酿酒酵母表达水稻CuZnSOD基因抑制内源GSH的合成.pdf

东北林业大学硕士学位论文酿酒酵母表达水稻Cu/Zn-SOD基因抑制内源GSH的合成姓名：都业杰申请学位级别：硕士专业：生药学指导教师：安志刚20070601摘要摘要所有好氧生物都不可避免的受到活性氧(R O S)的攻击。在长期的生物进化过程中，生物体形成了不同的抗氧化体系来清除这些自身产生的R O S。谷胱甘肽(G S H)和超氧化物歧化酶(S O D)是生物体用于清除R O S 的重要的抗氧化系统。S O D 主要用于清除生物体自身产生的大量R O S，将超氧负离子转化为双氧水而将R O S 去除。G S H 可利用自身的活泼巯基与R O S 反应而自身被氧化为氧化型谷胱甘肽(G S S G)。一些研究结果表明G S H 和S O D存在一些联系，但到目前为止还没有关于这种联系的深入研究报道。本研究以好氧生物一酿酒酵母为实验对象，首次研究了水稻C u-Z n-S O D 在酿酒酵母的组成性表达，并通过S O D 活性和G S H 含量的变化，揭示了C u Z n-S O D 抑制内源G S H 合成的表达。具体研究结果如下：为了实现水稻C u-Z n-S O D 在酿酒酵母的组成性表达，本研究从酿酒酵母基因组中克隆出G A P P D H 基因的启动子，并使它与G F P 融合，转入酿酒酵母中，荧光显微镜可以观察到强烈的绿色荧光。同时利用逆转录聚合酶链式反应(R 1：P c R)，以水稻幼苗c D N A 为摸板，扩增了水稻的C u Z n-S O D 的e D N A 并克隆到酿酒酵母G A P D H 启动子调控下的表达载体p G P D(由p Y E S 2 0 改造而来)中，得到酿酒酵母表达载体p G P D-R-S O D，并转入酿酒酵母中进行表达。表达结果用S D S P A G E 分析，表达的水稻C u Z n _ s O D 分子量约为1 6 k D a。S O D 活性可以用活性胶染色及N B T 来检测。使用活性胶染色及N B T 测得S o D 活性，表达C u-Z n-S O D 的酿酒酵母菌体的S O D 活性可达到5 0 U m g(总蛋白)，而未表达C u-Z n-S O D 的野生型酿酒酵母菌体的S O D 活性只有2 0 U r a g(总蛋白)。从测定结果看出，水稻C u Z n S O D 可以在酿酒酵母菌体中得到高效表达。G S H 含量用D T N B 方法测定。为了研究过量表达C u-Z n S O D 的酵母菌体内G S H 生物合成的变化情况。测定了野生型酿酒酵母(I N V S C I)，表达G F P 的酿酒酵母和表达C u-Z n-S O D 的酿酒酵母在3 0 和热胁迫条f f f-(4 1)下的谷胱甘肽的合成情况。实验结果显示表达G F P 的酿酒酵母谷胱甘肽的含量与野生型酿酒酵母差别不大，但表达C u-Z n-S O D 的酿酒酵母的谷胱甘肽含量与野生型酿酒酵母谷胱甘肽含量相比有明显的降低。热击胁迫条件下也有类似的结果。因此可以得出结论在正常情况和胁迫条件过量表达外源C u Z n-S O D 可能对内源谷胱甘肽合成有一定的抑制作用。本研究结果为深入揭示G S H 和S O D 的相互联系提供了重要的分子生物学研究基础，对生物自身抗氧化体系的相互作用机制具有重要的科学参考价值。关键词水稻铜锌超氧化歧化酶：基因表达；酿酒酵母；谷胱甘肤东北林业大学硕士学位论文A b s t r a c tA e r o b i c a l l yg r o w i n go r g a n i s m sa r ca n a v o i d a b l ya l f f e r e df r o mo x i d a t i v es t r e s s(R O S)a n d优繇m i s I n sh a sd e v e l o p e ds c v e r a Jm e c h a n i s m st 0r e m o v et h e s eR O S G S Ha n dS u p e r o x i d ed i s m u l a s e(S O D)i st h em a j o ra n f i o x i d a n ts y s t e m si nt h eo r g a n i s m s S O Di st h ee n z y n l et h a tc a t a l y z e st h er e m o v a lo f s u p e r o x i d er a d i c a l sw h i c ha r eg e n e r a t e di nv a r i o u ss p e c i e s G S Hc a nr e a c t、】i t l lR o Sa n dG S HW a Sm m e di n t oG S S G，S o m es t u d yh a si n p l i e dt h e r ei SS O m el i n kb c t w nt h e m b u tn od e t