实验室标准操作规程SOP复习进程.doc

Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。实验室标准操作规程SOP-实验室标准操作程序（SOP）版号：第一版编制：审核：批准：受控状态：发放编号：持有人：发布日期:2007年08月08日实施日期:2007年08月08日更改一览表序号更改时间更改章节号更改单号备注00.目录章节标题页数01细菌总数的检验402大肠菌群、大肠杆菌的检验503金黄色葡萄球菌的检验504沙门氏菌的检验605副溶血性弧菌的检验706霍乱弧菌的检验807单核细胞增生李斯特氏菌的检验908志贺氏菌的检验1009霉菌的检验1110表面样品的检验1211水的检验1301.出口食品细菌总数的检验方法1.仪器和设备11恒温培养箱：36±112恒温水浴箱：45±113高压灭菌锅14均质器1.5冰箱：0-4和-15-2016试管:18×150mm17锥形瓶:500ml250ml18平皿：直径为90mm19灭菌吸管110灭菌均质杯111酒精棉112天平:感量0.1g2培养基的制备2.1生理盐水:称氯化钠8.5g溶于1000.0ml蒸馏水中,分装锥形瓶和试管内,每管吸9ml，121高压灭菌。2.2平板计数琼脂称平板计数琼脂23.5g加入1000.0ml蒸馏水中，煮沸溶解，分装锥形瓶内，121高压灭菌。3.操作程序3.1样品稀释以无菌操作取25g样品放入装有225ml生理盐水的灭菌均质杯内，均质1分30秒，制成1：10的样品匀液用灭菌吸管吸取1ml样液放入9ml生理盐水中，摇匀。从试管中吸取1ml样液分别注入两个平皿内，制成10倍的样品稀释液，依次类推（10-2、10-3）平板计数琼脂（恒温45±1）分别倒12-15ml平板计数琼脂入各平皿待琼脂凝固后将平皿翻转立即将平皿内的样液和琼脂充分混合将平皿旋转，注意倾注时间不宜太长立即放进36±1的恒温培养箱内培养48±2h3.2培养4.计算如下表（备注：25-250个菌落为合适范围，菌落成链状明显的计为一个菌落，不明显的不计数，平皿边缘和琼脂表面成水膜样菌落或生长过量的，即报告为蔓延菌落。）样品号菌落数平皿菌落数1：101：1001：100012381602121802.3×103个/g22362602272802.5×103个/g3180014401.6×102个/g4多不可计24523多不可计278202.6×104个/g500000010个/g6多不可计25521多不可计225402.7×104个/g7多不可计21018多不可计240282.3×104个/g8多不可计26030多不可计230282.7×104个/g9多不可计多不可计523多不可计多不可计4875.1×105个/g10多不可计24535多不可计230蔓延菌落2.9×104个/g02.出口食品大肠菌群和大肠杆菌的检验方法1 仪器和设备11恒温培养箱：36±112恒温水浴箱：44.5±113高压灭菌锅14均质器15试管:18×150mm、18×180mm16锥形瓶:500ml250ml17平皿：直径为90mm18灭菌均质杯19灭菌吸管110酒精棉111天平：感量0.1g1.12冰箱：0-4和-15-201.13显微镜2培养基的制备2.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤称35.6g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装于有倒立的小发酵管的18×180mm试管中，每管10ml，于121高压灭菌15min。2.2煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）称40g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装于有倒立的小发酵管的18×180mm试管中，每管10ml，121高压灭菌15min。2.3EC肉汤称37g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装于有倒立的小发酵管的18×180mm试管中，每管吸8ml，121高压灭菌15min。