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基因工程常用的工具酶基因工程常用的工具酶第1页，本讲稿共34页 限制性核酸内切酶：限制性核酸内切酶：简称限制酶简称限制酶。是一类能识别双链。是一类能识别双链DNA分子分子中某种特定的核苷酸序列，并由此切割中某种特定的核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶双链结构的核酸内切酶 20世纪世纪50年代发现：年代发现：噬菌体噬菌体 E.coli B PFU10-4 E.coli B PFU1噬菌体噬菌体DNA被降解DNA被修饰E.coli B限制性核酸内切酶：降解外来DNA 防御修饰酶：DNA甲基化 保护寄主细胞控制的限制与修饰系统（寄主细胞控制的限制与修饰系统（R/M体系）！体系）！第2页，本讲稿共34页一、限制酶的种类一、限制酶的种类限制修饰活性限制修饰活性酶蛋白结构酶蛋白结构相对分子质量相对分子质量切割位点切割位点切割作用辅助因子切割作用辅助因子实用性实用性代表代表型酶型酶 型酶型酶 型酶型酶同时存在同时存在 单独存在单独存在 同时存在同时存在多亚基结构多亚基结构 单亚基结构单亚基结构 两个亚基两个亚基 30万万dal 2-10万万dal 、之间之间 与识别位点不一致与识别位点不一致 与识别位点一致与识别位点一致 与识别位点不一致与识别位点不一致 Mg2+、ATP、SAM Mg2+Mg2+、SAM 低低 高高 低低 EcoK、EcoB Hind EcoP第3页，本讲稿共34页二、限制酶的命名二、限制酶的命名命名原则命名原则限制酶寄主微生物属名头字母（大写）和种名前两字母（小写）表限制酶寄主微生物属名头字母（大写）和种名前两字母（小写）表示寄主物种示寄主物种菌株名位于其后菌株名位于其后 罗马数字表示同一寄主菌株的不同限制修饰系统罗马数字表示同一寄主菌株的不同限制修饰系统 Haemophilus influenzae d Hind、Hind、Hind 属名 种名 株名 不同限制修饰系统 第4页，本讲稿共34页三、三、型限制酶的特性型限制酶的特性-识别序列识别序列识别双链识别双链DNA分子中特定的分子中特定的4-8对核苷酸序列对核苷酸序列5 G C T G A A T T C G A G 33 C G A C T T A A G C T C 5EcoR I的识别序列EcoR I的切割位点5 G A G G C C G A G 33 C T C C G G C T C 5Hae的识别序列的识别序列Hae 的切割位点的切割位点第5页，本讲稿共34页大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧部分限制酶能识别多种核苷酸序列部分限制酶能识别多种核苷酸序列5 G C G T Py Pu A C G A G 33 C G C A Pu Py T G C T C 5Hind的识别序列的识别序列Py dCMP、dTMPPu dAMP、dGMP第6页，本讲稿共34页识别序列呈典型的旋转对称型识别序列呈典型的旋转对称型回文结构回文结构5 G C T G A A T T C G A G 33 C G A C T T A A G C T C 5EcoR I的识别序列EcoR I的切割位点回文结构回文结构:两条核苷酸链的核酸序列呈双重旋转对称排列的两条核苷酸链的核酸序列呈双重旋转对称排列的 DNA双螺旋结构双螺旋结构第7页，本讲稿共34页三、三、型限制酶的特性型限制酶的特性-切割后形成的末端切割后形成的末端粘性末端：粘性末端：5 GTGAATTCGA 33 CACTTAAGCT 5EcoR I5 GTG AATTCGA 33 CACTTAA GCT 5平齐末端：平齐末端：5 GAGGCCGAG 33 CTCCGGCTC 55 GAGG CCGAG 33 CTCC GGCTC 5Hae彼此具有互补核苷酸的单链延伸末端彼此具有互补核苷酸的单链延伸末端第8页，本讲稿共34页三、三、型限制酶的特性型限制酶的特性-同尾酶、同裂酶同尾酶、同裂酶同尾酶同尾酶:来源各异、识别序列也不相同，但都产生相同粘性来源各异、识别序列也不相同，但都产生相同粘性 末端的末端的一类限制酶一类限制酶5 GTGGATCCGA 33 CACCTAGGCT 5BamH I5 GTG GATCCGA 33 CACCTAG GCT 55 GTTGATCAGA 33 CAACTAGTCT 5 Bcl I5 GTT GATCAGA 33 CAACTAG TCT 5BamHIBamHI、BclIBclI为一组同尾酶为一组同尾酶第9页，本讲稿共34页同裂酶同裂酶:来源各异，但识别相同核酸序列的一类酶来源各异，但识别相同核酸序列的一类酶5 GTGATCGA 33 CACTAGCT 5Sau3A I5 GAGATCCA 33 CTCTAGGT 5MboI5 GTCCCGGGGA 33 CAGGGCCCCT 5XmaI5 GTCCCGGGGA 33 CAGGGCCCCT 