微生物工程题库参考答案.pdf

第一部分第一部分微生物工程原理微生物工程原理第一、二章第一、二章 微生物工程概论、生产菌种的来源微生物工程概论、生产菌种的来源SOSSOS 生色检测法生色检测法：利用 DNA 损伤时，可活化 yecA 蛋白，进而分解噬菌体的阻遏蛋白，再引起sifA(sulA)基因启动子启动 LacZ 基因的表达，从而达到检测能损伤 DNA 的抗肿瘤药物的目的。生化诱导分析法生化诱导分析法(BIA)(BIA)：采用测定溶原性 噬菌体阻遏物支配下的启动子控制的转录和表达的酶活性的方法。1 1、微生物工程的应用领域有？、微生物工程的应用领域有？（1）在食品工业的应用微生物技术最早开发应用的领域，至今产量和产值仍占微生物工程的首位。食品加工、含醇饮料、发酵乳制品、调味品等（2）在医药卫生中的应用抗生素、氨基酸、维生素、生物制品、酶抑制剂（3）在轻工业中的应用糖酶、蛋白酶、果胶酶、脂肪酶、凝乳酶、氨基酰化酶、甘露聚糖酶等（4）在化工能源中的应用醇及溶剂、有机酸、多糖、清洁能源等（5）在农业中的应用生物农药、生物除草剂、生物增产剂等（6）在环境保护中的作用污水处理（厌气法、好气法）（7）在高技术领域中的应用基因工程的各种工具酶等2 2、抗肿瘤药物产生菌的分离原理、抗肿瘤药物产生菌的分离原理临床上有效的抗肿瘤药物大多是直接作用于核酸或抑制核酸生物合成的物质，大部分具有抗菌或抗真菌的活性，现发展出利用微生物筛选作用于 DNA 的抗肿瘤药物的方法，如生化诱导分析法、SOS 生色检测法生化诱导分析法生化诱导分析法（BIABIA）：采用测定溶原性 噬菌体阻遏物支配下的启动子控制的转录和表达的酶活性的方法。将E.coli lacZ连接在 噬菌体的 PL 启动子下，当 DNA 损伤时，诱发 阻遏蛋白 CI 分解，PL 启动子启动lacZ基因转录，表达出-半乳糖苷酶。测定-半乳糖苷酶活性，可检测能损伤 DNA 的抗肿瘤药物的存在 X-Gal。作显色底物；反应后呈蓝色SOSSOS 生色检测法生色检测法：利用 DNA 损伤时，可活化 yecA 蛋白，进而分解噬菌体的阻遏蛋白，再引起sifA(sulA)基因启动子启动 LacZ 基因的表达，从而达到检测能损伤 DNA 的抗肿瘤药物的目的3 3、利用、利用 DNADNA 修复能力突变株进行抗肿瘤药物的筛选原理修复能力突变株进行抗肿瘤药物的筛选原理生物-两个以上的 DNA 修复基因，一个 DNA 修复基因损伤或变异，仍能存活，但对能引起 DNA 损伤的化合物十分敏感，易发生死亡4 4、抗病毒药物产生菌的筛选分离方法、抗病毒药物产生菌的筛选分离方法（1）作用于核酸的方法-药物毒性高；（2）小平板测定由病毒引起的细胞变性效果(CPE)；（3）病毒复制中特有的 DNA 复制酶和核酸合成酶的酶抑制剂第三章第三章 优良菌种的选育优良菌种的选育结构不稳定：结构不稳定：由于重组质粒 DNA 发生缺失、插入或重排引起的质粒结构变化。分裂不稳定：分裂不稳定：由于细胞分裂过程中质粒缺失分配到子细胞中而导致整个质粒丢失准性生殖：准性生殖：指真菌不通过有性生殖的基因重组过程。准性生殖过程包括异核体的形成、二倍体的形成和体细胞的重组.互变异构效应：互变异构效应：指四种碱基第六位上的酮基或氨基的瞬间变构，会引起碱基错配。多因素低剂量的诱变效应：多因素低剂量的诱变效应：指在自然环境中存在低剂量的宇宙射线、各种短波辐射、低剂量的诱变物质和微生物自身代谢产生的诱变物质等的作用引起的突变。自然选育：自然选育：不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程1 1、提高质粒稳定性的方法？、提高质粒稳定性的方法？两阶段培养法：一增加菌体、二诱导外源基因表达适当培养条件：温度、pH、培养基组分和溶解氧等2 2、质粒不稳定的产生原因？、质粒不稳定的产生原因？