核酸的分离纯化和鉴定优秀课件.ppt
核酸的分离纯化和鉴定核酸的分离纯化和鉴定第1页，本讲稿共18页l核酸包括DNA、RNA，在细胞中都与蛋白质结合而存在。l分离纯化核酸总的原则:1、保证一级结构的完整性，完整的一级结构是研究核酸 结构和功能的基础；减少化学、物理、生物因素对核酸的降解：l 避免过酸、过碱对磷酸二酯键的破坏；l 避免机械剪切力以及高温煮沸；l 抑制DNase或RNase的活性；2、排除蛋白质、脂类、糖类等分子的污染。第2页，本讲稿共18页真核DNA提取的主要步骤 真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都可以用来制备基因组DNA。l温和裂解细胞，溶解DNA，使DNA与组蛋白分离；l采用化学或酶学方法去除蛋白质、RNA及其他大分子。第3页，本讲稿共18页外周血白细胞DNA的提取（NaI法）原理 利用双蒸水低渗溶胀红细胞及白细胞膜，释放出血红蛋白利用双蒸水低渗溶胀红细胞及白细胞膜，释放出血红蛋白及细胞核，及细胞核，NaINaI破核膜并有效解离破核膜并有效解离DNA-DNA-蛋白质复合物，使核酸处蛋白质复合物，使核酸处于易提取状态，于易提取状态，再以氯仿再以氯仿/异戊醇抽提（蛋白质变性沉淀并溶解异戊醇抽提（蛋白质变性沉淀并溶解脂类，异戊醇可减少抽提过程中的泡沫产生），离心后脂类，异戊醇可减少抽提过程中的泡沫产生），离心后DNADNA存在于存在于上层水相中，以上层水相中，以37%37%异丙醇沉淀及洗涤异丙醇沉淀及洗涤DNADNA，即获得白细胞，即获得白细胞DNADNA。用此法提取的用此法提取的DNADNA可用于可用于Southern Southern 杂交、杂交、PCRPCR的模板等。的模板等。第4页，本讲稿共18页【试剂】16 mol/L NaI 2氯仿/异戊醇(24:1 V/V)混合液，应在棕色密封瓶中保存。3异丙醇（isopropanol）(A.R)437%异丙醇或70%乙醇5双蒸水(ddH2O)(高压灭菌)6TE缓冲液(pH 8.0)(10 mmol/L Tris-Cl、1 mmol/L EDTA)高压灭菌。第5页，本讲稿共18页操作步骤 1.取新鲜抗凝血100l置Ep管中,离心10000rpm1 min。2.弃上清，加ddH2O 200l,摇匀20s。3.加6mol/L NaI 200l,缓慢倒置摇匀20s。4.于管内加氯仿/异戊醇(24:1)400l,缓慢颠倒混匀两相，离心10 000rpm10min。5.吸取上层水相350l置一新Ep管中，加纯异丙醇200l,混匀。6.室温放置15min,离心14 000rpm12min。第6页，本讲稿共18页Water phase(DNA)Water phase(DNA)proteins precipitatechloroform/isoamyl alcohol(lipids)STEP 5第7页，本讲稿共18页7.小心弃去上清，再加37%异丙醇（或70%乙醇）1 ml(勿摇动)，离心14000rpm12min.8.小心弃异丙醇（或乙醇），于室温敞口放置直至可见的痕量液体挥发殆尽。9.加50l TE缓冲液溶解DNA,以琼脂糖凝胶电泳鉴定或-20保存。第8页，本讲稿共18页1.标本必须新鲜，提取前细胞应保持完整。所用Ep管、滴头等用品及ddH2O、试剂等应高压灭菌，操作尽量在4以下进行。2.混匀试剂、吸取上清液等操作时应避免动作剧烈。3.弃去异丙醇时动作应轻，切忌甩干，以免DNA丟失。4.0.54-1倍的异丙醇可选择性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA，但对5SRNA、tRNA及多糖不产生沉淀。一般不需在低温条件下长时间放置。其缺点是易使盐类与DNA共沉淀；在DNA沉淀中的异丙醇难以挥发除去，所以常规需要70%乙醇漂洗DNA沉淀物。5.室温下放置16h或65放置1h,可加快基因组DNA沉淀的溶解。【注意事项注意事项】第9页，本讲稿共18页核酸的鉴定与分析 l紫外分光光度法可用于确定核酸的浓度及纯度。l核酸的分级分离。层析技术及凝胶电泳法，凝胶电泳分离法分制备型和分析型，根据分离核酸片段的大小可选择不同参数或条件的琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳。l核酸杂交技术用于鉴别某个特定的片段。l多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）对目的基因进行DNA序列分析及鉴定。