(4.6.1)--4.6.甘薯脱毒步骤.pdf

甘薯脱毒步骤甘薯脱毒步骤 甘薯属于旋花科甘薯属，一种具有蔓生习性的多年生草本植物。一般认为起源于南美洲热带地区，属于短日照喜温作物。中国是世界上最大的甘薯生产国，在世界主要粮食作物产量中排名第 7 位，在我国仅次于水稻、小麦和玉米，居第 4 位。甘薯是无性繁殖作物，容易在体内积累病毒而引起品种退化。甘薯病毒病俗称甘薯花叶病、皱缩病、缩叶病等，是我国多数薯区常见的一种病害。甘薯病毒病在 1822时传播最快，靠蚜虫和甘薯粉虱等刺吸口器昆虫传播。带病株与无病株叶片接触摩擦也可以传播病毒。甘薯脱毒的方法是通过茎尖分生组织培养来进行的。下面，我们介绍一下甘薯茎尖分生组织培养脱毒的方法步骤。第一步：选种催芽，剪取壮苗。在决定进行对某个甘薯品种的组培脱毒后，需要提前一个半月左右，选取完全符合该品种特性的薯块，在光照培养箱里进行催芽。在种薯出芽后，观察所长出的茎叶是否健康，坚决弃掉不健康的甘薯薯块和长出的芽，一定选取粗壮健康的茎芽，进行后续作业。第二步：剥取茎尖，培养成苗。把上一步剪取下来的健壮茎芽，在超净工作台中，进行常规的外植体灭菌，并用无菌水冲洗。无菌条件下，使用体视显微镜，剥取出来茎尖分生组织，将含有 1-2 个叶原基，大小为 0.1-0.3mm 的茎尖分生组织切下，放到诱导培养基中进行培养，越 1 个半月或 2 个月，茎尖分生组织可以长大成苗。在本步中要注意两点。首先，剥取茎尖分生组织的大小要“越小越好”。尺寸大小等同于包含叶原基数量的多少，虽然剥取的茎尖分生组织尺寸小了，包含的叶原基少了，后期成苗机率会大大降低。但茎尖分生组织越小，包含的叶原基越少，携带病毒几率越低。其次，株系 的数量要“越多越好”。剥取的茎尖分生组织诱导长成的组培苗，每株都称为一个独立株系。他们中间有原种性好的，也有变异较大的；有病毒携带者，也有无病毒、洁净的植株。增加品系的数量，既是为了更好的确保种群遗传基因的完整性，也是为了降低病毒检测层层筛选后，试管苗“全军覆没”的可能性。第三步：切段繁育，扩增数量。在上步剥取的茎尖分生组织诱导成苗后，需要用一种快速的方法，成倍的扩增组培苗的数量，一般方法是把完整的组培苗植株，每两至三个茎节分切为一段，栽种至快繁培养基中，进行培养，然后再将长成的新植株。一般在首次移栽之前，要进行三至四次切段扩繁。第四步：分子检测，初筛病毒。收集各个株系的植物组织样本进行分子检测，即提取样本里的 DNA 或 RNA，采用 PCR或 RT-PCR 的方式，将病毒 DNA 扩增几百万倍，并采用凝胶电泳成像方式，将扩增出的病毒基因片段展现出来，这种方法，检测灵敏度好，精度高，病毒基本“无所遁形”。但因为这种方法步骤较多，成本较高，速度较慢，操作人员专业性要求强。在中华人民共和国农业行业标准NY/T 402-2016 脱毒甘薯种薯(苗)病毒检测技术规程中，甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)危害较为严重的病毒采用分子加血清方式检测，甘薯双生病毒(sweepoviruses)采用分子方式检测，其他四种病毒：甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)，甘薯褪绿斑病毒(SPCFV)，甘薯潜隐病毒(SPLV)，还有甘薯病毒 G(SPVG)则选择用操作更加简便的酶联免疫吸附法(ELISA)来进行检测。第五步：血清检测，再筛病毒。经过分子检测后，检测结果合格的株系，继续在切段扩繁的同时，收集植物组织样本，进行酶联免疫吸附法病毒检测，即常说的血清 ELISA 检测，主流的血清检测方法有双抗体夹心法(DAS-ELISA)和硝化纤维素膜法(NCM-ELISA)根据 NY/T 402-2016 标准里按规定需要检测的五种病毒：即甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）、甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）、甘薯褪绿斑病毒（SPCFV）、甘薯潜隐病毒（SPLV）、甘薯病毒 G(SPVG)进行酶联免疫吸附法病毒检测。酶联免疫吸附法对实验操作人员的经验性要求较强。第六步：移栽出瓶，育成壮苗。将经过分子、血清病毒检测，结果均为合格的株系从瓶里移出到组培苗驯化室中去，经过一段时间的繁育，繁育成健壮的植株。第七步：嫁接检测，终筛病毒。将组培苗育成健壮的驯化苗后，将采用指示植物嫁接法，最后一次病毒检测。指示植物选用巴西牵牛，用防虫条件下，盆栽的巴西牵牛为砧木，以待检测样品的茎蔓为接穗，进行嫁接检测。根据巴西牵牛是否表现花叶、叶片扭曲、明脉、黄化以及植株矮化等症状，判断检测样品是否带毒 这个方法的优点在于，几乎所有能够感染甘薯的病毒，均能感染巴西牵牛，并使其表现出病毒病症状。也就是说，采用指示植物嫁接法检测甘薯病毒病的种类更加全面。但因其检测灵敏度不如分子和血清检测，且受环境影响因素较多，结果的读取工作对经验性要求很强。通过最后这一关，检测结果合格的株系，才能把它标记为茎尖脱毒苗，到此为止，在实验室中进行的脱毒和检测环节结束，将把合格株系的驯化苗，送入下一个环节，进行原种性测试。第八步：小批栽种，测原种性。将确定脱毒的甘薯株系，每个株系取数十株驯化苗，同期栽入有隔离条件的设施中，进行原种性测试。经过层层筛选，仍需进行原种性测试的原因是，因为组培属于人工干预下的无性繁殖，这些人为产物会有一定几率的变异，而且变异几乎是无规律可循的。所以小批量的栽种，观察判断各个株系地上与地下部的表现是否都基本符合待测试品种应有的表现。如果某个或者某几个株系的表现不符合该品种的特性，就必须淘汰。最后，各个组培品种中“优中选优”的若干株系，在做完种性鉴定后的次年，在具有隔离条件的繁种大田中，进行种苗生产。