5SmaI第10页，本讲稿共34页四、影响限制酶活性的因素四、影响限制酶活性的因素DNA的纯度：的纯度：蛋白质、苯酚、氯仿、EDTA、SDS增加限制酶用量扩大酶催化反应体系延长酶催化时间DNA的甲基化程度：反应温度：DNA的分子结构：酶缓冲液组成：甘油浓度：MgCl2：NaCl/KCl：Tris-HCl：-巯基乙醇巯基乙醇/二硫苏糖醇（二硫苏糖醇（DTT）：）：牛血清白蛋白（牛血清白蛋白（BSA）：第11页，本讲稿共34页第二节第二节 DNADNA连接酶连接酶第12页，本讲稿共34页 DNA连接酶：能够催化双链连接酶：能够催化双链DNA片段相邻的片段相邻的3羟基与羟基与5磷酸基磷酸基形成磷酸二酯键的酶形成磷酸二酯键的酶作用特点作用特点只能连接双螺旋只能连接双螺旋DNA分子，不能连接单链分子，不能连接单链DNA分子；分子；DNA链上必须具有游离的链上必须具有游离的3-OH和和5-P；只能封闭只能封闭DNA链上磷酸二酯键切口，不能封闭多个核酸分子缺失形成链上磷酸二酯键切口，不能封闭多个核酸分子缺失形成 的裂口；的裂口；需要吸能：需要吸能：ATP/NAD+连接方式连接方式缺口缺口DNA:平齐末端平齐末端DNA：粘性末端粘性末端DNA：5533OH P5533OH PPOH5533第13页，本讲稿共34页基因工程中常用的连接酶基因工程中常用的连接酶T4噬菌体噬菌体DNA连接酶连接酶（T4连接酶）连接酶）大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶连接酶热稳定性热稳定性DNA连接酶连接酶第14页，本讲稿共34页第三节第三节 DNADNA聚合酶聚合酶第15页，本讲稿共34页 DNA聚合酶：能够催化聚合酶：能够催化DNA复制和修复复制和修复DNA分子损伤的一类分子损伤的一类酶酶作用特点作用特点 能够把脱氧核苷酸分子连续的加到能够把脱氧核苷酸分子连续的加到DNA分子引物链分子引物链的的3-OH末端末端，催化核苷酸的聚合，催化核苷酸的聚合作用条件作用条件脱氧核苷酸原料：四种脱氧核苷三磷酸脱氧核苷酸原料：四种脱氧核苷三磷酸dNTP（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）引物链：带有引物链：带有3-OH游离基团游离基团模板：单链或双链模板：单链或双链DNA模板模板Mg2+：第16页，本讲稿共34页一、大肠杆菌一、大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 （DNA pol I）酶特性：酶特性：53聚合酶活性聚合酶活性53核酸外切酶活性核酸外切酶活性3 5核酸外切酶活性核酸外切酶活性3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 5dNTP Mg2+DNA pol I3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 55 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH5 C-G-A-G-T-OH第17页，本讲稿共34页切口平移反应切口平移反应（Nick translation）用途：用途：制备制备32P标记的标记的DNA探针探针53核酸外切酶活性核酸外切酶活性5 3核酸聚合酶活性核酸聚合酶活性5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 5 G-C-T-C A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 DNase IDNA pol IMg2+dNTP a-32P-dATP第18页，本讲稿共34页二、二、KlenowKlenow大片段酶大片段酶DNA聚合酶聚合酶一个片段：一个片段：53核酸外切酶活性核酸外切酶活性另一个片段：另一个片段：53聚合酶活性、聚合酶活性、3 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶Klenow大片段酶KlenowKlenow大片段酶特性：大片段酶特性：53聚合酶活性聚合酶活性 3 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性第19页，本讲稿共34页KlenowKlenow大片段酶大片段酶用途：用途：补平限制酶切割补平限制酶切割DNA后产生的粘性末端后产生的粘性末端5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5 KlenowdATP dTTP5 G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C 5 第20页，本讲稿共34页用用32PdNTP对对3凹端进行末端同位素标记凹端进行末端同位素标记5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5 Klenowa-32P-pppdA dTTP5 