质粒不稳定-分裂不稳定的两因素：含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；这两种菌的比生长速率差异的大小低拷贝-产生不含质粒子代菌频率高；高拷贝-比生长速率低拷贝数与工程菌本身特性、培养条件有关3 3、影响外源基因在酵母中表达的因素？、影响外源基因在酵母中表达的因素？因素：外源基因的拷贝数、表达效率、外源蛋白糖基化、宿主菌株的影响（1）外源基因的拷贝数：应协调-稳定性、拷贝数、细胞生长量、表达效率（2）外源基因的表达效率：与启动子、分泌信号和终止序列有关启动子：上游激活序列+近端启动子（TATA 序列、起始密码子），分为组成型、诱导型启动子（可改变表达效率）分泌信号：信号肽、前导肽部分编码序列，分泌过程-加工切割-正确产物终止序列：保证适当终止加 Poly(A)尾巴-mRNA 比较稳定（3）外源蛋白的糖基化糖基化-N-糖苷键、O-糖苷键氨基末端修饰-二硫键形成-蛋白质折叠-糖基化-分泌（4）宿主菌株的影响菌特点：生长能力强、内源蛋白酶弱、菌株性能稳定、分泌能力强等4 4、酵母菌的载体系统？、酵母菌的载体系统？酵母载体多为穿梭载体-同时有细菌和酵母的复制原点和选择标记-能在细菌和酵母中-复制和表型选择(1)克隆载体的复制序列-四类酵母附加体质粒(YEp 类)复制序列-酵母内源 2um 质粒成分，拷贝数约为 5-50 酵母复制型质粒(YRp 类)复制序列-非 2um 来源的自主复制序列(ARS)，来自酵母染色体或其他生物；稳定性差，拷贝数少 酵母着丝粒质粒(YCp 类)复制序列-ARS，有酵母染色体中心粒成分，以一种类似染色体的单位参与细胞的有丝分裂和减数分裂，稳定性好，拷贝数一个 酵母整合型质粒(YIp 类)载体有与酵母染色体重组的序列-整合到染色体中，具有很好的稳定性，拷贝数个(2)表达载体在克隆载体中插入酵母的表达盒和终止子等调控序列，即可构建成酵母的表达载体。表达盒包括酵母菌强启动子多克隆位点的 3端非编码区。5 5、在大肠杆菌中真核基因的表达形式、在大肠杆菌中真核基因的表达形式三种表达方式：即融合蛋白、非融合蛋白、分泌型表达蛋白（1）融合蛋白融合蛋白：指蛋白质的N 端是一段原核 DNA 序列，C 端接上真核基因序列。优点：基因操作简便、表达蛋白较稳定、可高效表达；缺点：因有原核序列-免疫原性-只能作为抗原用；切除-原核多肽-具有生物活性的真核蛋白（2 2）非融合蛋白：非融合蛋白：在大肠杆菌中以真核蛋白 mRNA 的 ATG 密码子为起始表达的蛋白质，保持蛋白质原有的生物活性，但易被蛋白酶降解。N 末端有甲硫氨酸，能引起人体免疫反应。（3 3）分泌表达：）分泌表达：通过将外源基因连接到编码原核蛋白信号肽的下游来实现。常用信号肽：碱性磷酸酶(phoA)、膜外周质蛋白(OmPA)、霍乱弧菌毒素 B亚单位(CTXB)等及大白鼠胰岛素原信号肽。6 6、真核表达系统包括、真核表达系统包括酵母：是研究基因表达调控最有效的单细胞真核微生物；基因组小，仅为大肠杆菌的 4 倍；世代周期短；有单倍体、双倍体两种形式；生长繁殖迅速，容易培育，不产生有毒物质，基因工程操作方便，与原核生物相似；表达产物能够糖基化；丝状真菌：特点是有很强的蛋白质分泌能力，能正确进行翻译后加工-剪切和糖基化等转录和翻译-进入周质-信号肽酶识别-切掉信号肽-生物活性7 7、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素（1）外源基因的拷贝数：基因拷贝数增加-基因表达产物产量-增加（2）外源基因的表达效率 影响表达效率因素：启动子的强度、核糖体结合位点的有效性、SD 序列和起始密码子 ATG 之间的距离、密码子的组成 启动子-转录水平上影响基因表达；有强弱之分；下游应有转录终止子；SD 序列和起始密码子 ATG 之间的距离及序列-mRNA 翻译成蛋白质的效率有明显影响消除核糖体结合位点及其附近的潜在二级结构密码子组成影响翻译效率-偏爱性（3）表达产物的稳定性提高稳定性-避免蛋白酶降解：产生融合蛋白；表达在胞浆周质的空隙；改变真核蛋白二硫键的位置；选用蛋白酶缺陷型菌（4）细胞的代谢负荷减轻负荷：将细胞生长和外源基因的表达分成两个阶段8 8、原生质体制备与融合方法、原生质体制备与融合方法（1）原生质体制备:酶解出发菌的细胞壁-高渗溶液中-释放原生质体革兰阳性细菌-用溶菌酶；革兰阴性细菌-EDTA+溶菌酶；链霉菌-在含甘氨酸的培 养基中培养后用溶菌酶；酵母-巯基乙醇+EDTA 的溶液中培养，用蜗牛酶或纤维素酶；霉菌-几丁质酶、纤维素酶（2）原生质体融合和再生 A.