a i lr e s e a r c hr e s u l t sa b o u ti th a sb e e np u b l i s h e dt i l ln o w S a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a eW a Su s e da Sam o d e lt Os t u d yt h ef u n c t i o n a ll i n kb e t、v 黜S O Da n dG S H T h r o g ht h er e 刚to ft h eS O Da c t i v i t ya n dG S H c o n t c n td e t e r m i n a t i o n ac o n c l u s i o n 锄b ed r a w nt h a to v e r e x p r e s s i o nS O Di nS a c c h a r o m y c e s 矗俐捃妇c a ni n h i b i tt h eG S Hs y n t h y s i s I no r d e rt oc o n s t i t u t i v ee x p r e s s i o nr i c eC u Z n-S O Di nS a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e,t h eG A P D H(g l y c e r a l d e h y d e-3-p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e)p r o m o t e rf i-o mS a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ew a sa m p l i f i e db yP C Rw i t ho l i g o n u e l e o t i d ep r i n l e r sa n df u s e dt ot h eG F Pg e n e S t r o n gg r e e nf l u o r e s c e n c ef r o mt h ec e l l so ft h eS a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a et r a n s f o r m e dw i t hp G P D-G F Pw a sd e t e c t e db yt h ef l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e U s i n gR T-P C Rm e t h o d,W eg o tt h er i c eC u Z n-S O De D N Aa n dc l o n e di np G P D(d r i v e df r o mp Y E S 2 o、t of o r mp G P D-R-S O D p G P D-R-S O DW a St r a n s f o r m e dt ot h eS a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a et oe x p r e s sr i c eC u Z n-S O D 1 1 l et o t a lp r o t e i nW a Se x t r a c t e df i o mt h et r a n s f o r m a n t sa n d 勰a l y 刹b yS D S P A G E T h e r ei sao b v i o u sb a n da b o u t1 6K D ao nt h eg e lw h i c h 啪sa b s e n ti nt h ec o n t r o lc e l l s U s i n gn a t i v eg e la n dN B Tm e t h o dw ec a nd e t e c tt h ea c t i v i t yo f C u-Z n-S O D 1 1 l ea c t i v i t yo f t h eS o Df r o mt h et r a n s f o r m e dS a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ei sa b o u t5 0 U m gt o t a lp r o t e i n,b i nt h ea c t i v i t yo ft h eS O Df r o mt h ew i l dt y p eS a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ei sa b o u t2 0 U m gt o t,1p r o t e i n F r o mt h e他s u l t so