lDNA测序 l基因表达分析（RNA详细结构和数量的分析）第10页，本讲稿共18页DNA的鉴定一、紫外法测紫外法测DNADNA的纯度及浓度的纯度及浓度原理：原理：组成核酸的嘌呤嘧啶碱基均有紫外吸收特性，最大吸收峰在260nm，这是紫外测定核酸的基础。蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。OD值为1时相当于大约50g/ml双链DNA。通过测定A260和A280的比值可估算核酸的纯度。紫外法仅用于测定浓度大于0.25g/ml的核酸溶液。第11页，本讲稿共18页操作 取15l DNA样品于3ml双蒸水中，分别于260、280、230nm处比色并记录。定量分析：定量分析：DNAA260核酸稀释倍数(3000/15)50/1000 =10A260(ug/ul)纯度分析：纯度分析：DNA A260/A280=1.8 A260/A2801.8，有RNA杂质，用RNase消化；A260/A2801.7,有杂蛋白，重复抽提纯化步骤;A260/A2302.0，可能有盐未除尽。注：此法不能区分此法不能区分DNADNA和和RNARNA，不能用于核酸粗制品的测定。，不能用于核酸粗制品的测定。第12页，本讲稿共18页核酸凝胶电泳 l核酸是带均匀负电荷的分子，在电场中向正极移动，不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同，在自由泳动时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开。以适当浓度的凝胶介质作为电泳支持介质，具有分子筛效应，使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，达到分离的目的，此为分离、鉴定和纯化核酸片段的标准方法。第13页，本讲稿共18页DNA的琼脂糖凝胶电泳 原理lDNA分子带负电荷，在电场中受到电荷效应、分子筛效应向正极移动过程中,因DNA分子的大小及构象差别而呈现迁移位置上的差异，对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。电泳时加溴化乙锭（EB），其与DNA结合形成一种荧光络合物，在254365nm紫外线照射下可产生桔红色的荧光，可用于检测DNA。第14页，本讲稿共18页【试剂与材料】15TBE缓冲液(pH 8.3)：54 g Tris碱,27.5 g硼酸,20 ml 0.5 mol/L EDTA(pH8.0),加水至1 L。20.5TBE缓冲液(pH 8.3)3溴化乙锭(EB)：5 mg/ml412%琼脂糖凝胶:琼脂糖12 g加至100 ml 0.5TBE缓冲液,加热熔解备用。56凝胶上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油溶于水中，4保存。6DNA分子量标准第15页，本讲稿共18页【操作步骤】1琼脂糖凝胶板的制备：将1%2%琼脂糖凝胶加热溶化均匀，冷却到65加EB至终浓度0.5g/ml，倒入凝胶槽，厚度约35mm，放置样品梳，待冷却成形后取出梳子及隔板，放入水平电泳槽中，缓冲液淹没过胶12mm为止。2加样：样品中加1/5体积的6凝胶上样缓冲液，混匀，取15l加入凝胶点样孔中。同时要设立合适的DNA分子量标准物。3电泳：电压210V/cm 胶,待溴酚蓝移至凝胶的2/3距离时，关闭电源。4取出凝胶块，置紫外透射反射分析仪上观察，即可见桔红色的DNA区带。第16页，本讲稿共18页【注意事项】1加样时勿破坏样品孔，否则DNA带型不整齐。2上样缓冲液中适量的甘油，蔗糖或聚蔗糖400可增加样品密度，使样品均匀沉到样孔底，而溴酚蓝、二甲苯青可使样品带色，便于上样及估计电泳时间和判断电泳位置。3EB是一种强烈诱变剂并有中度毒性，应戴手套操作，对于含有EB的溶液用后应妥善净化处理。4电泳过程中，EB向阴极移动，延长电泳时间，EB会从凝胶中迁移出来，从而使小片段DNA难于检测，可将凝胶浸在0.5 g/ml EB溶液中重新染色后检测。5加样孔的加样量依DNA样品中片段的数量及大小而定，通常对0.5cm宽的加样孔，DNA上样量在0.10.5g即可有良好的观察效果。6小的凝胶微型和中型凝胶的电泳一般比大凝胶要快，常用于快速分析。小胶通常要在高电压下电泳(10 V/cm)。应注意电泳槽盛装缓冲液的体积要相对较大。第17页，本讲稿共18页思考题思考题1、分离核酸的基本原则包括哪两方面？2、试比较用EB进行DNA凝胶电泳前（加在上样缓 冲液中）、电泳中（加在凝胶中）、电泳后 （凝胶浸泡于EB溶液中）的染色过程，各有 何有优缺点？第18页，本讲稿共18页
