细胞培养基及其添加物精品文稿.ppt

细胞培养基及其添加物第1页，本讲稿共14页uu细胞培养基的基本成分uu不同培养基之间的区别uu常用的几种培养基及其组成成分uu细胞培养基中的添加剂及其作用第2页，本讲稿共14页细胞培养基的基本成分 uu氨基酸氨基酸uu维生素维生素第3页，本讲稿共14页uu碳水化合物碳水化合物 uu无机盐无机盐第4页，本讲稿共14页缓冲系统缓冲系统uuHEPES uu(NaHCO3)与CO2体系进行缓冲第5页，本讲稿共14页常用培养基u1、RPMI-1640 MediumuRPMI是Roswell Park Memorial Institute的缩写，代指洛斯维.帕克纪念研究所。u2、Minimum Essential Medium(MEM)u也称最低必需培养基，它仅含有12种必需氨基酸、谷氨酰胺和8种维生素。成分简单，可广泛适应各种已建成细胞系和不同地方的哺乳动物细胞类型的培养。MEM-Alphau3、dulbeccos modified eagle medium(DMEM)u其特点主要包括以下：u（1）氨基酸含量为依格尔培养基的2倍，且含有非必需氨基酸，如甘氨酸等；u（2）维生素含量为依格尔培养基的4倍；u（3）含有糖酵解途径中的重要物质丙酮酸；u（4）含有微量的铁离子。第6页，本讲稿共14页第7页，本讲稿共14页第8页，本讲稿共14页5、DMEM/F12DMEM/F12培养基适于克隆密度的培养。F12培养基成分复杂，含有多种微量元素，和DMEM以1：1结合，称为DMEM/F12培养基(DME/F12medium)，作为开发无血清配方的基础，以利用F12含有较丰富的成分和DMEM含有较高浓度的营养成分为优点。该培养基适用于血清含量较低条件下哺乳动物细胞培养。为了增强该培养基的缓冲能力，改良之一是在DMEM/F12(1：1)中加入15mMHEPES缓冲液。6、McCoys 5A7、Iscoves Modified Dulbecco Medium(IMDM)Guilber 和Iscove将DulbeccoMedium 改良为 Iscoves Medium，此种培养液含有硒、额外的氨基酸和维生素、丙酮酸钠和HEPES。并用硝酸钾取代了硝酸铁。IMDM为营养非常丰富的培养液。8、M-199 Medium第9页，本讲稿共14页u9、Leibovitz Medium(L-15)uL-15培养液适用于快速增殖瘤细胞的培养，用于在CO2缺乏的情况下培养肿瘤细胞株。此培养液采用磷酸盐缓冲体系，氨基酸组成进一步改良，并由半乳糖替代了葡萄糖。u10、Hams F-10培养基：适应小鼠细胞、人类二倍体的培养。u11、Hams F-12培养基：可以在加入很少血清的情况下应用，特别适合单细胞培养和克隆化培养，是无血清培养中常用的基础培养液。第10页，本讲稿共14页细胞培养基中的添加剂及其作用 uu1.L-1.L-谷氨酰胺谷氨酰胺(L-Glutamine)(L-Glutamine)在细胞培养中重要吗在细胞培养中重要吗?它在溶液中不稳定吗它在溶液中不稳定吗?uu是细胞生长的必须氨基酸，为培养的细胞提供重要的能量来源。脱掉氨是细胞生长的必须氨基酸，为培养的细胞提供重要的能量来源。脱掉氨基后，基后，L-L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。代谢。L-L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，降解率随保存温度而谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，降解率随保存温度而变。变。L-L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。uu2.GlutaMAX-I2.GlutaMAX-I是什么是什么?培养细胞如何利用培养细胞如何利用GlutaMAX-I?GlutaMAX-I?这个二肽有多稳定这个二肽有多稳定?uuGlutaMAX-I GlutaMAX-I 即谷丙氨酸二肽，是一个即谷丙氨酸二肽，是一个L-L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的的alpha-alpha-氨基用氨基用L-L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-L-谷氨谷氨酰胺供利用。酰胺供利用。GlutaMAX-IGlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在二肽非常稳定，即使在121121磅灭菌磅灭菌2020分钟，分钟，GlutaMAX-I GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-L-谷氨酰胺谷氨酰胺几乎完全降解。几乎完全降解。第11页，本讲稿共14页uu3.3.培养基中丙酮酸钠的作用是什么培养基中丙酮酸钠的作用是什么?uu丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。uu4.Hanks 4.Hanks 平衡盐溶液平衡盐溶液(HBS)(HBS)和和EarlesEarles平衡盐溶液平衡盐溶液(EBS)(EBS)有什么本质的功能差别有什么本质的功能差别?uuHBSHBS和和 EBS EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在在Eagles(2.2g/L)Eagles(2.2g/L)中比在中比在Hanks Hanks(0.35g/L)(0.35g/L)中高。