细胞生物学实验课程教案(1).pdf

细细 胞胞 生生 物物 学学 实验课程教案（实验课程教案（1 1）实验题目实验题目血涂片的制备及细胞大小的测量血涂片的制备及细胞大小的测量1.掌握血涂片的制备方法实验学时实验学时3 3实验目的实验目的2.认识红细胞及各种白细胞的典型形态3掌握显微测微尺的使用方法将血液样品制成单层细胞的涂片标本，经瑞氏染液染色后，不同白细胞中的颗粒可以呈现不同的颜色。碱性粒细胞的颗粒呈蓝紫色，酸性粒细胞的颗粒呈橘实验原理实验原理红色，中性粒细胞的颗粒呈粉红色。根据细胞中颗粒的颜色、大小及多少，再结合细胞的大小及细胞核的形态，就可以将白细胞进行分类计数。显微镜、粗天平、载玻片、滴管、离心管、离心机、医用一次性采血针、酒精棉球、镊子、载玻片、目镜测微尺和镜台测微尺等鸡血细胞实验仪器实验仪器实验材料实验材料实验内容与实施过程实验内容与实施过程备备 注注1.1.血涂片的制备与血细胞的观察血涂片的制备与血细胞的观察（5050 分钟）分钟）:腹采血推片：挤出第二滴血置于载玻片的右侧再取另一张边缘光滑的双凹片，斜置于血滴的前缘，先向后稍移动轻轻触及血滴，使血液沿玻片端展开成线状两玻片的角度以 3045为宜，轻轻将双凹片向前匀速推进，即涂成血液薄膜采血前用 70酒精棉球消毒人的指染色：用天平称取去皮的土豆块茎2g+10mlPBS 缓冲液，浸泡 2h粗提液中含有可溶性土豆凝集素。2.2.显微测微尺的使用（显微测微尺的使用（3535 分钟）分钟）：以无菌方法抽取鸡血注射器中抽取3.8%柠檬酸钠1ml 抽取鸡静脉血液 2ml，用生理盐水洗 5 次，每次 2000r/min，离心 5min，最后按压积红细胞体积用生理盐水配成2%红细胞液。3.3.细胞的观察与讨论（细胞的观察与讨论（5050 分钟）分钟）：淋巴细胞、白细胞、中性粒细胞、碱性粒细胞和酸性粒细胞4 4、实验小结（、实验小结（1515 分钟）分钟）：总结实验过程中学生的操作是否规范；实验是否成功，如果不成功，问题出在哪里；哪些实验作得比较好。提醒预习下节课实验内容，提问。共共 150150 分钟。分钟。实验作业实验作业1.绘制各种不同类型的血细胞,并说明它们的主要作用？2.任选 20 个红细胞，测量其直径，并计算出平均值.。参考资料参考资料（含参考文献、（含参考文献、期刊、杂志等）期刊、杂志等）对于涂片的厚度一定要掌握，不然太厚不方便观察细胞，对于各种白细胞的染色一定要把握好，适度的染色可容易的区分开五实验总结实验总结种白细胞，并进行大小的测量和绘图。细细 胞胞 生生 物物 学学 实验课程教案（实验课程教案（2 2）实验题目实验题目细胞化学实验细胞化学实验熟悉细胞脂类的显示技术，了解其在细胞中的分布；学习区别定位细胞DNA、实验学时实验学时3 3实验目的实验目的RNA 的显示方法（1）苏木精为碱性染料染细胞核，苏丹红为偶氮脂溶性染料，可显示细胞中的脂类的分布及量；（2）甲基绿与 DNA 双螺旋外侧的磷酸根基团结合力强，结合后阻止派洛宁从碱基之间插入。甲基绿与 DNA 的结合产物为绿色。派洛宁与 RNA 的结合力强，实验原理实验原理RNA 结构较松散，派洛宁可以插入，从而中和磷酸基团，阻止甲基绿染色，派洛宁与 RNA 的结合物呈红色，根据颜色的部位可以判断 DNA 和 RNA 的定位并且判断两种核酸的相对含量。实验仪器实验仪器水浴锅、冰冻切片机、载玻片等；猪肝、花生子叶实验材料实验材料实验内容与实施过程实验内容与实施过程备备 注注凝集素是一类含糖、并能与糖专一结合的蛋白质,被1.脂类显示（脂类显示（6565 分钟）分钟）：用猪肝切片和花生的超薄切片，学习掌握使用冰冻切片机的操作技术，获得理想的切片；2.细胞中细胞中 DNADNA 和和 RNARNA 的显示（的显示（7070 分钟）分钟）：材料选用猪肝印片，学习如何制备肝印片的片子，而后进行固定、浸洗、染色等即可显示二者在细胞中的分布。3 3、实验小结（、实验小结（1515 分钟）分钟）：总结实验过程中学生的操作是否规范；实验是否成功，如认为与糖的运输、储存物质的积累、细胞间的互作以及细胞分裂关。果不成功，问题出在哪里；哪些实验作得比较好。提醒预习下节课实验内容，提问。的调控有共共 150150 分钟。分钟。实验作业实验作业参考资料参考资料（含参考文献、（含参考文献、期刊、杂志等）期刊、杂志等）细胞中脂类和核酸显示的原理是什么？