2.4伊红美蓝琼脂（EMB）称37.5g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装于三角烧瓶，121高压灭菌15min。摇匀冷却至45倾注平皿。2.5营养琼脂称33g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，121高压灭菌15min。制成斜面备用。2.6生理盐水称氯化钠8.5g溶于1000.0ml蒸馏水中，分装锥形瓶和18×150mm试管内，121高压灭菌15min。2.7成品生化管2.7.1色氨酸肉汤2.7.2MR-VP2.7.3Koser氏枸橼酸盐琼脂2.7.4革兰氏染色试剂盒2.7.5Kovacs氏靛基质试剂2.7.6甲基红指示剂2.7.7V-P试剂甲液和乙液3.操作步骤3.1样品的稀释和培养以无菌操作取25g样品放入装有225ml生理盐水的无菌均质杯内，均质1分30秒，制成1：10的样品匀液用灭菌吸管吸取1ml均质好的样液放入9ml生理盐水中，摇匀前3支LST中分别注入1ml均质好的样液作为十倍的连续稀释度的样品稀释液从9ml生理盐水中吸取1ml稀释液，先注入另一支9ml生理盐水中摇匀接着吸取1ml样品稀释液分别注入中间3支LST中，作为百倍的连续稀释度的稀释液再从9ml生理盐水中吸取1ml稀释液分别注入后三支LST中作为千倍的连续稀释度的稀释液将LST放入36±1培养箱培养48±2h培养后观察导管内是否有气泡产生未产气报告为阴性,产气者进一步实验3.2大肠菌群的测定将所有产气管用接种环接到BGLB中放入36±1培养箱培养48±2h查MPN表报告大肠菌群的MPN值3.3大肠杆菌的测定同时将所有LST培养物接种到EC肉汤中放入44.5±1的水浴箱内培养48±2h注意水浴箱的水面应高于肉汤管液面如产气将培养物接种于EMB平板放入36±1培养箱培养48±2h未产气报告阴性查MPN表观察平板有无黑色中心、有无光泽菌落如有菌落挑两个典型的接种营养斜面36±1培养1824h3.4将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化实验。3.4.1色氨酸肉汤36±1培养24±2h后加kovacs氏靛基质两滴上层出现红色为阳性反应MR-VP培养基36±1培养48±2h无菌操作移取培养物1ml至灭菌试管中加5-萘酚乙醇溶液0.6ml，40KOH溶液0.2ml和少许肌酸结晶3.4.2振摇试管后静置2h出现红色为阳性剩余MR-VP再培养48h滴加5d甲基红如变红为阳性，变黄为阴性3.4.336±1培养96h记录有无生长Koser氏枸橼酸盐琼脂3.4.4革兰氏染色取18h斜面培养物作革兰氏染色大肠杆菌为革兰氏阴性靛基质MRVP枸橼酸盐鉴定（型别）典型大肠杆菌非典型大肠杆菌3.4.5大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下：3.5结果报告：大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌，发酵乳糖产酸产气，IMViC试验为或，再根据LST肉汤阳性管数查MPN表，报告每克样品中大肠杆菌MPN值。1g样品中最近似值(MPN)表使用三管法,接种量分别为0.1g,0.01g,0.001g阳性管数MPN阳性管数MPN0.10.010.0010.10.010.00100032009.10013201140026202200039203260103210150116.1211200129.22122701312213340206.2220210219.322128022122223502316223420309.4230290311323136032162324403319233531003.6300231017.230139102113026410315303951107.3310431111131175112153121201131931316012011320931211532115012220322210123243232901301633024013120331460132243321100133293331100备注：1.上表采用3个稀释度（0.1g、0.01g和0.001g）每个稀释度3管。