碳酸氢钠需用高水平的中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2CO2平衡，以维持溶液的平衡，以维持溶液的PHPH值。值。EaglesEagles液液在空气水平的在空气水平的CO2 CO2 中，溶液会变碱，中，溶液会变碱，HanksHanks液在液在CO2CO2培养箱中会变酸。如果希望在培养箱中会变酸。如果希望在CO2CO2培养箱中保存组织，需要用培养箱中保存组织，需要用EaglesEagles液，。如果仅仅是清洗将要在液，。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基细胞培养基中储中储存的组织，用存的组织，用HanksHanks液就可以了。液就可以了。uu5.5.培养液培养液pHpH对细胞生长的影响对细胞生长的影响?uu由于大多数细胞适宜由于大多数细胞适宜pHpH为为7.2-7.47.2-7.4，偏离此范围可能对细胞生长将产生有害的影响。但各种，偏离此范围可能对细胞生长将产生有害的影响。但各种细胞对细胞对pHpH的要求也不完全相同，的要求也不完全相同，原代培养原代培养细胞一般对细胞一般对pHpH变动耐受差，无限细胞系耐受力强。但变动耐受差，无限细胞系耐受力强。但总体来说，细胞耐酸性比耐碱性强一些。在配制培养用液时，需要注意一点：培新配的培养基在经总体来说，细胞耐酸性比耐碱性强一些。在配制培养用液时，需要注意一点：培新配的培养基在经过过0.10um0.10um或或0.22um0.22um滤膜过滤时，溶液的滤膜过滤时，溶液的pHpH还会向上浮动还会向上浮动0.20.2左右。左右。第12页，本讲稿共14页uu6.6.培养细胞时应使用培养细胞时应使用5%5%还是还是10%CO210%CO2，或者根本没有影响，或者根本没有影响?uu答：一般培养基中大都使用答：一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+HCO3-/CO32-/H+作为作为pH pH 的缓冲系统，而培的缓冲系统，而培养基中养基中NaHCO3NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的的含量将决定细胞培养时应使用的CO2CO2浓度。当培养基中浓度。当培养基中NaHCO3 NaHCO3 含量为每公升含量为每公升3.7g3.7g时，细胞培养时应使用时，细胞培养时应使用10%CO2;10%CO2;当培养基中当培养基中NaHCO3NaHCO3为每公升为每公升1.5g 1.5g 时，则应使用时，则应使用5%CO25%CO2培养细胞。培养细胞。uu7.Hepes7.Hepes的作用的作用uuHEPESHEPES溶液：是一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，主要作用是防止培养基溶液：是一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，主要作用是防止培养基pHpH迅速变动。在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了迅速变动。在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了 5%CO2 5%CO2的环境，的环境，CO2CO2气体迅速逸出，气体迅速逸出，pHpH迅速升高，若加了迅速升高，若加了HEPESHEPES，此时可以维持，此时可以维持pH7.0pH7.0左右。左右。uu8.NaHCO38.NaHCO3uu培养基中使用了培养基中使用了NaHCO3-CO2NaHCO3-CO2缓冲系统，并采用开放培养，使细胞代谢产生的缓冲系统，并采用开放培养，使细胞代谢产生的CO2CO2及及时溢出培养瓶，再通过稳定调节温箱中时溢出培养瓶，再通过稳定调节温箱中CO2CO2浓度浓度(5%)(5%)，与培养基中的，与培养基中的NaHCO3NaHCO3处于处于平衡状态，从而调节培养基的平衡状态，从而调节培养基的PHPH值。值。第13页，本讲稿共14页uu9.NEAA9.NEAA：非必须氨基酸：非必须氨基酸uuNEAA(NEAA(非必需氨基酸非必需氨基酸)是含几种非必需氨基酸的合剂，添加到的原培养基不同，是含几种非必需氨基酸的合剂，添加到的原培养基不同，uu10.10.氯化钙氯化钙uu氯化钙对成骨细胞培养有毒性，所以成骨细胞的培养基中应不含氯化钙。氯化钙对成骨细胞培养有毒性，所以成骨细胞的培养基中应不含氯化钙。uu11.11.什么培养基中可以省去加酚红什么培养基中可以省去加酚红?uu酚红在培养基中用作酚红在培养基中用作pHpH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。酚红本身对生物制品质量并不会产生影响，可以通过纯化技术去除，但酚红色。酚红本身对生物制品质量并不会产生影响，可以通过纯化技术去除，但酚红在无血清培养基可能带来胞内钠在无血清培养基可能带来胞内钠/钾失衡，影响细胞生长，当然这种作用能被血清钾失衡，影响细胞生长，当然这种作用能被血清所中和或减轻。酚红并不是培养基中必需的一种成分，很多国外的疫苗或抗体生所中和或减轻。酚红并不是培养基中必需的一种成分，很多国外的疫苗或抗体生产企业在生产过程中都使用无酚红培养基。产企业在生产过程中都使用无酚红培养基。uu研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，(特别是雌激素特别是雌激素)。为避免固醇类反应，培养细。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。第14页，本讲稿共14页