ft h ed e I t g l l t l J n a t i o no fS O Da c t i v i t y,W ec a l lc o n c l u d et h a tt h er i c eC u Z n-S O Dg e n ec s ne x p r e s s-m 溉哟，c e s 聊i s i a e e f f i c i e n t l y G S Hc o n t e n tw a sd e t e r m i n e db yD T N Bm e t h o d F r o mt h er e s u l t so f G S Hc o n t e n td e t e r m i n a t i o n,t h eG S Hc o n t e n to ft h ew i l dt y p ey e a s tw a sa l m o s tt h es a m ea St h ey e a s te x p r e s s i I l gG F P b u tw a sh i g h e rt h a nt h ey e a s te x p r e s s i n gr i c eC u Z n-S O Du n d e rh e a ts h o c ka n dn o r m a lc o n d i t i o n I nt h i ss t u d y,w ed e m o n s w a t et h a tt h eh e t e r o l o g o u se x p r e s s i o no far i c eC u Z n-S O Dg e n ei nt h eS a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a em a yl i m i tt h es y n t h e s i so f e n d o g e n o u sG S Hu n d e rh e a ts h o c ka n dn o r m a lc o n d i t i o n T h er e s u l t so ft h i sr e s e a r c hs h o wt h ef u n c t i o n a ll i n kb c t w g c nG S Hs y n t h e s i sa n dS O Da c t i v i t ya n dt h ei n t e l a C f i o nm e c h a n i s mo f d i f f e r e n ta n t i o x i d a a ts y s t e mi nv i v o K e y w o r d sR i e e-C u-Z n-S O D；G e n ee x p r e s s i o n；S a c e h a r o m y c e sc e r e v i s i a e；G S HI I 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得壅韭盎些盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：帮艾态，签字日期：a”7 年f 月2 0 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解壅i 垦盎些盘茎有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权盔皇堡挂些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：加业杰签字日期：a 口T 年i 月】口目学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：导师躲掘田 iI签字日期：力卯译多月乙锢电话：邮编：1 绪论1 绪论1 1 引言所有好氧生物在生命过程中都会产生大量的活性氧分子(R 0 s)。这些活性氧分子能够高度破坏细胞组成部分蛋白质，核酸，脂类物质从而引起细胞衰老甚至死亡l l】o 生物在长期的进化过程中，产生了各种机制去除这些活性氧分子(R o S)。S O D 是目前为止发现的唯一一种以自由基为底物的酶类。在细胞中S O D 主要用于去除细胞代谢过程中产生的超氧负离子。G s H 也是细胞中最重要的非酶类自由基去除剂之一，在体内起着调节体内氧化还原平衡的作用。很多研究表明R O S 与人类健康有着密切的关系，很多疾病都直接或间接与体内R O S 含量过高有关。癌症 2-6 1，神经退化 7 1，衰老 s l 都是由体P q R O S 升高引起的，而C u Z n-S O D 可催化去除不同生物产生的R O S 1 1，它被认为是细胞抵御氧化胁迫的第一道防线。谷胱甘肽是生物体内一种高效的抗氧化剂，也是体内最重要的抗氧化系统之一。G S H可以依靠自身的活泼巯基与R O S 反应，而自身被氧化为G S S G，G S S G 可被谷胱甘肽还原酶还原为G S H。