实验总结实验总结植物材料两种化学成分的显示结果都比较好，但是猪肝的效果较差，这可能与切片的厚度有很大的关系，猪肝组织柔软不像花生子叶好切。细细 胞胞 生生 物物 学学 实验课程教案（实验课程教案（3 3）实验题目实验题目细细 胞胞 凝凝 集集 反反 应应1.学习制备土豆凝集素实验学时实验学时3 3实验目的实验目的2.掌握细胞凝集反应的实验方法及细胞凝聚的原理。3.观察凝集的现象细胞质膜外表面的一层黏性多糖物质构成的细胞全委会被在细胞间的联系和识别、细胞的生长分化、免疫反应及肿瘤发生等过程中发挥着重要作用。动物细胞表面的糖蛋白、糖脂中的糖链伸向膜表面，它们是细胞识别、细胞免疫及细胞接触抑制现象的必要组分。实验原理实验原理凝集素是一类含糖的(少数例外)并能与糖专一性结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。凝集使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接，在细胞间形成“桥”的结果。凝集素与糖分子结合有一定的专一性和结合价，并与细胞膜上受体的分布有关。显微镜、粗天平、载玻片、滴管、离心管、离心机等实验仪器实验仪器实验材料实验材料土豆块茎、鸡血细胞实验内容与实施过程实验内容与实施过程备备 注注凝集1.1.凝集素粗提液制备（凝集素粗提液制备（5050 分钟）分钟）：用天平称取去皮的土豆块茎2g+10mlPBS 缓冲液，素是一类含糖、并浸泡 2h粗提液中含有可溶性土豆凝集素。能与糖专2.2.鸡红细胞悬液制备（鸡红细胞悬液制备（3535 分钟）分钟）：以无菌方法抽取鸡血注射器中抽取3.8%柠檬酸钠一结合的1ml 抽取鸡静脉血液 2ml，用生理盐水洗 5 次，每次 2000r/min，离心 5min，最后按压积红细胞体积用生理盐水配成2%红细胞液。3.3.细胞凝集反应现象的观察与讨论（细胞凝集反应现象的观察与讨论（5050 分钟）分钟）：用滴管吸取土豆凝集素和2%红细胞液各一滴，置载玻片上，充分混匀，静置20min 后于低倍显微镜下观察血球凝集现象。本实验过程很简单，只需要将植物凝集素与红细胞混合后用低倍显微镜观察现象即可。具体如下：实验组对照组凝集素 1 滴PBS 液 1 滴红细胞悬液 1 滴红细胞悬液 1 滴蛋白质,被认为与糖的运输、储存物质的积累、细胞间的互作以及细胞分裂的调控有关。果不成功，问题出在哪里；哪些实验作得比较好。提醒预习下节课实验内容，提问。共共 150150 分钟。分钟。4 4、实验小结（、实验小结（1515 分钟）分钟）：总结实验过程中学生的操作是否规范；实验是否成功，如实验作业实验作业参考资料参考资料（含参考文献、（含参考文献、期刊、杂志等）期刊、杂志等）1.细胞间凝集的原理是什么？2.简图表示血细胞凝集原理。1.为什么对照组有 PBS 液作对照呢？没什么巧，因为凝集素中本身含PBS 缓冲实验总结实验总结液，当含本身凝集素是不含PBS 的，只是因为本实验中凝集素的提取时用到了PBS.2.那么红细胞悬液是怎么制备的呢？其实也不难，无菌抽取动物静脉血液，当然血液抽出来后肯定要先加抗凝剂了，然后再加生理盐水。那么怎么从血液中将红细胞分离出来呢？想想，血液中有血清、红细胞、白细胞和血小板，按道理来讲红细胞应该最重吧(有待查证)，用离心机在2000r/min 下离心 5min，去掉上清液，得到的应该就是红细胞了，再加适量生理盐水洗涤几次后，加一定量是(按压积红细胞体积算)生理盐水即可配成相应浓度的红细胞悬液了。除了土豆中有凝集素外，还有韭菜叶片也有。凝集素使细胞凝集是因为它与细胞表面的糖分子连接,在细胞间形成“桥”的结果,加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞发生凝集。大多数凝集素存在于储藏器官中,作为一种氮源；对某些植物而言,受到危害时,凝集素作为一种防御蛋白发挥作用。细细 胞胞 生生 物物 学学 实验课程教案（实验课程教案（4 4）实验题目实验题目实验目的实验目的细胞膜的渗透性细胞膜的渗透性了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。实验学时实验学时3 3细胞膜为一种半透膜，对物质的通透具有选择性。