移植排斥反应的预测、诊断试剂盒开发生产项目建议书.doc

移植排斥反应的预测、诊断试剂盒的开发生产项目建议书项目领域： 生物技术 项目名称： 移植排斥反应的预测、诊断试剂盒的开发生产 单 位： 陕西瑞奇生物科技有限公司 基本信息 1.项目负责人基本情况2姓名 胡军 性 别 男 出生年月 1962.10学历 研究生 学 位 博士 获得最终学位院校第四军医大学所学专业 移植免疫学 现从事专业 移植免疫学职 称 讲师 职 务 /主要工作经历1982-1989 年，在河南省确山县卫生防疫站从事流行病防治工作。1989-1992 年，在第四军医大学微生物学教研室病毒及其免疫专业读硕士学位。1992-1996 年 在第四军医大学微生物学教研室从事病毒及其免疫和移植免疫的研究工作。1996-1999 年，在第四军医大学西京医院心血管病研究所移植免疫学专业读博士学位。1999-2001 年 在第四军医大学西京医院心血管病研究所从事移植免疫学研究。2001 年至今，从事生物技术产品的开发研究，主要从事移植免疫学产品的开发工作。3主要工作成绩从事过的主要重大项目情况、研究成果和获知识产权情况（不限字数）1、军队重大课题心肺联合移植临床研究2002.05-2005.12 主要参加者。项目进展顺利。2、心脏移植临床与基础研究项目的主要参加者，已获得陕西省科技进步一等奖。3、已获得国家发明专利一项，已申 请的发明专利一项，准 备申请的专利两项。2.项目基本信息项目内容摘要（限 500 字）：器官移植排斥反应预测、诊断产品的开发生产器官移植是临床上发展最迅速的一个领域，据权威机构预测，到二十一世纪中叶，外科手术的一半都将是器官置换。世界上已有 70 多万人接受了器官移植，而且这个数字还在以每年 5 万多例的速度增加，但临床上对器官移植病人的选择及移植后排斥反应的无创诊断、监测 手段等尚未建立起来；这严重制约了器官移植的发展和水平的提高。本项目把基因工程技术和传统免疫学方法及新建立的免疫学方法结合起来，制备世界通用的 HLA 抗原标准细胞，为器官移植前的供、受体搭配，移植后排斥反应的预测、诊 断提供快捷、敏感、特异、可靠、无创的科学检测方法，该方法目前已用于临床心脏移植的排斥反应的诊断，经过大量的临床活检对照有很好的一致性，该方法的最佳反应条件也已基本建立，目前只需制备出通用检测试剂盒生产所需的原材料即可进行产品的大规模生产。该项目的成功填补了世界器官移植领域的空白，对急性排斥反应的早发现、早诊 断、早治 疗，明显提高移植患者的生存 质量，延长存活期限均具有革命性的重要作用。不但具有广泛的社会效益，而且还具有巨大的经济效益。该试剂盒的出现会大力推动器官移植领域的发展，终将使全球器官移植的总体水平有明显提高。本项目原材料的制备使用的技术是目前最先进的基因工程技术；其所用的混合淋巴细胞培养方法是目前免疫学专家公认的，反映机体细胞免疫状态最好的体外模型；所用的混合淋巴细胞反应抑制试验是我们近期才新建立的一个细胞免疫学检测的新方法，并已申请专利，故本项目产品短期内被其他更先进的技术和方法所取代的可能性不大。所使用的主要原材料和主要技术均立足国内，采购渠道通畅。器官移植排斥反应预测、诊断、 监测领域在世界上属于一个尚未开发的领域,尚未有与排斥反应诊断有关的试剂盒推出, 我们申请国内外专利后可保护 20 年。目前排斥反应预测试剂盒已获国家发明专利，正在申请美、日、德、英、印五国的专利；排斥反应诊断试剂盒已申请国家发明专利。本产品的出现将抢占全球器官移植领域产品的至高点。本项目产品以出口为主，市场约 4-5 亿美元/年（市场上无同类竞争产品）。预计总投资约 5000 万元人民币，首期投资需 1000-1500 万元人民币。投资到位后 18-24 个5月可具备批量投产条件，生产能力为年产 80 万套，投产一年后年产 150 万套。届 时，年销售收入 20 亿元人民币，税收 3 亿元人民币， 净利润 8 亿元人民币。 产品上市后一年可收回全部投资。二、项目情况61、研究的目的及意义、应用需求、研究开 发的必要性（不限字数）1.1 项目研究的目的、意义针对危害人类健康的各器官的终末期疾病，器官移植是目前唯一的治疗手段。器官移植术前排斥反应的预测、术后排斥反应的监测与诊断，以及最大限度地减少甚至避免病理排斥反应的发生等是临床器官移植急需解决的问题，也是国内外共同关注的热点和难点问题。本项 目通过基因工程技术和细胞工程技术，建立 HLA 抗原标准细胞检测平台，为器官移植前的供受体搭配、移植后排斥反应的预测、 监测、诊断、预防和技术服务保障提供快捷、敏感、特异、可靠、无创的科学检测方法。