很多研究结果暗示，G S H 和S O D 抗氧化系统在体内存在着相互联系。但没有直接研究结果来证实这一结论。本研究通过在酿酒酵母中高效表达水稻C u Z n-S O D 基因，同时检测G s H 合成的情况，以研究C a S H 和S O D 抗氧化系统的相互联系。1 2 S o D 文献综述1 2 1S o D 发展历史1 9 3 8 年M a n n 和K c i l i n 首次从牛红细胞分离到一种蓝色铜蛋白(命名为血铜蛋白H c m o c u p r c i n)，M c c o r d 和F r i d o v i c h 于1 9 6 9 年将其定名为超氧化物歧化酶(S u p e r o x i d eD i s m u t a s c，简称S O D)。人们已对它进行了广泛的研究，它是目前2 0 0 0 多种酶中研究报道最多的一种，也是当今生物学前沿研究课题之一，对它的研究在自由基生物学发展中具有十分重要的作用。S O D(E C 1 1 5 1 1)是生物体防御氧化损伤的一种重要的酶，其作用是消除体内代谢产生的超氧阴离子(o 2)自由基对机体的影响。1 2 2S o D 的分类及分布S O D 分布广泛，需氧的原核生物和真核生物都含S O D。而且发现多种厌氧细菌也有S O D。S O D 是含金属的酶，依其所含金属离子的不同将其分为3 类：C u Z n-S O D、M n-S O D 和F e-S O D。C u Z n-S O D 主要存在于真核细胞质中，但光合细菌也含C u Z n-S O D。M n-S O D 主要存在于原核生物和真核生物线粒体中，F e S O D 则存在于原核生物中，但也有人报道F e-S O D 存在于真核藻类及植物叶绿体基质中。近1 0 年来，通过对己完成的全部氨基酸序列分析结果的比较研究，发现不同来源的C u Z n-S O D 在氨基酸序列上有较高同东北林业人学硕上学位论文源性，且理化性质相似，而不同来源的M n-S O D 和F c S O D 也有较高的氨基酸同源性和相似的理化性质。1 2 3 S O D 的性质S O D 等电点偏酸性，为酸性蛋白。它对热、P H 和蛋白水解酶的稳定性比一般酶要高。三类S O D 的主要理化性质列表如下c u b a 一9 0 DMn s D DF e-s D D分子结构=或四臻体=或四聚体_ 二或四聚体分子髓3 2，0 0 06 5，0 0 04 2，0 0 08 5 0 0 04 2 0 0 08 5，0 0 0金属台蛰I C u：1 Z n05 M n05 I F c颜色蓝绿色紫红色黄褐色特征吸收峰2 6 0 a m6 8 0 m _ I2 8 0 M4 7 5 n m2 8 0 u m分子构象主要是B 折叠主饔是o r 甥旋主要是螺旋抑制剂氰化物H o!E D T A叠氯化物叠氮化物H o2E D T A、1 2 4S O D 活性的检测方法S O D 催化的反应为O-2+2 1 4+一0 2+H 2 0 2，0-2 的寿命极短，给S O D 活性的检测带来很大困难。目前对S O D 活性的测定方法有两类。孤直接法应用脉冲射解技术进行毫微秒级快速动力学跟踪及快速冰冻结合电子自旋共振(E S R)波谱观察来直接获取S O D 和O 的动力学信息，如极谱氧电极法。b 间接法由产生超氧自由基的系统和检测O-2 的系统组成，如N B T 还原法、黄嘌呤氧化酶法、邻苯三酚自氧化法等。各种间接法都存在不同程度的问题，应用时应有所考虑。1 2 5C u，z n S o D 的催化机理C“Z n-S O D 是一种存在与真核细胞质，细胞核，过氧化物酶体，线粒体基质的一种重要的抗氧化酶类【l 2】。人C f f Z n-S O D 蛋白是一种3 2 K D a 的二聚体蛋白。每个亚基由1 5 3 个氨基酸组成。很多不同来源的C“Z n-S O D 的晶体结构已经被测定【1 3】。每个亚基含有一个B-b a r r e l结构和两个可以结合金属的与酶功能有关的重要的环状结构(图片1 1 1。每个亚基都含有一个铜结合位点和一个锌结合位点，这两个位点足够近，它们共用同一个咪唑残基作为配体(H i s-6 3，K C u Z n-S O D)。与锌离子形成配位键的7 l 位的眯唑残基的昧唑环的N 原子和与铜形成配位的4 6 位的咪唑残基的咪唑环上未参与配位的N 原子与1 2 位的A s p l 2 4 共同形成的氢键结构将铜离子和锌离子的相互作用进一步加强。与铜形成配位的1 2 0 位的咪唑残基的咪唑环上未参与配位的N 原子与1 4 1 位置的G l y l 4 1 的羰基形成氢键参与这一功能区。与铜形成勇己位的4 8 位的咪唑残基的咪唑环上未参与配位的N 原子与1 4 3 位的A s p l 4 3 的胍基及与6 l 位置的G l y 6 1 的羰基形成的氢键构成了与催化有重要作用的活性结构。1 4 3 位的A s p l 4 3 与5 7 位的c y s 5 7 的羰基形成的氢键和c y s 5 7 与1 4 6 位的c 砷1 4 6 形成的s-s 有助于二聚体的形成(图1-2)1 1 3,J 4 1。