当红细胞放入低渗溶液中时，细胞吸水膨胀而发生溶血。当红细胞放入含不同溶质的等渗溶液中时，由于细胞实验原理实验原理膜对不同溶质的透性不同，细胞发生溶血的时间也会不同，故发生溶血现象时间长短可作为测量物质进入红细胞速度的一种指标。实验仪器实验仪器实验材料实验材料离心机、移液枪、试管、试管架鸡血实验内容与实施过程实验内容与实施过程备备 注注明的红色液体，此即稀释的鸡血。2.2.低渗溶液：低渗溶液：一支试管中，加入 10ml 蒸馏水+1ml 稀释的鸡血，观察溶液颜色的变化？3.3.鸡红细胞的渗透性观察：鸡红细胞的渗透性观察：在 10 种等渗溶液中观察细胞溶血现象及时间。1.1.鸡血细胞悬液的制备：鸡血细胞悬液的制备：一份鸡血+10 份 0.17mol/L 氯化钠，形成一种不透将观察到的现象列入下表，对实验结果进行比较和分析。附表：不同低渗溶液下的溶血现象。试管编号是 否 溶血时间结果分析1.10ml 氯化钠+1ml 稀释羊血2.10ml 氯化铵+1ml 稀释羊血3.10ml 醋酸铵+1ml 稀释羊实验作业实验作业血4.10ml 硝酸钠+1ml 稀释羊血5.10ml 草酸铵+1ml 稀释羊血6.10ml 硫酸钠+1ml 稀释羊血7.10ml 葡萄糖+1ml 稀释羊血8.10ml 甘油+1ml 稀释羊血9.10ml 乙醇+1ml 稀释羊血10.10ml丙酮+1ml稀释羊血参考资料参考资料（含参考文献、（含参考文献、期刊、杂志等）期刊、杂志等）溶血时间及现象的观察比较困难，可采用离心辅助的方法来判别鸡血在哪些等渗液中最易溶血，哪些较慢，做一些定性的分析。经过离心之后，实验总结实验总结若上清液无色，证明在这个时间段血细胞没发生溶血，若上清液略红，证明有溶血发生。当然这个方法不很精确，但却快速、便于观察。细细 胞胞 生生 物物 学学 实验课程教案（实验课程教案（5 5）实验题目实验题目线粒体和液泡系的超活染色与观察线粒体和液泡系的超活染色与观察实验学时实验学时3 3 观察动、植物活细胞内线粒体和液泡系的形态、数量及分布；实验目的实验目的 掌握细胞超活染色技术及原理；学习一些细胞器的超活染色技术。活体染色：活体染色：应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些细胞结构而又很少影响细胞生命活动的染色方法。詹纳斯绿詹纳斯绿 B B：詹纳斯绿 B 能专一的对线粒体进行活体染色。线粒体中细胞色素实验原理实验原理氧化酶使染料保持氧化状态，即有色状态，呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态中性红：中性红：中性红对高尔基体、液泡系的染色具有专一性。只将活细胞中的液泡系当成红色，细胞核与细胞质完全不着色(这可能与液泡系中某些蛋白质有关。显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、镊子、双面刀片、解剖盘载玻片、凹面实验仪器实验仪器载玻片、盖玻片、表面皿、吸管、牙签、吸水纸。实验材料实验材料人口腔上皮细胞、洋葱、小麦种子或黄豆幼根根尖实验内容与实施过程实验内容与实施过程备备 注注1.1.人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察清洁载玻片放在 37恒温水浴锅的金属板上滴 2 滴 1/5000 詹纳斯绿 B 染液用牙签口腔颊粘膜处稍用力刮取上皮细胞刮下的粘液状物放大载玻片的染液滴中染色 10-l5min(注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液)盖上盖玻片,显微镜下观察2.2.植物细胞液泡系的超活染色与观察植物细胞液泡系的超活染色与观察取小麦种子发芽的根尖用刀片纵切根尖放入中性红染液滴中，染色 510min。吸去染液，滴一滴 Ringer 液盖上盖玻片进行镜检(镊子轻轻地下压盖玻片，使根尖压扁，利于观察)实验结果：实验结果：在高倍镜下，先观察根尖部分的生长点的细胞，可见细胞质中散在很多大小不等的染成玫瑰红色的圆形小泡，这是初生的幼小液泡。然后，由生长点向延长区观察，在一些已分化长大的细胞内，液泡的染色较浅，体积增大，数目变少。在成熟区细胞中，一般只有一个淡红色的巨大液泡，占据细胞的绝大部分，将细胞核挤到细胞一侧贴近细胞壁处。