Ni树脂再生之详细步骤(共2页).doc

精选优质文档-倾情为你奉上镍柱琼脂糖树脂（Ni-NTA resin）再生方法摘 要： 镍柱纯化是为了纯化带有6个组氨酸（碱性氨基酸）标签的重组蛋白而设计，具有高度的亲和力和选择性。当Ni-NTA琼脂糖的颜色由浅蓝色变成灰褐色或白色时，需彻底再生后才能使用。再生方法总体可分为除去柱上残余蛋白、除镍、挂镍等三个步骤。先用变性剂和乙醇除去残余蛋白和脂类，再用EDTA与金属镍离子螯合去除镍，然后用NiSO4进行挂镍。 蛋白中的组氨酸残基可以和许多金属离子，例如锌、铜、镍、铁等形成复合物。因此，带有金属离子的柱料能选择性螯合具有组氨酸残基的蛋白质。半胱氨酸和络氨酸残基也能和固定化金属螯和，但是亲和力比组氨酸要弱。金属螯和柱料主要是由亚氨基的乙酰乙酸成分耦联琼脂糖柱料。镍柱纯化是为了纯化带有6个组氨酸标签的重组蛋白而设计的，Ni柱中的硫酸镍(NiSO4)可以与碱性蛋白结合。镍柱纯化系统设计了镍柱琼脂糖对串联排列的6-His（碱性氨基酸）残基有高度的亲和力和选择性。用咪唑洗脱目的蛋白时，咪唑会竞争性结合Ni，目的蛋白被洗脱下来。 如果纯化同一种蛋白，Ni-NTA resin不需要再生，可以重复使用3-5次。通常在使用3-5次后，结合效率有所下降，需用0.5M NaOH洗涤，也可用6M盐酸胍加500mM咪唑洗5-6个柱体积，然后用结合缓冲液平衡后即可再使用。但是，当Ni-NTA琼脂糖的颜色由浅蓝色变成灰褐色或白色时，则镍离子已经从柱子中丢失，Ni-NTA树脂需彻底再生后才能使用。再生方法总体可分为除去柱上残余蛋白、除镍、挂镍等几个步骤，具体方法如下：一、所需试剂：再生缓冲液：6M盐酸胍+ 0.2M乙酸2% SDS（m/V）25%、30%、50%、75%、100%的乙醇（V/V）100mM EDTA（pH8.0）溶液100mM NiSO4溶液二、镍柱（Ni-NTA）树脂再生步骤：（1）从层析柱下端流干所有溶液，用2倍NTA树脂体积的再生缓冲液洗。（2）用2倍体积的去离子水洗。（3）用3倍体积的2% SDS洗。（4）用1倍体积的25%乙醇洗。（5）用1倍体积的50%乙醇洗。（6）用1倍体积的75%乙醇洗。（7）用5倍体积的100%乙醇洗。（8）用1倍体积的75%乙醇洗。（9）用1倍体积的50%乙醇洗。（10）用1倍体积的25%乙醇洗。（11）用1倍体积的去离子水洗。（12）用5倍体积的100mM EDTA pH8.0 洗。（13）用3倍体积的去离子水洗。（14）用2倍柱体积的100mM NiSO4洗。（15）用2倍柱体积的双蒸水洗。（16）用2倍柱体积的再生缓冲液洗。（17）2倍柱体积的缓冲液平衡Ni-NTA树脂（18）将再生后的Ni-NTA树脂保存在20%的乙醇中注：其中乙醇洗涤的目的是由于其对脂蛋白、脂肪、疏水蛋白的去除效果较好，所以再生前需用不同浓度的乙醇洗柱。EDTA可与金属镍离子螯合，从而去除镍，然后再用NiSO4进行挂镍。专心-专注-专业