图1 1l C u 胁-S O D 的晶体结构。铜原子和锌原子分4 用蓝色球和橙黄色球表示。亚基问的孓s 用红色表示。F i g r l 1C o s t a ls l n l e t u r eo f m e t a lb o u n dd i n 靠ch u m a nS O D l(1 2 4 IC o p p 目a n dz i n ci o n sa ms h o w n 岱b l u ea n dO l a n g es p h e r e s,r e s p e c t i v e l y T h ez i n cl o o pi sd e p i c t e d i no r a n g ea n dt h ee k c o s 锄cl o o pi nt e a l T h ei n t r a s u b u n i td i s u l f i d eb o n di ss h o w ni nr e d 当酶处于氧化状态时，锌与H i s-6 3，H i s-7 1，H i s 8 0 和A 印8 3 形成四个配位键，形成四面体结构。铜与H i s-6 3，H i s-4 6，H i s-4 8，H i s 1 2 0 及一分子的水形成五个配位键。此时C u 显正二价。当酶处于还原状态时，铜与H i s-6 3 的配位键打开，锌依然与H i s-6 3，H i s-7 1，H i s-8 0和A s p S 3 形成四个配位键，形成四面体结构。而铜与H i s-4 6，H i s-4 8，H i s-1 2 0 形成三个配位键。此时C u 显正一价(图1 3)。图I-2 S O D I 重要功能区及其氢键网络铜原子和锌原子分别用蓝色球和橙黄色球表示。铜原予和锌原子依靠共用同一个咪唑(H i s-6 3)残基作为配体及与锌离子形成配位键的7 1 位的咪唑残基的咪唑环的N 原子和与铜形成配位的4 6 位的睬矬残基的昧噬环上未参与配位的N 原子与1 2 4 位的A s p l 2 4 共同形成的氢键相连。1 4 3 位的A s p l 4 3 与5 7 位的C y s 5 7 的羰基形成的氢键有利于双聚体的形成。F 嘻1-2H y d r o g e nb o n d m gn e t w o r ki nf u n c t i o n a l l yi m p o r t a n tr e g i o n so f S O D I C o p p e r(b l u es p h e m)a n dz i n c(o r a n g es p h e r e)i o n s 勰l i n k e dt h r o u g ht h ei m i d a z o l a t eb r i d g e(H i s 6 3)a n da c o l 珂a r yh y d r o g e nb o n db r i d g ei n v o l v i n gH i s 4 6(c o p p e rl i g a n d)，H i s T l(z i n cl i g a n d),a n dA s p l 2 4 T h ec o p p e rl j 静n dH i s l 2 0i sa l s oh y d r o g e nb o l l d e dt ot h ec a r b o n y lo x y g e no f G l y l 4 1l o c a t e d0 1 1t h ee l e c t r o s t a t i cl o o p H i s 4 8(c o p p e rl i g a a d)i sl i n k e dt ot h ea 妇l 删l yi m p o r t a n tA r 9 1 4 3t h r o u g hh y d r o g e nb o n d st ot h ec a t l”n y lo x y g e no f G l y 6 1 T h ed i s u l f i d el o o p,p a r to f w h i c h i s i n t h e d i m e r i n t e r f a c e,i s h y d r o g e n b o a d M t h r o u g h t h e c a r b o n y l o x y g e n o f C y s 5 7 幻A r g l 4 3 4 1 绪论图I 3 上面的为氧化状态的C W Z n-S O D，锌与H i s-6 3，H i s-7 1，H i s-8 0：f 4 1 A s p 8 3 形成四个配位键，形成四面体结构。铜与H i s-6 3，H i s-4 6，H i s-4 8，H i s-1 2 0 及一分子的水形成五个配位键。此时C u 显正二价。下面的为还原状态的C u Z a a-S O D。铜与H i s-6 3 的配位键打开，锌依然与H I S-6 3，H i s-7 1，H i s-8 0 和A s p 8 3 形成四个配位键。形成四面体结构。