（1）绘口腔上皮细胞示线粒体的形态与分布实验作业实验作业（2）绘小麦根尖细胞示液泡的形态与分布参考资料参考资料（含参考文献、（含参考文献、期刊、杂志等）期刊、杂志等）人口腔上皮细胞的线粒体的超活染色与观察效果很好，但是洋葱人口腔上皮细胞的线粒体的超活染色与观察效果很好，但是洋葱表皮细胞和小麦根尖细胞的染色效果不是很理想。表皮细胞和小麦根尖细胞的染色效果不是很理想。实验总结实验总结细细 胞胞 生生 物物 学学 实验课程教案（实验课程教案（6 6）实验题目实验题目实验目的实验目的叶绿体的分离与荧光观察叶绿体的分离与荧光观察实验学时实验学时3 31.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法；2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗实验原理实验原理粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。实验仪器实验仪器烧杯 2 个,250ml 量筒 1 个,滴管 20 支,10ml 刻度离心管 20 支,试管架 5 个，纱布若干，无荧光载片和盖片各4 片。实验试剂实验试剂实验材料实验材料0.35mol/L 氯化钠溶液，0.01%吖啶橙(acridine orange)。新鲜菠菜实验内容与实施过程实验内容与实施过程备备 注注1.选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称 30g于150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。2.利用组织捣碎机低速(5000r/min)匀桨 3-5min。3.将匀浆用 6 层纱布过滤于 500ml 烧杯中。4.取滤液 4ml 在 1000r/min 下离心 2min，弃去沉淀。5.将上清液在 3000r/min 下离心 5min。弃去上清液，沉淀即是叶绿体(混有部分细胞核)。6.将沉淀用 0.35mol/LNaCl 溶液悬浮。7.取叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖玻片后即可在显微镜下观察。在普通光镜下观察。在荧光显微镜下观察。取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再滴加一滴0.01%丫啶橙荧光染料，在荧光显微镜下观察。（一）叶绿体的分离与观察（一）叶绿体的分离与观察（二）实验结果：（二）实验结果：普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。在选用 B（blue）激发滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光。加入丫啶橙后，叶绿体可发出橘红色荧光，其中混有的细胞核则发绿色荧光。1.在倒置显微镜相连的电脑软件支配下，测量一下叶绿体的长轴和短轴，分实验作业实验作业别测量 510 个叶绿体，求其平均值。2.在分离叶绿体时应注意些什么问题？参考资料参考资料（含参考文献、（含参考文献、期刊、杂志等）期刊、杂志等）实验结果非常理想，提醒学生们在使用荧光显微镜时应注意保护实验总结实验总结眼睛，避免紫外线的伤害。细细 胞胞 生生 物物 学学 实验课程教案（实验课程教案（7 7）实验题目实验题目细胞器的分离与观察细胞器的分离与观察实验学时实验学时3 31.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法；实验目的实验目的2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。细胞由细胞膜、细胞核和细胞质组成，细胞质中含有若干细胞器和细胞骨架等，这些也称作亚细胞组分。对于细胞的结构和功能的研究，是细胞生物学的基本课题，其重要的研究手段之一是分离纯的亚细胞组分，观察它们的结构或进行生化分析。分离亚细胞组分的方法主要有差速离心和密度梯度离心。差速离心（differential centrifugation）在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白实验原理实验原理体。