融合方法：化学因子（聚乙二醇）、电场诱导、生物因子（仙台病毒）；B.再生：涂布在高渗培养基上培养（3）融合子的检出在选择性培养基上检出，通过两个遗体标记互补确定9 9、原生质体融合的优越性、原生质体融合的优越性受接合型或致育型的限制小，两亲株没有供体和受体之分，有利于不同种属微生物的杂交重组频率高于其他杂交方法:原生质体剥离了细胞壁，去除了细胞间物质交换的主要障碍，也避免了修复系统的制约；再加上促融剂的诱导作用，重组频率显著提高遗传物质的传递更加充分、完善，既有核配又有质配。可以采用温度、药物、紫外线等处理纯化亲株的一方或双方，然后使其融合，筛选再生重组子菌落，提高筛选效率用微生物的原生质体进行诱变，可明显提高诱变频率1010、酵母菌交配方式、酵母菌交配方式孢子与孢子、单倍体细胞与孢子、细胞间1111、原核表达系统包括、原核表达系统包括大肠杆菌：最常采用的原核表达系统；有细胞内不溶性表达(包含体）、胞内可溶性表达、细胞周质表达；无信号肽；不存在翻译后修饰作用；存在内毒素。枯草芽孢杆菌：分泌能力强；不形成包含体；有很强的胞外蛋白酶，会对产物进行不同程度的降解链霉菌：不致病、使用安全；分泌能力强，可将表达产物分泌到胞外；有糖基化能力等1212、霉菌的杂交步骤、霉菌的杂交步骤异核体形成：在基本培养基上接种两个营养缺陷型亲本，强迫其进行营养互补双倍体的检出：A.扇面-挑出孢子-分离纯化-双倍体。B.异核体菌丝打碎-基本培养基和完全培养基-分离异核体菌落-原养型扇面分离纯化。C.异核体孢子-涂布基本培养基-原养性菌落中分离纯化-杂合双倍体。分离子的检出：杂合双倍体单孢子-完全培养基平板菌落成熟-从斑点处挑取孢子-完全培养基斜面-纯化和鉴别-分离子1313、组成型突变株的筛选、组成型突变株的筛选调节基因或操纵基因发生突变，都有可能获得组成型突变株筛选原则：设计某种有利于组成型菌株生长，并限制诱导型菌株生长的培养条件，造成组成型菌株生长优势或适当的分辨两类菌落的方法，选出组成型突变株1414、诱变后的突变菌株包括？、诱变后的突变菌株包括？营养变异、抗性变异、代谢变异、形态变异、生长繁殖变异和发酵温度变异等1515、优良菌种的基本特性、优良菌种的基本特性菌种的生长繁殖能力强，具较强的生长速率，产生孢子的菌种应具有较强的产孢子能力。菌种的培养基和发酵醪原料来源广泛、价格便宜、尤其对发酵原料成分的波动敏感性较小。对需要添加的前体物质有耐受能力，且不能将这些前体物质作为一般碳源利用菌种应具有在较短的发酵周期内产生大量发酵产物的能力。能高效地将原料转化为产品。这样可以降低生产成本，提高产品的市场竟争力。在发酵过程中不产生或少产生与目标产品性质相近的副产物及其它产物。在发酵过程中产生的泡沫要少，这对提高装料系数，提高单罐产量，降低成本具有重要意义。具有抗噬菌体感染的能力。菌株遗传特性稳定，以保证发酵能长期、稳定进行，有利于实施最佳工艺控制。菌种纯粹，不易变异退化，不产生任何有害生物活性物质和毒素，以保证安全。1616、简述放线菌的四种遗传体系和杂交方法、简述放线菌的四种遗传体系和杂交方法（1 1）遗传体系）遗传体系异核现象：菌丝间的接触和融合形成异核体，在同一条菌丝或细胞中含有不同基因型的细胞核。接合现象：菌丝间经接触和融合以后，相同细胞质中不同细胞核在两者增殖过程中，发生部分染色体的转移或遗传信息的交换。结果是部分合子形成。异核系的形成：当部分合子形成后，就会产生杂合的无性繁殖系，即异核系的细胞核。