2.如检样量改用1g、0.1g和0.01g时，表内数字相应降低10倍；如改位0.01g、0.001g和0.0001g时，表内数字相应增加10倍，其余类推。03.出口食品金黄色葡萄球菌的检验方法仪器和设备11恒温培养箱：36±112恒温水浴箱：45±113高压灭菌锅14均质器15试管:18×150mm18×180mm16锥形瓶:500ml250ml17平皿：直径为90mm18灭菌吸管19灭菌均质杯110酒精棉111天平:感量0.1g112冰箱：0-4和-15-202培养基的制备2.1生理盐水称氯化钠8.5g溶于1000.0ml蒸馏水中，分装锥形瓶和18×150mm试管内，每管吸9ml,121高压灭菌15min。2.2胰蛋白胨大豆肉汤称大豆肉汤30g和氯化钠95g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装18×180mm试管内，每管吸10ml,121高压灭菌15min。2.3Baird-parker培养基称6.3g溶于95ml蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装锥形瓶内，121高压灭菌15min。冷却至50，加入1瓶亚碲酸钾卵黄增菌液（冻干粉加5ml无菌生理盐水溶解）混匀。倾注平板备用，待平板凝固后放入冰箱0-4。2.4普通肉汤培养基称18g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装18×180mm试管，每管吸10ml，121高压灭菌15min。2.5冻干血浆（凝固酶试验）每支安瓶中加入0.5ml灭菌生理盐水至完全溶解，然后加入0.3ml待检液，于376h培养，观察判定结果。3.操作步骤3.1样品的稀释和培养以无菌操作取25g样品放入装有225ml生理盐水的无菌均质杯内，均质1分30秒，制成1：10的样品匀液用灭菌吸管吸取1ml均质好的样液先放入9ml生理盐水中，摇匀前3支大豆肉汤分别吸1ml均质好的样液作为十倍的连续稀释度的样品稀释液从9ml生理盐水中吸取1ml稀释液，先注入另一支9ml生理盐水中摇匀接着吸取1ml样品稀释液分别注入中间3支大豆肉汤中，作为百倍的连续稀释度的稀释液再从9ml生理盐水中吸取1ml稀释液分别注入后三支大豆肉汤中作为千倍的连续稀释度的稀释液放入36±1培养箱培养48±2h从各管接1环划线于Baird-parker平板放入36±1培养箱培养48±2h再从每一平板上挑取1个可疑菌落移种到肉汤培养基中，36培养24h取肉汤培养物0.3ml和0.5ml凝固酶试验于灭菌试管内充分混合，36培养观察6h是否有凝块，完全凝固为阳性备注：金黄色葡萄球菌的单个菌落在Baird-Parker琼脂平板上呈圆形，表面光滑、凸起、湿润，直径23mm。灰黑色至黑色，有光泽，常有浅色（非白色）的边缘，周围饶以不透明圈（沉淀），其外常有一清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样粘稠感。有时可见到不分解脂肪的菌株，除没有不透明圈和清晰带外，其他外观基本相同，从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落，其黑色常较典型菌落浅些，且外观可能较粗糙，质地较干燥。3.2报告结果查MPN表，报告金黄色葡萄球菌MPN/g。04.出口食品沙门氏菌属的检验方法1仪器和设备11恒温培养箱：36±112恒温水浴箱：45±113高压灭菌锅14均质器1.5冰箱：0-4和-15-2016试管:18×150mm12mm×100mm17锥形瓶:500ml250ml18平皿：直径为90mm19灭菌吸管110灭菌均质杯111酒精棉112天平:感量0.1g2培养基的制备21亚硒酸胱氨酸增菌液（SC）称取23g于1升蒸馏水中在无菌容器中溶解，定量分装备用。22亚硫酸铋琼脂（BS）称取49.6g于1升蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，冷却至55，摇匀，倾注灭菌平板备用。培养基不需要高压灭菌，平板为橙黄色。23胆硫乳琼脂称取64.3g于1升蒸馏水中，浸泡15分钟，煮沸至完全溶解，冷却至55，倾注灭菌平板备用。