由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，而且某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中，一般重复23 次效果会好一些。差速离心只用于分离密度和大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。对于精细的分离，则是密度梯度离心效果更好。密度梯度离心（density gradient centrifugation）用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。烧杯 2 个,250ml 量筒 1 个,滴管 20 支,10ml 刻度离心管 20 支,试管架 5 个，纱布实验仪器实验仪器若干，无荧光载片和盖片各4 片。0.35mol/L 氯化钠溶液实验试剂实验试剂新鲜菠菜实验材料实验材料实验内容与实施过程实验内容与实施过程（一）叶绿体的分离与观察（一）叶绿体的分离与观察备备 注注1.选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称 30g于150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。2.利用组织捣碎机低速(5000r/min)匀桨 3-5min。3.将匀浆用 6 层纱布过滤于 500ml 烧杯中。4.取滤液 4ml 在 1000r/min 下离心 2min，弃去沉淀。5.将上清液在 3000r/min 下离心 5min。弃去上清液，沉淀即是叶绿体(混有部分细胞核)。6.将沉淀用 0.35mol/LNaCl 溶液悬浮。7.取叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖玻片后即可在显微镜下观察。在普通光镜下观察。在荧光显微镜下观察。取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再滴加一滴0.01%丫啶橙荧光染料，在荧光显微镜下观察。（二）实验结果：（二）实验结果：普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。在选用 B（blue）激发滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光。加入丫啶橙后，叶绿体可发出橘红色荧光，其中混有的细胞核则发绿色荧光。1.在倒置显微镜相连的电脑软件支配下，测量一下叶绿体的长轴和短轴，分实验作业实验作业别测量 510 个叶绿体，求其平均值。2.在分离叶绿体时应注意些什么问题？参考资料参考资料（含参考文献、（含参考文献、期刊、杂志等）期刊、杂志等）实验结果非常理想，提醒学生们在使用荧光显微镜时应注意保护实验结果非常理想，提醒学生们在使用荧光显微镜时应注意保护实验总结实验总结眼睛，避免紫外线的伤害。眼睛，避免紫外线的伤害。细细 胞胞 生生 物物 学学 实验课程教案（实验课程教案（7 7）实验题目实验题目植物原生质体的分离与培养植物原生质体的分离与培养实验学时实验学时6 6原生质体是除去细胞壁的裸露细胞。在适宜的条件下，分离的原生质体能够实验目的实验目的再生细胞壁，进行细胞分裂，并再生完整植株。通过实验，掌握原生质体分离和培养的基本方法，并对培养结果进行观察和分析。植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁而使原生质体释放出来。实验原理实验原理原生质体分离纯化或融合后，在适当的培养基上应用合适的培养方法，能够再生细胞壁，并启动细胞持续分裂，直至形成细胞团，长成愈伤组织或胚状体，再分化发育成苗。其中，选择合适的培养基及培养方法是原生质体培养中最基础也是最关键的环节。