该项目的成功填补了世界器官移植领域的空白，对排斥反应的早发现、早诊断、早治 疗，明显提高移植患者的生存质量，延长存活期限均具有革命性的重要作用。不但具有广泛的社会效益，而且还具有巨大的经济效益。 该试剂盒的出现会大力推动器官移植领域的发展，终将使全球器官移植的总体水平有明显提高。由于该项目填补了世界器官移植领域的空白，它的出现将抢占全球器官移植领域产品的至高点。将使我国在世界生物技术产品领域拥有一席之地。为我国生物技术的产业化发展开辟一个新领域，对促进我国生物技术产业向多元化发展具有重要意义。1.2 应用需求及研究开发的必要性器官移植是目前临床上发展最迅速的一个领域, 有人预测, 到二十一世纪中叶, 外科手术的一半都将是器官置换. 目前世界上已有 70 多万人接受了器官移植, 而且这个数字还在以每年近 5 万的速度增加, 但目前临床上对器官移植病人的选择都是通过 HLA 抗原配型来比较供受体差异的大小， 这种比 较只是对供受体 HLA 抗原的客观存在的差异性进行比较，不能反映他们各自 HLA 抗原组合的功能状况，而不同的抗原组合具有不同的免疫反应性，所以，原来的方法不能反映一个人的 HLA 抗原组合对人类某一个 HLA 抗原的免疫反应性。而本方法是一个功能性 检测方法，是了解一个人的 HLA 抗原组合对各种不同特定抗原反 应性的方法。 这一方法所得结果更接近人体内实际的免疫反应状况。目前对移植后排斥反应的确定主要是通过有创，痛苦、非特异的活检穿刺方法。临床上急需的快捷、敏感、特异、可靠、无创的科学手段尚未建立。再者器官移植后,受体需终生使用免疫抑制剂, 但服用该药的剂量过大不仅导致费用增加(一般一年需数万元人民币), 且受体易患感染性疾病及恶性肿瘤等, 服用剂量 过小又会导致移植器官被排斥而失去功能, 如何对具体的个体选择合适的用药剂量是长期以来困扰临床医生的一个难题。多年来指导用药的“ 金指标”一直是上述的活检穿刺, 但由于活检穿刺费用高且有创、痛苦, 不易为病人接受, 而且7穿刺本身具有危险性, 不宜多做, 故移植后在医生未察觉的情况下突然因排斥反应使移植器官失去功能而导致病人死亡情况屡有发生。再如, 许多病人在移植后, 由于经济原因而停用免疫抑制剂, 结果发现其中有些病人停药后并不发生排斥反应, 也就是说这些病人对供体器官产生了免疫耐受，在未停药的患者中，实际上可能有不少患者已对供体器官产生了耐受。然而，由于没有一个科学的指标去检测并说明该患者已对供体器官产生了耐受，所以，医生很难确定停用免疫抑制剂的时机，从而，使移植后停用免疫抑制剂成为一种冒险。因此，本方法将对器官移植前的供受体选择、移植后的排斥反应的确定以及停用免疫抑制剂时机的掌控有革命性的贡献。器官移植是治疗许多器官终末期疾病的唯一方法。在器官移植后，供受体间HLA 抗原的差异将引起排斥反应，排斥反 应仍是目前影响心、肝、肾、骨髓等器官或细胞移植后 1 年、5 年、10 年存活率的主要因素， 如果有一个在移植以前可以挑选供受体使之合理搭配(即挑选那些移植后可能发生排斥反应较轻或不发生排斥反应的供受体进行移植, 这一点对骨髓移植尤为重要)、在移植后能检测有无排斥反应发生、移植器官有无淋巴细胞慢性浸润及受体对供体器官有无免疫耐受发生等的无创检测方法, 对指导临 床医生合理 调整免疫抑制剂用量、使之适时停药(将大大减轻病人的经济负担), 提高病人生存质量，降低移植病人的死亡率 , 延长移植器官的存活时间具有重要意义, 这将有力推动器官移植事业的发展。所以, 随着接受器官移植的患者的不断增加及移植免疫学的迅速发展, 建立一套完善的移植前对供受体选择, 移植后监测受体对供体特异性免疫状态的无创检测方法, 对供体器官的长期存活已变得越来越重要。但在本方法出现以前, 临床上尚没有一个快捷、敏感、特异、可靠、无创的科学的指标来指导移植前供体的挑选, 移植后排斥反应和免疫耐受的诊断,及免疫抑制剂用量调整的方法。82主要研究开发内容、拟解决的技术难点、创新突破点以及预期达到的目标、主要经济技术指标和水平（不限字数）2.1 本项目研究开发的主要内容：将传统免疫学检测方法和现代分子生物学技术有机结合，建立一套可应用于临床器官移植排斥反应预测的快捷、敏感、特异、可靠、无创的科学方法；在进行传统免疫学研究过程中建立一个全新的免疫学方法，应用于排斥反应的临床诊断。主要研究内容有：(1)排斥反应预测 ：它是运用分子生物学技术，建立表达 HLA-类和类抗原的标准细胞株，使每株细胞上只表达一个 HLA 抗原。