培养基不需要高压灭菌，新制备的培养基为玉白色不透明，24三糖铁（TSI）称取65g于1升蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装试管12mm×100mm，每管约24ml，11515分钟高压灭菌，制成高层斜面备用，桔红色。25尿素酶琼脂基础（U）称取2.21g于95ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，12115分钟高压灭菌，冷却至55灭菌加入40尿素溶液5ml，混匀，分装灭菌试管12mm×100mm，每管23ml，制成斜面备用。实验与判断：大量接种于37培养24±2h，强阳性反应为深红色，弱阳性为粉红色，阴性为黄色或不变色。26赖氨酸脱羧酶培养基（LD）称取1.9g于100ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装试管12mm×100mm，每管11.5ml，12115分钟高压灭菌备用。试验与判断：大量接种于37培养24±2h，阳性反应为紫色，阴性反应为黄色。27吲哚培养基（I）称取1.6g于100ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装试管12mm×100mm，每管11.5ml，12115分钟高压灭菌。271试验接种于37培养24±2h，滴加柯凡克试剂0.1ml。272判断阳性反应出现红色环；阴性为黄棕色环。28V-P半固体琼脂（VP）生化管试验：接种后于37培养24±2h，将甲液0.2ml(约6滴)加入试管中，摇匀，再加乙液0.1ml（约3滴），再摇匀。判断：阳性反应立即或在15min内呈现红色，阴性为铜色。阴性结果在1h后再做一次检查。有些试管在数小时后红色会逐渐消失，此仍作阳性反应。29丙二酸钠生化管（M）试验与判断：接种大量幼嫩试菌，于37培养24±2h，阳性反应为普蓝色；阴性不变色。210卫矛醇半固体（D）试验与判断：穿刺接种待试菌，于37培养24±2h，阳性反应为黄色阴性不变色3操作程序3.1分离培养再加入25g样品（无菌操作）在装有225ml无菌水中加上5.2gSC于37培养24±2h划线接种BS和DHL琼脂平板各一个于37培养2448h每个平板至少挑取2个典型或可疑菌落分别接种LD和U管，接种后不须灭菌接种针，直接接种TSI于37培养24±2h挑取菌落后的琼脂平板,应置于48至少保留24h，以备必要时复查。沙门氏菌落特征琼脂平板沙门氏菌落特征BS琼脂棕褐色或灰色至黑色，有时有金属光泽，周围培养基呈棕色或黑色，有些菌株呈灰绿色，周围培养基不变或微变暗DHL琼脂无色半透明有黑色中心或几乎全为黑色，有些菌株无色半透明32按下表进行试验与判断：TSI和LD培养基筛选TSI琼脂LD培养基初步判断斜面底层产气硫化氢KA（）（）可疑沙门氏菌属KA（）（）可疑沙门氏菌属AA（）（）非沙门氏菌属KK/非沙门氏菌属注：K产碱；阳性反应；（）少见反应；A产酸；阴性反应；/阳性或阴性反应。TSI和U琼脂筛选TSI琼脂U琼脂初步判断斜面底层产气硫化氢KA（）（）可疑沙门氏菌属KA（）（）非沙门氏菌属AA（）（）非沙门氏菌属KK/非沙门氏菌属注：K产碱；阳性反应；（）少见反应；A产酸；阴性反应；/阳性或阴性反应。4生化试验41将符合可疑沙门氏菌属特征的TSI琼脂培养物，按下表进行生化试验。序号生化项目沙门氏反应1U试验2V-P试验3LD试验4吲哚试验5丙二酸钠试验6卫矛醇试验d注：阳性反应；阴性反应；d反应不定。42所有生化试管均于37培养24±2h。43生化试管结果符合沙门氏菌属特性按血清学试验进行。44血清学试验441检查培养物有无自凝性在洁净的玻片上加一滴生理盐水，将待试培养物混合于生理盐水滴内，使成为均一性的浑浊悬液，将玻片轻轻摇动3060s，在黑色背景下观察反应（最好用放大镜观察）。如菌体彼此相凝集成明显或比较显小颗粒状物，即认为有自凝性，反之无自凝性。442检查“O”抗原对无自凝性的培物，按3.4.1的程度进行试验,但以多价“O”血清代替生理盐水,在2min判断结果.如为阳性结果以单价“O”血清进行分群试验.