而铜与H i s-4 6，H i s-4 8，H i s-1 2 0 形成三个配位键。F i 昏1-3O x i d i z e d(t o p)a n dr e d u c e d(b o t t o m)m e t a l-b i n d i n gs i t e s T h ec u p r i cf o r mo f t h ee l l z y n l ep o s s e s s e smi n t a c ti m i d a z o l a t e 嘶d g eb c t w o e l lc d+a n d 盈tT h ec o p p e ri sf i v e e o o r d i n a t eb o u n db yf o u rh i s t i d y ls i d ec h a i l l Sa n d eW 越g l m o l e c u l e I n t h e c u p r o l l S f o r m o f t h ee l l z y l l l e,l h e i m i d a z o l a t e t r i a g e i s b r o k e n b e I M 嘞t h e b r i d g i n g h i s t i d i n eo i s 6 3)a n dt h eC 屹w h i c hb e c o m e st h r e e-c o o r d i n a t eh o t r o db yo n l yt h r e eh i s t i d y ls i d ec h a i n s 2 0 2 十2 H+啼0 2 十H 2 0 2o i+C u 2+Z n S O D _ 0 2+C u+Z n S O Do 了十2 H+C u+Z n S O D 哼H 2 0 2+C u 2+Z n S O DR e a c t i o n1 R e a c t i o n2 R e a c t i o n3 图1-4C u Z n-S O D 酶反应的过程。F i g 1-4P r o c e s so f 毪r e J t e t i o no f C t u Z n-S O D铜结合位点是C u Z n-S O D 催化活性的关键位点，催化超氧负离子发生歧化反应产生水和氧气【l o，1 2 3 5-2 1】(反应1)。这种催化过程包括两个步骤。一分子催化超氧负离子先还原C u 2+而形成0 2(反应2)。第二分予超氧负离子继续氧化c l l+而形成H 1 0 2(1 虱1-4)【删1 2 6S O D 的生理学功能超氧化物歧化酶(S O D、国际生化委员会编号：1 1 5 1。1)是一种生物活性蛋白质，是人体不可缺少、重要的氧自由清除剂，也是目前为止发现的唯一的以自由基为底物的酶，在维护生物机体内自由基产生与清除的动态平衡中起极其重要的作用。1 2 6 1S 0 1)体内去除R O S 过程东北林业大学硕上学位论文有氧呼吸的生物依靠氧气作为呼吸过程中的终端电子受体。氧气对于生命是必须的，但同时也是致命的。大约有5 的氧在呼吸作用过程中没有被最终转化为水，而是被转化为R O S(不但包括超氧负离子，羟基自由基，还包括一些单线氧及过氧化氢)。R O S 可以对D N A，蛋白质，脂质造成很大的损害1 2 0 2 1 2 2 2 3 1。C u Z n-S O D 是生物体内一种极为重要的一种抗氧化酶类。它可以将生物代谢过程中产生的大量的R o S 转化为水和过氧化氢清除掉。细胞中的G S H 可进一步将过氧化氢转化为水而清除掉。1 2 6 2S o D 与氧化胁迫C u Z n-S O D 可以去除不同生物体产生的R o S。高效表达人C u Z n S O D 的酿酒酵母可以抵抗由热胁迫和由甲萘醌等化合物引起的氧化胁迫，但不能对由过氧化氢引起的氧化胁迫刚。S O D I(C u Z n-S O D)基因突变的酿酒酵母产生硫代谢缺陷。S O D l 突变体在无氧条件下，将不能合成蛋氨酸和赖氨酸。可能是因为细胞质中缺乏C u Z n S O D，而导致细胞质中R O S 水平上升而使对R O S 敏感的次生代谢酶被破坏。M n-S O D 基因突变的酿酒酵母随着氧气浓度升高而敏感，但对空气浓度的氧气浓度不敏感1 2 5,2 6 1。S O D I(C u Z n-S O D)基因突变的酿酒酵母甚至不能够忍受空气浓度的氧气浓度 2 7-3 1 J。1 3 G S H 文献综述1 3 1G S H 的发现早在1 9 2 1 年H o p k i n s 得到谷胱甘肽晶体，1 9 2 9 年H o p k i n s、K e n d a l l 等提出G S H 为三肽，1 9 3 5 年f l j H a r i n g t o n 和M e a d 阐明其化学结构并加以合成。G S H 存在于所有生物细胞中，而以酵母、谷物种子胚芽、人体和动物的心脏、肝脏、肾、红细胞和眼睛晶状体中含量较高。