G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C 5 第21页，本讲稿共34页cDNA克隆中，合成克隆中，合成cDNA第二链第二链应用应用sanger双脱氧末端中止法进行双脱氧末端中止法进行DNA测序测序第22页，本讲稿共34页三、三、TagDNATagDNA聚合酶聚合酶来源来源嗜热水生栖热菌嗜热水生栖热菌酶特性酶特性53聚合酶活性、聚合酶活性、3 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性耐高温：耐高温：7580应用：应用：PCR技术（聚合酶链式反应）技术（聚合酶链式反应）第23页，本讲稿共34页PCRPCR技术技术基本原理：类似于细胞内基本原理：类似于细胞内DNA复制过程复制过程基本步骤基本步骤(c)(c)(b)(b)引物引物引物引物2 2553333335555(d)(d)新引物新引物新引物新引物5533靶靶靶靶DNADNA的扩增的扩增的扩增的扩增(a)(a)5533引物引物引物引物1 13 3 553355引物引物引物引物2 2互补链互补链互补链互补链引物引物引物引物1 1互补链互补链互补链互补链单位长度的链单位长度的链单位长度的链单位长度的链不同长度的链不同长度的链不同长度的链不同长度的链5 5 3 3 3355引物引物引物引物1 1互补链互补链互补链互补链引物引物引物引物2 2互补链互补链互补链互补链目的片段（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出）PCRPCRPCRPCR反应示意图反应示意图反应示意图反应示意图(e)(e)(f)(f)(g)(g)第24页，本讲稿共34页9494变性变性变性变性（1min1min）60 60 退火退火退火退火（1min1min）72 72 延伸延伸延伸延伸（1.5min1.5min）温度温度温度温度（）时间时间时间时间（minmin）949472726060循环循环循环循环1 1 循环循环循环循环2 2 循环循环循环循环3 3PCRPCRPCRPCR反应的温度循环周期反应的温度循环周期反应的温度循环周期反应的温度循环周期第25页，本讲稿共34页特点特点待扩增的待扩增的DNA链限定在模板上的退火位点之间链限定在模板上的退火位点之间待扩增待扩增DNA链得到迅速大量扩增链得到迅速大量扩增反应体系组成反应体系组成影响因素影响因素模板模板dNTPDNA聚合酶聚合酶引物引物A、BMgCl2引物的设计引物的设计退火温度退火温度MgCl2浓度浓度第26页，本讲稿共34页第四节第四节 DNADNA修饰酶修饰酶第27页，本讲稿共34页一、末端脱氧核苷酸转移酶一、末端脱氧核苷酸转移酶末端转移酶（末端转移酶（TDT）：在没有模板存在的条件下，能催化）：在没有模板存在的条件下，能催化 dNTP随机加于随机加于DNA分子的分子的3-OH端端5 p3 HOOH 3 p 5 TDTTDTMgMg2+2+dATPdATPAAAAAAAAAAAA OH 3 5 p3 HOp 5 同聚物尾巴同聚物尾巴 Poly（dA）第28页，本讲稿共34页作用底物：作用底物：带带3-OH末端的单链末端的单链DNA5 pOH 3 TDTTDTMgMg2+2+dATPdATPAAAAAAAAAAAA OH 3 5 p第29页，本讲稿共34页带带3-OH单链突出末端的双链单链突出末端的双链DNA5 p3 HOOH 3 p 5 TDTTDTMgMg2+2+dATPdATP5 p3HOAAAAAAAAAAAAAA OH3 p 5 带带3-OH平齐末端的双链平齐末端的双链DNA5 p3 HOOH 3 p 5 TDTTDTCoCo2+2+dATPdATP5 p3 HO AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA OH 3 p 5 第30页，本讲稿共34页用途：用途：外源外源DNA与载体的重组与载体的重组DNA片段片段3端标记端标记第31页，本讲稿共34页二、碱性磷酸酶二、碱性磷酸酶细菌碱性磷酸酶（细菌碱性磷酸酶（BAP）：来自）：来自E.coli小牛肠碱性磷酸酶（小牛肠碱性磷酸酶（CIP）：来自小牛肠）：来自小牛肠作用：作用：催化核酸分子脱去催化核酸分子脱去5-P5 pOH 3 DNA or RNA5 ppp dNTP5 pppNTPBAP/CIPBAP/CIPOH 3 5 HO5 HO dNTP5 HO NTP用途：用途：防止载体自身环化防止载体自身环化5端标记时去磷酸化端标记时去磷酸化第32页，本讲稿共34页三、三、T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）特性：催化特性：催化-P-P从从ATPATP分子转移给分子转移给DNA/RNADNA/RNA的的5-OH5-OH端端作用：作用：55端同位素标记端同位素标记5 HO3 HOOH 3 OH 5 T4-PNPT4-PNPMgMg2+2+p pppATPppATP（g g-3232P-ATPP-ATP）5 p3 HOOH 3 p 5 第33页，本讲稿共34页第34页，本讲稿共34页