如为阴性结果,必要时,可结合生化试验结果按“Vi”抗原进行试验,再以多价和单价“O”血清进行试验.443检查“Vi”抗原按3.4.1的程序进行,但以“Vi”血清代替生理盐水。5报告结果：51报告阳性结果：发现沙门氏菌。52报告阴性结果：未发现沙门氏菌。06.出口食品霍乱弧菌的检验方法1仪器和设备11恒温培养箱：36±112恒温水浴箱：45±113高压灭菌锅14拍打式均质器15菌落计数器16试管:18×150mm12mm×100mm17锥形瓶:500ml250ml18平皿：直径为90mm19灭菌盒和枪头110灭菌袋111酒精棉112天平:感量0.1g1.13冰箱：0-4和-15-202培养基的制备21碱性蛋白胨水称取15g干粉于1000.0ml蒸馏水中，加热溶解，分装，12110min高压灭菌。22硫代硫酸钠、柠檬酸钠、胆盐、蔗糖琼脂（TCBS）称取89.1g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，冷至55倾注平板备用。23三糖铁（TSI）称取65g于1升蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装试管12mm×100mm，每管约24ml，11515分钟高压灭菌，制成高层斜面备用，桔红色。24霍乱双糖铁琼脂（KIA）称取64.5g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热溶解，分装。12115分钟高压灭菌，制成高层斜面备用。25T1N1琼脂称取35g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，12115分钟高压灭菌。倾注平板备用。在上项成分中改变氯化钠的含量，去除琼脂可制成T1N0和T1N3肉汤。26精氨酸葡萄糖斜面琼脂（AGS）称取58g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装，12115分钟高压灭菌，制成高层斜面备用。27O/F实验用培养基（HLGB）称取45.5g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装，每管3ml（有的加矿物油覆盖）12115分钟高压灭菌备用。28赖氨酸脱羧酶肉汤生化管29MR-VP肉汤生化管3.1样品的分离培养和初步鉴定:以无菌操作取25g样品放入装有225ml生理盐水的无菌袋内，均质1分30秒，制成1：10的样品匀液用灭菌枪头吸取1ml均质好的样液放入9ml碱性蛋白胨水中36±1培养1824h接种TCBS琼脂,36±1培养1218h划线接种于T1N1琼脂36±1培养1218h以无菌白色滤纸沾T1N1琼脂表面培养物滴加氧化酶试剂进行氧化酶试验用接种环取氧化酶阳性培养物0.5去氧胆酸钠液滴中进行粘丝试验以接种针取氧化酶和粘丝试验阳性物接种TSI、KIA和AGS，穿刺底层并划线斜面在取氧化酶和粘丝试验阳性培养物接种T1N0和T1N3肉汤将TSI、KIA、AGS、T1N0、T1N3肉汤于36±1培养1824h注：霍乱弧菌菌落特征形状大，光滑，黄色，稍平，具有不透明中心和半透明的边缘。霍乱弧菌初步鉴定试验中的反应KIATSIT1N0T1N3斜面底层斜面底层斜面底层霍乱弧菌A(K少见)AAa注：K-碱性；A-酸性；a-微酸性。霍乱菌属细菌在TSI、KIA、AGS中不产H2S，也不产气。一些气单胞菌属菌株可能产气。32确认试验以接种环取初步鉴定试验符合霍乱弧菌反应的T1N3培养物，分别接种到以下培养基：Hugh-Leifson葡萄糖肉汤（HLGB），36±1培养1824h。ONPG胨水，36±1培养1h3h或24h。赖氨酸脱羧酶肉汤，36±1培养2496h。阿拉伯糖肉汤，36±1培养24h。O/129试验用培养基，36±1培养1824h。霍乱弧菌的生化反应表生化项目生化性状生化项目生化性状TCBSYD-甘露糖AGSKa氧化酶ONPGNacl0V-Pv3精氨酸双水解酶6赖氨酸脱羧酶8鸟氨酸脱羧酶10抑菌试验42生长10ugO/129S蔗糖150ugO/129SD-纤维二糖明胶酶乳糖尿素酶阿拉伯糖注：Y-黄色；K-碱性；-80或更多的菌株阳性；-80或更多的菌株阴性；v-依据种或菌株的可变反应；S-敏感；AGS-精氨酸-葡萄糖斜面。