正常人体内还原性谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽(o s s o)的比例为1 0 0：l，全血中G S H的正常浓度约为3 7 1 i n e dd l，人体的肝脏和肾脏是G S H 主要的合成、代谢和排泄器官。谷胱甘肽的主要生物学功能是保护生物体内蛋白质的巯基进而维护蛋白质的正常生物活性，同时它又是多种酶的辅酶和辅基。G S H 的重要生物学功能与谷胱甘肽的分子结构有密切关系，例如G S H 分子中的巯基参与中和氧自由基、解毒等重要功能；所含的y 旬谷氨酰胺键能维持分子的稳定性并参与转运氨基酸；G S H 中的甘氨酸和半胱氨酸残基参与胆酸的代谢等。1 3 2G S H 的分子结构及性质谷胱甘肽的分子量为3 0 7 3 3，熔点1 8 9 1 9 3 C(分解)，晶体里无色透明细长柱状，等电点5 9 3。G S H 溶于水、稀醇、液氨和二甲基甲酰胺，而不溶于醇、醚和丙酮。G S H 固体较为稳定，其水溶液在空气中易被氧化。两分子还原型谷胱甘肽(G S H)氧化缩合为二硫键，即得到氧化型谷胱甘肽(S S O)，其中只有还原型谷胱甘肽才具有生理活性。它在革兰氏阴性好氧细菌中含量较高，而在革兰氏阳性和厌氧细菌中几乎没有。F a h e y t 3 2 通过对各种低等微生物中谷胱甘肽含量研究发现，惟一一种不含谷胱甘肽的光合细菌是远古细菌中的嗜盐菌属，而在蓝藻菌和粉色光合细菌中谷胱甘肽的含量已经相当高了。由此推断它是生物进l 绪论化过程中，作为抵御氧化压力的种物质出现的。谷胱甘肽普遍存在于真核生物中，在酵母细胞中其浓度更可高达1 0n u n o l L。谷胱甘肽能以还原态的G S H，氧化态的G S S G，及一些二硫化合物形式存在，如G S S-C O A、G S S-C y S 等。谷胱甘肽最初是作为生物体内一种高效的抗氧化剂而被关注的。它的氧化还原电位非常低(E o=2 2 4 0m Y)，可以非常容易地与二硫化物进行巯基交换，体内的蛋白质巯基被氧化失活时，可以通过谷胱甘肽“解救”出来。谷胱甘肽的还原态由谷胱甘肽还原酶来维持，这一酶依耥A D P H。谷胱甘肽的巯基上的s 原子上有未共用电子，具强亲核性，可与亲电体结合，尤其是那些对生物体而亩属于外源性的化合物，所以谷胱甘肽又被喻为生物体内的“清道夫”f 3，l。1 3 3G S H 的代谢及其代谢调控1 3 3 1 合成与降解谷胱甘肽在酵母菌中的合成由两步酶促反应构成：谷氨酸、半胱氨酸在Y 谷氨酰半胱氨酸合成酶(Y G C S)催化下合成Y-谷氨酰半胱氨酸，然后在谷胱甘肽合成酶作用下，Y 谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸合成谷胱甘肽，合成在胞内进行。谷胱甘肽在结构上与其它多肽相比有两个特点：不象大多数多肽被多肽酶在N 端氨基酸的a 羧基处分解，它的N 端肽键由谷氨酸的r 羧基和半胱氨酸的氨基构成，这一结构保证它不被细胞内一般的蛋白酶水解，只能由定位于胞膜上的y 谷氨酰转肽酶(Y-G T)来执行分解。Y-G T 是惟一的谷胱甘肽降解蒯蚓。1 3。3 2G S H l、G S H 2 基因的表达调控酵母中的谷胱甘肽由y 缶c s(y 谷胺酰半胱氨酸合成酶)和谷胱甘肽合成酶合成(图1 5)，分别由G S H l、G S H 2 基因编码。Y-G C S 是谷胱甘肽合成的关键酶，S u g i y a m a l 3 5 1 等研究发现，Y-G C S 的表达是受高度调控的，除受终产物谷胱甘肽反馈抑制外，还明显受转录水平上的2 个调节子Y a p l P 和S k n 7 P 控制。这2 个转录因子受到环境变化刺激后。结合到G S H I 基因的启动子上，调节Y-G C S 的m R N A 的转录，进而调节细胞内的谷胱甘肽水平。斯坦福大学的G 融d 1 和S 刚l r 啪等跚用D N A 微集阵列(即D N A 芯片)，检测了酵母的每一个基因受到环境变化刺激后，在表达水平上发生的变化，也得到了相同的结论。实验采用的环境变化有：维生素K 3、过氧化物等活性氧试剂；热冲击；高低渗透压冲击；氨基酸饥饿等等。结果显示大约有9 0 0 多个基因对这些变化表现出了相似的激烈反应。其中转录因子Y a p l p 高度调控Y-G C S 等基因的表达。谷胱甘肤一I 馥k 谷虢甘肤+纠虢氨酸_=尹k 谷氨酸一k 畔臆氮酸，、T PA D P+P ib 甘氯酸 谷胱甘肽一群二=_ 谷胱管肤A T PA D P+P i图1-5G S H 的生物合成F 嘻I-5B i o s y n t h e s i so f G S H1 3 4G S H 在酿酒酵母中的生理学功能谷胱甘肽是一种广泛存在于自然界的活性三肽化合物，具有还原型(G S I-I)和氧化型(O S S G)两种形态，其中在生物体内起主要作用的是还原型G s 一刁。G S H 分子中含有y 一谷氨酰基和活性巯基，可参与多种生物学反应，对于维持胞内适宜的氧化还原环境具有重要意义口明。由于G S H 具有解毒【3 l、抗氧化和防衰老等重要生理功能【4 J。其分子中有一特殊肽键Y 一谷氢酰胺键，G S H 的许多特殊性质与此肽键有关。G S H 分