RNA提取中各种试剂的作用(共2页).doc

精选优质文档-倾情为你奉上氯仿是分子量比较大的有机溶剂，在提取RNA时，氯仿可以有效的使有机相和无机相迅速分离。RNA提取过程，有机相中主要是酚和蛋白结合，从而使得蛋白和RNA脱离，RNA进入水相。氯仿的作用有多个方面，加入氯仿，虽然有变性蛋白质的作用，但是其主要用处是用来分相，实际上是加速有机相和水相的分层。一般的trizol试剂在4度下是油状悬浮液，提高温度，放置一段时间，自然也会分相。离心后混合物分成三层：下层苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。RNA无一例外地存在于水样层当中。水样层的容量大约为400ul。【标准：1mlTrizol加200ul的氯仿，水样层的容量大约为所加Trizol 容量的60% 】上层水相，PH 5.1左右，当溶液pH在酸性的时候，RNA分子就会沉淀在酚与溶液的界面，只有RNA分子留在水相。而当pH接近中性时，RNA就会溶解在水相，（导致PH中性的大概原因是trizol与样品比例不对，应该尽量保证提取量的前提下使trizol过量）Trizol法提RNA，加氯仿就是要剧烈震荡才行，这样才能彻底地两相混匀。异丙醇的作用是通过-OH的疏水作用使得RNA链中的亲水基团受到保护，等同于沉淀，但是这是个反应时发生在水相中，与前面的氯仿不矛盾。通过将水样层和异丙醇混合来沉淀RNA， RNA沉淀在离心前通常不可见，形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。 异丙醇是沉淀核酸用的，作用和乙醇一样。只不过用量少一点，0.6V1V就够了，在水相很多，离心管容积有限，加不下太多乙醇的时候一般会用异丙醇沉淀。不过感觉效果不如乙醇，偶尔会有沉淀不出来东西的时候。【400ul的水相对应500ul的的异丙醇。】醇沉淀是很经常用的方法，因为RNA和某些杂质不溶于异丙醇，所以可以用来沉淀。乙醇沉淀的主要目的是沉淀+除盐。TRIzol主要物质是异硫氰酸胍，它可以破坏细胞使释放出来的同时，保护的完整性 。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA 可以通过异丙醇沉淀来还原。无论是人、动物、植物还是细菌组织，TRIzol法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(1 g)和细胞(>107)均有较好的分离效果。TRIZOL试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。所有的操作可以在一小时内完成。TRIZOL抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。故而能够作RNA 印迹分析、斑点杂交、poly(A)+ 选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。 提取时需要注意一些问题：提取时要做到超净台内操作、操作带一次性手套、EP管及Tip头都要用0.1%处理（0.1%DEPC浸泡过夜后，高压蒸气灭菌）、小心、细致、晃动及每次移液要轻。这样做的唯一目的就是两个，一是小心RNAse的污染降解RNA；二是动作过度暴力破坏RNA的完整性。另外你提的RNA做电泳的问题，一般RNA电泳应该是做甲醛变性电泳，但是一般的琼脂糖电泳也可以，需要上样量稍微大些，并且跑电泳的时间越短越好（这样也是为了减少外界RNAse对RNA的降解），跑完电泳立刻观察，这样也可以，但是如果样品中的RNA量很低或者说不是很高的话是检测不到的。因为这些试剂都会影响后续实验,所以用酒精洗一到两遍.一是酒精可以溶解一些沉淀中可能的有机物杂质,二是洗掉异丙醇,氯仿试剂,酒精的易挥发性 在这里的到运用,最后的乙醇主要是洗涤异丙醇，也可以溶解一部分蛋白，痕量的乙醇很容易挥发掉。专心-专注-专业