三角瓶、离心管、烧杯、200 目不锈钢滤网、解剖刀、长、短镊子、培养皿、滤纸、实验仪器实验仪器0.2m 滤膜、滤器、培养瓶（注：以上用品要进行高压灭菌）、台式离心机、高压灭菌锅、倒置显微镜、超静工作台烟草幼苗的叶片、新鲜菠菜的叶烟草幼苗的叶片、新鲜菠菜的叶实验材料实验材料实验内容与实施过程实验内容与实施过程备备 注注1 1、实验原理的讲解；、实验原理的讲解；（15 分钟）2 2、液体培养基的配制；、液体培养基的配制；（实验前由教师完成）3 3、酶液的制备：、酶液的制备：（20 分钟）教 学 重点、难点重点：无菌操作；1纤维素酶、1果胶酶、0.6mol/L 甘露醇、0.1%MES、0.05mol/LCaCl22H2O、原生质pH6.87.0体的分离3 3、植物原生质体的分离和培养：（、植物原生质体的分离和培养：（课内完成，150 分钟）取充分展开的嫩叶，用自来水冲洗干净；将叶片在 0.1%升汞溶液中浸泡灭菌 10min，然后用无菌蒸馏水漂洗5 次；用镊子撕去叶的下表皮，然后将叶放有酶液的培养皿或带盖三角瓶，每 10ml 酶液放 2g 叶片；在 2528黑暗条件下，酶解23h,用 200 目网过滤除去未完全消化的残渣。在 1000rpm 条件下离心 5 分钟，弃上清。加入 3 4ml 0.2mol/LCaCl22H2O 洗液，用注射器向离心管底部缓缓注入20蔗糖溶液 6ml，在 1000rpm 条件下离心 510 分和培养。难点：酶解去壁，原生质体培养方法的选择钟，由于密度梯度离心的作用，生活力强状态好的原生质体漂浮在20的蔗糖与 0.2mol/LCaCl22H2O 之间，破碎的细胞残渣沉入管底。用 200l 移液器轻轻将状态好的原生质体吸出(注意尽可能不要吸入下层的蔗糖溶液)，放入另一干净的离心管中加4ml 0.2mol/LCaCl22H2O 悬浮，1000rpm 离心 25 分钟，弃上清将收集的原生质体悬浮在适量的DPD 培养基中，用血球计数板调整原生质体密度4为 510/ml（请参考细胞计数请参考细胞计数）之间。用带皮头的移液管将原生质体悬液分装在培养皿中，每皿放5ml。用石蜡膜带封口。置 26左右条件下进行暗培养。4 4、培养结果的观察（、培养结果的观察（活力检查，细胞壁再生的观察，细胞分裂的观察）。（在课外由教师指导学生进行）5 5、实验小结：、实验小结：总结实验过程中学生的操作是否规范。提醒预习下节课实验内容，提问。（10 分钟）共 195 分钟实验内容与实施过程实验内容与实施过程实验的意义：实验的意义：植物原生质体融合和培养在理论和实践上都有很大的意义，在植物遗传工程和育种研究上具有广阔的应用前景。它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，它不仅能克服远缘杂交有性不亲和障碍，也可克眼传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的麻烦，最终将野生种的远缘基因导入栽培种中，原生质体融合技术可望成为作物改良的有力工具之一。植物原生质体培养方法起源于植物单细胞的培养方法。1954 年，植物单细胞培养才获得成功。Mllir 培养的万寿菊及烟草悬浮细胞植入到长有愈伤组织的培养基上得到了它们的单细胞克隆，并建立了看护培养的方法；1960 年 Jones 等建立了微室培养法。同年，Cocking 应用酶法分离原生质获得成功，从而在实验条件下很容易获得大量的原生质体。随着多种适用于原生质体分离的商品酶的出现，原生质体的培养方法也得到了不断地改进，现在常用的原生质体培养方法有：液体浅层培养法、双层培养法、琼脂糖包埋法、琼脂岛培养法以及使用条件培养基或饲喂培养等。备备 注注1 酶解液及原生质体起始培养基中，为何要保持较高渗透压？实验作业实验作业参考资料参考资料（含参考文献、（含参考文献、期刊、杂志等）期刊、杂志等）2.如何判断分离原生质体的活力和新壁再生？将原生质体培养分化过程进行显微摄影，并分析结果。以植物根、茎、叶、叶柄作为原生质体的分离材料,经过分离收集在一定条件下才能培实验总结实验总结养获得完整的原生质体,原生质体培养基的渗透压应与酶液的渗透压相等.细细 胞胞 生生 物物 学学 实验课程教案（实验课程教案（8 8）实验题目实验题目动物血细胞的电融合技术动物血细胞的电融合技术实验学时实验学时3 3动物的游离细胞以及植物成微生物去壁后的原生质体，在电刺激下进行细胞融合，且融合率高、无毒性，操作简便及融合后的细胞继续培养成活率高等优点，实验目的实验目的是细胞工程手段的又一进展。