所有试验均不产H2S和气体。4血清学凝集试验41自分离培养基上挑取可疑菌落与O1群霍乱弧菌诊断血清做玻片凝集试验。如可疑菌落在诊断血清中很快（一般在10s）出现肉眼可见的明显凝集，在生理盐水中不凝集者判为阳性。5报告结果霍乱弧菌的检出，可依据以下性状报告：革兰氏染色阴性，无芽孢或弯曲杆菌；TSI：斜面产酸/底层产酸，不产气，不产H2S；Hugh-Leifson试验：葡萄糖发酵阳性；氧化酶：阳性；精氨酸脱羧酶试验：阴性；赖氨酸脱羧酶试验：阳性；42生长：阳性；嗜盐性试验：0Nacl(有的非O1群霍乱弧菌不生长)3Nacl6Nacl蔗糖发酵：阳性；ONPG试验：阳性；阿拉伯糖发酵：阴性O/129抑菌试验：10ug敏感；150ug敏感；血清学试验：O1群、O139群、非O1群。最终结果的报告，应在生化试验的基础上报告血清群别、血清型别和生物型别。口07.出口食品单核细胞增生李斯特氏菌的检验方法1仪器和设备11恒温培养箱：36±112恒温水浴箱：45±113高压灭菌锅14均质器1.5冰箱：0-4和-15-2016试管:18×150mm12mm×100mm17锥形瓶:500ml250ml18平皿：直径为90mm19灭菌吸管110灭菌均质杯111酒精棉112天平:感量0.1g2培养基的制备21含0.6酵母浸膏的胰酪大豆肉汤（TSB-YE）称取3.6g药品溶入100ml蒸馏水中，水浴加热30min，分装试管，121高压灭菌15min，冷却后04冰箱保存备用。2.2含0.6酵母浸膏的胰酪大豆琼脂（TSA-YE）称取4.7g药品溶入100ml蒸馏水中，121高压灭菌15min，冷却50左右倒平板，待琼脂凝固后，放入04冰箱保存备用。2.3Fraser肉汤增菌液（FB1、FB2）FB1：称取12.38g药品溶入225ml蒸馏水中，121高压灭菌15min，冷却至50左右加入FB1添加剂1和添加剂2各1支备用。FB2：称取1.1g药品溶入20ml蒸馏水中，水浴加热30min，分装试管，121高压灭菌15min，冷却至50左右加入FB2添加剂1和添加剂2各1支备用。2.4PALCAM琼脂称取6.61g药品溶入100ml蒸馏水中，121高压灭菌15min，冷却至50左右加入PALCAM添加剂1和添加剂2各0.4ml，倒平板，待琼脂凝固后，放入04冰箱保存备用。2.5OXA琼脂称取5.85g药品溶入100ml蒸馏水中，121高压灭菌15min，冷却至50左右加入吖啶黄素、放线菌酮、多粘菌素E各1支，倒平板，待琼脂凝固后，放入04冰箱保存备用。2.67羊血琼脂2.7SIM动力培养基称取3.0g药品溶入100ml蒸馏水中，水浴加热30min，分装试管，121高压灭菌15min，制成高层斜面，冷却后04冰箱保存备用。2.8硝酸盐培养基2.9缓冲葡萄糖蛋白胨水2.10糖发酵培养基2.11过氧化氢酶试验3.操作程序3.1样品的培养和分离30±1培养25±1h前增菌称取25g样品放入225mlFB1培养基中吸取1ml培养物，加入FB1增菌液中，30±1培养25±1h二次增菌挑取可疑菌落，接种TSA-YE琼脂平板取1环划线分离于OXA和PALCAM平板35培养24h32生化鉴定321取菌落于载玻片上，典型运动镜检用0.85灭菌生理盐水制成悬浊液，压上盖玻片，于显微镜下观察呈短棒杆菌，见有轻微旋转翻滚322菌落呈短杆状革兰氏阳性革兰氏染色以无菌操作取25g样品323去菌落于洁净载玻片上，过氧化氢酶试验滴加1滴3的H2O2溶液，菌落呈过氧化氢酶阳性反应324将羊血琼脂平板划分为25个小格，溶血试验每格刺种1个菌落，30培养2848h，菌落呈-型溶血环32530培养24h，转种典型菌于TSB-YET肉汤中，蓝色菌落检验3251取培养物穿刺接种SIM半固体培养基，动力试验室温（2025）培养48h至7天，在半固体试管内呈典型伞状生长。3252取培养物接种硝酸盐肉汤中，硝酸盐还原试验35培养5天，加入甲液0.2ml再加入乙液0.2ml，混匀，2min内呈红色为阳性3253取培养物接种MR-VP肉汤中，MR-VP试验35培养48h，取1ml培养物于洁净试管中，再加入4氢氧化钾溶液0.2ml,摇匀，加5-萘酚溶液0.5ml，呈红色为VP阳性,剩余培养物继续培养48h,加甲基红1d,出现红色为MR阳性反应。