(2.11.2)--2.11.无菌操作PPT.pdf

植物组织培养技术 无菌操作 无菌操作需要从以下几个环节着手。接种室的灭菌 器皿器械灭菌 外植体灭菌 接种室的灭菌 植物组织培养的接种室（无菌操作室），是进行植物材料的灭菌、接种以及培养物的继代转移操作的场所。接种室要定期消毒。用甲醛和高锰酸钾产生的蒸气熏蒸，室内安装紫外光灯，在接种前开启紫外灯20min左右进行灭菌。室内还应保持无尘、清洁状态。进入接种室前，应在缓冲室或更衣室内更换工作服、鞋和帽等，避免把杂菌带入室内。器皿器械灭菌 1.干热灭菌 干热灭菌是将器械、用具长时间放在高温下消除杂菌的一种方法。其具体做法是将需要灭菌的器具，如玻璃器皿，金属器械，先用铝箔包好，放入温度为170的恒温干燥箱内，保温2h，冷却后取出便可以使用。2.高压蒸汽灭菌 高压蒸汽灭菌是将需灭菌的玻璃器皿、培养基等放入高压蒸汽灭菌锅内，通过高温、高压进行灭菌的一种方法。在无菌操作中使用的无菌水、无菌滤纸也需要通过高压湿热灭菌来制备。具体方法是：把蒸馏水盛入三角瓶中，装入量不超过2/3，封口；无菌滤纸是取数张滤纸，装入大小适宜的培养皿中，用牛皮纸或羊皮纸包裹，装入高压灭菌锅内进行灭菌。3.灼烧灭菌 接种器械如解剖刀、镊子等一般用火焰灼烧的方法灭菌，即把金属器械放在95%的工业酒精中浸蘸一下，然后在外火焰上灼烧灭菌。现多采用电热接种器械灭菌器进行接种工具灭菌，方便而且安全。外植体灭菌 1.外植体灭菌一般方法 在植物组织培养中，获得无菌外植体是组织培养成功的必要前提。取自于大田或温室的材料常带有大量的细菌和真菌，因此，通过化学药剂消除植物材料上的杂菌，是植物组织培养的一个重要环节。2.常用的灭菌药 对灭菌药剂的要求是灭菌效果好，从植物组织上容易清除，对人体无害，不污染环境。在常用的灭菌剂中，70%75的酒精是最常见的表面灭菌剂。酒精具有较强的穿透力和灭菌作用，对植物材料的杀伤作用也很大。在进行植物材料灭菌时，可将材料在70酒精中浸泡1030s，进行表面灭菌。然后，再将植物材料放到其它灭菌剂中进行彻底灭菌。植物组织培养中常用的灭菌剂 植物材料灭菌的一般过程 第一步 材料前处理 从田间或温室取回的材料，用自来水冲洗20min左右，洗去泥土等污垢，剪去残伤部分，再用自来水冲洗30分钟，然后剪成小段放入烧杯中。第二步 材料灭菌 在超净工作台上，把经过前处理的材料放入75酒精中，进行表面消毒，约10秒钟。取出后，立即放入有效氯浓度为2%的次氯酸钠溶液或其他灭菌剂中灭菌。数分钟后取出，放入无菌水中冲洗35次。然后，将材料放到无菌培养皿中，用无菌滤纸吸干水分，准备接种。交叉污染 如镊子夹了没有灭菌好的材料，再夹其它材料，造成的污染就是交叉污染。解剖刀、镊子碰到台面，瓶的外壁，封口纸膜，以及手拿的部位过近，未能充分灼烧等，或连续使用过久，都易引起交叉污染。经常灼烧接种工具便可防止交叉污染，即便有污染也是独立发生的，不会造成连续成片地污染。每切完一个材料，应更换一张无菌滤纸，用无菌滤纸吸干材料水分也有防止交叉污染的作用。接种好的材料要置于培养间进行培养，一般光照15003000Lx，每天1216h光照，温度23左右。植物组织培养中污染是经常发生的。造成污染的原因很多，如外植体带菌、培养基及器皿、器械灭菌不彻底、工作人员操作不规范等，都会造成污染。污染来源主要为细菌和真菌两大类：细菌污染的特点是菌落在接种13d即可发现，呈粘液状，而真菌污染的特点是污染部分长有不同颜色的霉菌，在接种3d甚至半个月后才出现。