本实验使学生在了解电融合原理的基础上，学会掌握各种细胞悬液的制备及电融合过程的操作。制备的游离细胞或原生质体，置于电融合室中，在高频交流电场的作用下，细胞被极化，成为偶极子，造成细胞之间相互连接，如果施加的高频交流电压(即正弦波的 p-p 值)过高或作用时间过长，则细胞连接成串珠状，应适当控制以上条件，尽量使两细胞处于点接触状态，然后施加方波脉冲予以刺激，由于电脉冲的实验原理实验原理瞬间作用，可击破两细胞接触点部位的质膜，此时质膜的脂类分子发生重组，同时由于细胞表面的张力作用，使两细胞融合逐步完全。动物的游离细胞在电刺激下可进行细胞融合，且具有融合率高、无毒性、操作简便及融合后的细胞继续培养成活率高等特点，是细胞工程手段的又一进展。CRY-3型细胞融合仪、细胞融合池、倒置显微镜、实验仪器实验仪器刻度离心管、移液枪、血细胞计数板、实验材料实验材料鸡 的 红 细 胞实验内容与实施过程实验内容与实施过程备备 注注电融合发展于 20 世（一）动物血细胞的制备（一）动物血细胞的制备纪 80 年1.用灭菌的注射器先吸入Alsver 液(葡萄糖 2.05g，枸椽酸钠 0.88，代，是使NaCl0.42g，加重蒸水至100mil）lml，再从鸡的翼下静脉取血0.5-1ml，取出后细胞在电放入刻度离心管中，再加入2-3ml Alsver液，使总量为4-5ml，混匀并封口，置场中成为于 4冰箱内可供一周内使用；偶极子，2.实验时取贮备的鸡血细胞lml，加入 4ml0.85生理盐水，混匀后以沿电力线1200r/min 离心 5min，去上清液后，最后用0.6mol/L 的甘露醇液(或 0.6mol/L排布成蔗糖溶液)混匀后以上述离心条件洗涤两次，最后用0.6mol/L 的甘露醇液将鸡细胞串，再利用高强稀释并调整成每毫升含 2105个。度、短时如采用传代培养的骨髓或腹水瘤细胞，可先用0.9的生理盐水洗涤两次，离心程的电脉速度为 800-1000r/min，每次 5min，再用 0.6mol/L 的甘露醇或蔗糖液洗涤两次，冲击破细5每次 600-800r/min，离心 5min，最后用甘露醇调整成每毫升含瘤细胞110胞膜，膜个。的脂类分子发生重（二）细胞电融合（二）细胞电融合排，由于1.介绍 CRY-3 型细胞融合仪的结构和使用方法；表面张力2.电融合操作：用移液管吸取0.1ml 调整好的血细胞悬液于融合小室中，将融作用，两合池置于倒置显微镜载物台上，并将两电极的输出端与仪器的输出电缆接通，然后用细胞发生低倍镜找出融合室中央两电极间的焦面，此时可观察到血细胞呈平均分布状态，互不融合。接触；开启电源，此时可根据实验需要，将正弦额度选择在11.3MHz，脉冲宽度为0.1ms，脉冲电压为250V，脉冲频率为1 次/s，并依次按下各标定按键，最后调整成串交流电压(即正弦幅度)旋扭，使电压表处于 10-15V 处，待细胞成串相接触后，按下脉冲触发按钮，此时电融合结束，关闭电源。实验结果：实验结果：(homokaryons)，利用不同亲本的不同细胞彼此融合所形成的细胞，称为异核体(heterokaryons)，还可观察到 3 个以上细胞融合在一起的合胞体。细胞融合率系指在显微镜的视野内，已发生融合的细胞其细胞核总数与该视野内所有细胞(包括已融合的细胞)的细胞核总数之比，称为融合率，通常以百分比表示，而且要进行多个视野测定，再加以平均统计，更为准确。在倒置显微镜下可观察到由同种细胞融合形成的细胞，称为同核体1.绘图表示所观察到的融合细胞。实验作业实验作业2.请写出细胞电融合的注意事项。参考资料参考资料（含参考文献、（含参考文献、期刊、杂志等）期刊、杂志等）思考题：思考题：1、说明细胞电融合的原理2、在细胞电融合中，设对细胞产生可逆性电击穿的总能量为Q，如何理解各项电参数之间及其与Q 值的关系?实验结果不是很理想，融合率低。原因可能有一下几点：动物细胞的膜结构比原生质体具有更大的电刺激耐受性，要造成细胞接触点处的膜击穿，需要适当加大各种电融合参数。此外还可在细胞悬液中加入链霉蛋白酶，可改变细胞膜结构，并增强膜活性。