3254取培养物接种于三糖铁琼脂，三糖铁试验35培养5天，斜面和底层产酸，不产硫化氢。3255取培养物分别接种于0.5葡萄糖、糖发酵试验麦芽糖、七叶苷、甘露醇、鼠李糖、木糖发酵管内，35培养2448h,结果分别是（）阴性继续培养到第5天，3256取培养物穿刺接种尿素酶琼脂斜面上，尿素酶试验35培养5天，呈阴性反应，斜面无颜色变化。李斯特菌菌种鉴别特征菌名蓝色菌落典型运动过氧化氢酶革兰氏染色溶血试验动力试验尿素酶试验硝酸盐还原MR-VP试验三糖铁试验糖发酵利用葡萄糖麦芽糖七叶苷甘露醇鼠李子木糖单核细胞增生李斯特氏菌/产酸，不产H2SVb绵羊李斯特氏菌/产酸，不产H2S英诺克李斯特氏菌/产酸，不产H2SVb威尔斯李斯特氏菌/产酸，不产H2SVb西尔李斯特氏菌/产酸，不产H2S格氏李斯特氏菌/产酸，不产H2S注：单核李斯特氏菌在OXA和PALCAM平板上的典型菌落呈黑色，直径2mm3mm，除在菌落周围有一环外，在菌落中心部位的深层也形成黑点。4报告结果：报告检出或未检出单核增生李斯特氏菌。08.出口食品志贺氏菌的检验方法1仪器和设备11恒温培养箱：36±112恒温水浴箱：45±113高压灭菌锅14均质器1.5冰箱：0-4和-15-2016试管:18×150mm12mm×100mm17锥形瓶:500ml250ml18平皿：直径为90mm19灭菌吸管110灭菌均质杯111酒精棉112天平:感量0.1g1.13冰箱：0-4和-15-202培养基的制备21GN增菌液22HE琼脂23SS琼脂24麦康剀琼脂25伊红美蓝琼脂26三糖铁琼脂27葡萄糖半固体28半固体管29葡萄糖胺琼脂210尿素琼脂311西蒙氏柠檬酸盐琼脂312氰化钾（KCN）培养基313氨基酸脱羧酶试验培养基：赖氨酸、鸟氨酸、及对照培养基314糖发酵管3155乳糖发酵管316蛋白胨水、靛基质试剂317志贺氏菌属诊断血清4检验程序41分离和培养于36培养6h8h称取25g样品放入225mlGN增菌液取增菌液1环划线接种HE和SS平板一个伊红美蓝平板一个，36培养18h24h另取1环划线接种于麦康凯平板或菌落呈现无色透明不发酵乳糖的菌落挑取平板上的可疑菌落36培养18h24h观察结果接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各1管42血清学分型和进一步的生化试验421血清学分型挑取三糖铁琼脂上的培养物，做玻片凝集试验。先用四种志贺氏菌多价血清检查，如果由于K抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再检查；如果呈现凝集，则A1、A2B群多价和D群血清分别试验。如系B群福氏志贺氏菌，则用群和型因子血清分别检查。福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原见下表。可先用群因子血清检查，再根据群因子血清出现凝集的结果，依次选用型因子血清检查。4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏多价1、2、3分别检查，并进一步用115各型因子血清检查。如果鲍氏多价血清不凝集，可用痢疾志贺氏菌312型多价血清及各型因子血清检查。福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原型和亚型型抗原群抗原在群因子血清中的凝集3，467，81aI1，2，4，5，91bI1，2，4，5，92aII1，3，42bII1，7，8，93aIII1，6，7，8，93bIII1，3，4，64aIV1，（3，4）（）4bIV1，3，4，65aV1，3，45bV1，5，7，96VI1，2，（4）（）X变体1，7，8，9Y变体1，3，4注：凝集；不凝集；（）有或无。422进一步的生化试验在做血清学分型的同时，应做进一步的生化试验，即：葡萄糖胺，西蒙氏柠檬酸盐。赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶，PH7.2尿素，氰化钾（KCN）生长，以及水杨苷和七叶苷的分解。除宋内氏菌和鲍氏13型为鸟氨酸阳性外，志贺氏