再把 这些几乎包含了人 类全部 HLA 抗原的细胞株的细胞分别放入细胞培养板各孔之中，制成标准细胞板作为抗原板，用该抗原板通过混合淋巴细胞培养方法来检测受体对哪些 HLA 抗原反应强、 对哪些 HLA抗原反应弱，从而指导我们为 受体挑选合适的供体器官，以减少移植后排斥反应的发生。其主要研究内容包括：A、HLA 抗原缺失细胞系（作为 HLA 抗原表达的空白 细胞载体）的选择与鉴定，已完成。B、通过 EB 病毒感染的方法建立包含已知人类全部 HLA 抗原的几十个细胞系（该项工作已经基本完成），并分别从这些细胞中提取 mRNA 进行反转录，再通过 PCR 方法从反转录的 cDNA 中克隆出目的基因 进行测序，该项工作正在进行中，已经完成了其中一部分。C、选择一种能在真核细胞中表达、并且能整合到宿主细胞基因组中的逆转录病毒表达载体， 构建 HLA 抗原表达载体， 该项工作正在进行中（已构建出 10 余个抗原表达载体）。D、把 HLA 抗原表达载体经包装后转染入细胞中表达（正在进行中）。9E、筛选稳定表达某一个 HLA 抗原的细胞建株、并进行鉴定。F、重复上述工作，建立分别表达不同 HLA 抗原近 100 个亚型抗原的细胞株。G、探索用 这 些细胞株作为 刺激细胞进行混合淋巴细胞反应的最佳条件。H、建立 这些 细胞株的大规 模培养条件，用这些细胞制备包含人类全部 HLA 抗原的检测板。I、用这种 HLA 抗原检测板，通过混合淋巴细胞反应为器官移植受者挑选供体，同时对移植后的患者进行监测，发现已对供体器官产生免疫耐受的患者，并指导其逐渐停用免疫抑制剂。J、建立用这些细胞株作为刺激细胞进行混合淋巴细胞反应抑制试验的最佳条件。(2)排斥反应等的 诊断：在进行移植免疫学的研究过程中，我们又建立了一个全新的免疫学方法，由于其实验方法与混合淋巴细胞反应相似，反应结果和混合淋巴细胞反应结果完全相反，暂时 我们把它叫做混合淋巴细胞反应抑制试验，该实验可以用来检测外周血中活化淋巴细胞的特异性，故使用上述 HLA 抗原板即可 检测器官移植受者体内有无HLA 抗原活化的淋巴细胞，从而判断体内有无排斥反 应发生。该方法不但可以用于诊断排斥反应，也可能用于各种传染病的诊断和预防。挑选上述已被 EB 病毒转化的细胞株中相互不具有相同抗原的 细胞株，以他们为载体，通过上述基因工程的方法，把其它的未包含在所挑选的载体中的 HLA抗原分别转入其中并表达，使一个细胞表达尽可能多的 HLA 抗原。从而使这些细胞株表达几乎人类全部的 HLA 抗原。用这些表达较多 HLA 抗原的细胞株制备 HLA 抗原板，通过混合淋巴细胞反应抑制试验对器官移植病人进行排斥反应监测,并探索其最佳反应条件。选择上述两种细胞板中的一种细胞板进行混合淋巴细胞反应抑制试验，对器官移植后的患者进行排斥反应监测、诊断和预防。对混合淋巴细胞反应抑制试验方法在临床感染性疾病诊断方面的应用进行探索性研究，争取早日把该 方法应用到流脑、乙 脑病毒、出血热病毒、水痘病毒、麻10疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒、SARS 病毒等疾病的诊断和感染性疾病疫苗接种后的免疫效果评价方面。2.2 拟解决的技术难点：1 建立、筛选稳定表达单一 HLA 抗原的各种细 胞株。2 表达 HLA 抗原的细胞株的大规模培养技术。2.3 创新突破点：（1）利用基因工程技术建立百余种分别只表达一种 HLA 抗原的标准细胞株，把这些细胞株和传统免疫学技术结合建立人类混合淋巴细胞反应板，在世界上首次建立一个世界通用的、体外检测一个个体对每个 HLA 抗原反应性的方法。该方法已获国家发明专利（见附件）。（2）建立了一个全新的、可以用来检测机体内活化淋巴细胞特异性的免疫学方法（目前世界上还没有一个检测体内活化淋巴细胞特异性的方法），并在世界上推广该方法用于排斥反应的诊断和预防。2.4 预期达到的目标2.4.1 过 2-3 年的工作，完成上述 HLA-类抗原、HLA-类抗原近 100 个亚型抗原的表达、并使之具备生产条件。2.4.2 通过 3-4 年的工作，用于移植前挑选供、受体使之合理搭配的检测试剂盒，用于移植后排斥反应监测、 诊断的试剂盒均拿到生产批号，投放并满足国内市场的需求，同时开始进军国外市场。2.5 主要技术指标和水平： 2.5.1 主要技术指标：（1）表达 10 多种和表达单种 HLA 抗原的细胞株，具有稳定表达、传代能力。