影响细胞电融合因素：影响细胞电融合因素：一、用于供原生质体或动物细胞悬浮的介质，必须满足两个条件：一是为了保持细胞的生物活性，使融合后的细胞能继续存活，并通过培养能继续分裂和分化，其介质要求与细胞本身具有等渗性；二是为了保证融合实验总结实验总结之前所施加的各项电参数充分发挥作用，其介质应具有高纯度的非离子溶液，如果在溶液中存在Na+、K+、Ca2+等金属离子或 Cl 离子，将使介质的导电性增加，当施加脉冲波刺激时，据报导，其总能量Q 将通过离子的传导作用损失 80以上，而直接通过细胞，用于击穿膜接触点使其细胞融合的能量仅占 1020%，当有离子存在并使电脉冲能量高度损失的情况下，将不能保证细胞进行融合。在介质中有金属离子存在，当施加高频正弦波电场时，不能将细胞极化成偶极子，从而不能使细胞间相互接触和连接，更谈不上细胞间相互融合。为了解决以上存在的问题，一是采用高纯度的蒸馏水(三蒸水或四蒸水)来配制介质，二是选用适当的非电介质溶质如甘露醇、山梨醉或蔗糖等来配制供细胞悬浮的等渗溶液，另外，在清洗电融合室时，以要以高纯度的蒸馏水用毛笔擦净。细细 胞胞 生生 物物 学学 实验课程教案（实验课程教案（9 9）实验题目实验题目利用利用 PEGPEG 为媒介物进行动物血细胞融合为媒介物进行动物血细胞融合实验学时实验学时3 3实验目的实验目的掌握利用聚乙二醇为介导物对各类细胞的融合方法聚乙二醇分子能改变各类细胞的腆结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生实验原理实验原理疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，使细胞发生融合。实验仪器实验仪器离心机、恒温水浴锅、电热套、倒置显微镜实验材料实验材料鸡 血 细 胞实验内容与实施过程实验内容与实施过程备备 注注一、溶液配制一、溶液配制1、Alsver 液(同前)2、0.85生理盐水液3，GKN 液NaC l8g、KCl0.4g、Na2lOP042H201.77g、NaH2P04H2O0.69g，葡萄糟 2g，酚红（phenolrad）0.01g，溶于 1000ml 重蒸水中。4、50PEG 液实验前临时配制，根据需要称取定量 PEG(Mw=4000)，放入刻度试管或刻度离心管内，在沸水浴中加热，使其熔化，如做细胞培养融合实验，可用高压蒸汽灭菌30min，待冷却至 50时，加入预热至 50等体积的 GKN 液，混匀。二、融合方法二、融合方法1、取制备的鸡红细胞(制备方法同实验六)悬液 lml，加入 4min0.85生理盐水，混匀后以1000-1200r/min 离心 5min，去上清液后再以上述条件离心洗涤两次(5min、10min)，如果采用各种瘤细胞，只将洗涤液改为0.9 的生理盐水，其它条件同上。2、将最后一次离心沉降的鸡虹细胞或有关瘤细胞（去上清液）加入 23mlGKN液，混匀后待用。3、取以上悬液，用血细胞计数法计数，再以 GKN 液将鸡红细胞稀释成每毫升含 2105个，瘤细胞每毫升含 1.5l05个。4、如做同种细胞间融合，可取有关细胞悬液 1ml,加入 50%的 PEG 液混匀，置于 30水浴内温育 lO-15min；5、用吸管或移液器吸取以上细胞悬液 0.1-0.2ml，滴在薄底小培养皿中，利用倒置显微镜进行观察。三、结果的观察与统计三、结果的观察与统计在倒置显微镜下可观察到由同种细胞融合形成的细胞，称为同核体(homokaryons)，利用不同亲本的不同细胞彼此融合所形成的细胞，称为异核体(heterokaryons)，还可观察到 3 个以上细胞融合在一起的合胞体。细胞融合率系指在显微镜的视野内，已发生融合的细胞其细胞核总数与该视野内所有细胞(包括已融合的细胞)的细胞核总数之比，称为融合率，通常以百分比表示，而且要进行多个视野测定，再加以平均统计，更为准确。1.计算融合率？2.如何改进该试验，来提高细胞的融合率？请查阅新近的文献。参考资料参考资料（含参考文献、（含参考文献、期刊、杂志等）期刊、杂志等）实验作业实验作业应用化学融合剂 PEG 进行细胞融合时，通常以 GXN 液作为稀释剂，一般使用浓度都在 50左右，对细胞的毒性作用较大，虽然在融合后马上进行洗涤，但融合后经过培养阶段，融合细胞的存活率仍然很低我们的实验证明，有条件如果在0.6mol/L 的甘露醇作溶剂，配制成6-8的PEG（Mw=000）作为细胞悬液，再按上述条件进行电融合实验，其融合速度和融合事与不加 PEG 相比都有提高实验总结实验总结PEG 有毒性，提醒学生在操作过程中一定要注意，避免沾上皮肤。