的选择，应选取饱满，大小一致，健康无病虫害的种子。2、 掌握植物种子的浸种、催芽方法，选取刚萌发的种子来进行实验。3、 应选择适宜的发芽床。4、 注意种子发芽法适用的除草剂、植物种子的范围。每种除草剂往往都有其最适宜的测定植物和测定方法。六实验结果处理：培养约5天后检查实验结果，以直尺量取各稻种的株高（或称鲜重），计算株高（或鲜重）抑制率。根据测定结果，以药剂浓度的对数值为x，株高（或鲜重）抑制率换算成机率值为y，求毒力回归方程y=a+bx，并求抑制中浓度（IC50）值，且进行可靠性检验。表8除草剂种子发芽法测定结果记载表供试药剂处理浓度（g/ml）稻种总数株高（cm）平均株高（cm）株高抑制率（%）对照表9除草剂种子发芽法测定结果数据换算表供试药剂浓度（g/ml）浓度对数值株高抑制率（%）株高抑制率机率值毒力回归方程相关系数IC50七思考题：1、求出浓度对数株高（或鲜重）抑