细胞核是经过一次单交换而产生的异核系染色体组，有一个二体区。过度阶段菌落很小，不稳定。其分生孢子影映在同样的培养基上不能生长重组体的形成：染色体重叠的二体区的不同位置上发生交换(部分合子也可经过双交换形成重组子)-重组体孢子。（2）杂交方法杂交方法：混合培养法、玻璃纸法、平板杂交法混合培养法：将带有互补的营养缺陷型的两个亲株混合后，接种到丰富培养基上，待孢子形成后制备单孢子悬液并在选择性平板上分离，长出的单菌落即为各种不同类型的重组体玻璃纸法：使用本法必具备两个条件：第一，在直接亲本必须具有两个遗传标记，如一个亲本带有一种营养缺陷标记和抗药性标记；另一直接亲本则带有另一营养缺陷型和对同一药物的敏感性；第二，选择性培养基带有抗性药物的补充培养基。筛选方法为筛选方法为，先将两亲本的孢子混合接种在铺有玻璃纸的完全培养基上，培养 24h，在显微镜观察下小菌落刚刚接能而未生长气生菌丝，玻璃纸上长出后基内菌丝时，将玻璃纸转移到含有抗生素的基本培养基平板上，这时基内菌丝停止生长（抗性亲本有时缓慢继续生长）、培养 2d 后，在玻璃纸表面长出的微小的气生菌丝的小菌丛即为异核系，异核系的分离是在解剖显微镜下用无菌细针收集异核系小菌丝，再将异核系小菌丝置于完全培养基平板表面上滴无菌水中，涂布均匀后培养 3d，获得分离子。平板杂交法：先将菌株培养在非选择性培养基上，在菌落形成孢子后，用影印法把菌落印至已铺有试验菌孢子的完全培养平板上，再培养至孢子形成，然后将此孢子影印到一系列选择性培养基上，筛选各种重组体子代。1717、诱变育种的原理、诱变育种的原理（1）诱变育种的理论基础是基因突变，突变主要包括染色体畸变和基因突变两大类。染色体畸变：是染色体或 DNA 片段发生缺失、易位、逆位、重复等。基因突变：DNA 中的碱基发生变化-点突变。（2）诱变育种就是利用各种被称为诱变剂的物理因素和化学试剂处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌株的育种方法。1818、细菌杂交育种的内容与要求、细菌杂交育种的内容与要求（1）内容包括：接合、F 因子转导、R 因子转移、转化和转导。（2）要求出发菌株有选择性遗传标记，如营养缺陷、抗生素抗性、温度敏感、发酵性能等1919、杂交育种目的、杂交育种目的将不同菌株的遗传物质进行交换、重组，使不同菌株的优良性状集中在重组体中，克服长期诱变引起的生活力下降等缺陷。扩大变异范围，改变产品的产量和质量，甚至创造出新物种2020、诱变育种的基本方法、诱变育种的基本方法（1）诱变育种一般包括诱变和筛选两个部分，诱变育种是诱变和筛选过程的不断重复，直到获得高产菌株（2）诱变部分成功的关键：出发菌株的选择、诱变剂种类和剂量的选择、合理的使用方法。筛选部分包括初筛和复筛来测定菌种的生产能力第四章第四章 菌种保藏的原理和方法菌种保藏的原理和方法1 1、简单介绍斜面保藏法、简单介绍斜面保藏法适用于短期保藏细菌、放线菌、酵母、丝状真菌方法：将微生物在适宜的斜面培养基和温度条件下培养并生长良好后，放入4-5冰箱中保存。一般保存期为 3-6 个月。油封较好2 2、简单介绍沙土管干燥保藏法、简单介绍沙土管干燥保藏法常用作保藏产生孢子丝状真菌、放线菌，形成芽孢的细菌。原理：干燥、寡营养方法：将沙和土洗净、烘干、过筛(沙-80 目，土-100 目)，沙与土1-2：1 混均、分装、121 高压间歇灭菌 2-3 次，菌种以浓菌或孢子悬液加入，置干燥器真空抽干封口，5冰箱，保藏期一般为两年3 3、简单介绍真空冷冻干燥保藏法、简单介绍真空冷冻干燥保藏法特点：保藏期长、变异小、适用范围广、大多数专业的菌种保藏机构均采用原理：低温下快速冻结（保持菌种的细胞完整）、减压下水分升华（细胞的生长代谢等生命活动处于停止状态）操作程序：安培管的处理-洗涤、灭菌；保护剂-减少冻结损伤、支持作用，常用脱脂牛奶和血清；菌悬液制备；冷冻干燥：-15至-30 安培管的保藏：4-5温度下可保藏 5 一 l0 年。受菌种、菌龄、样品含水量等因素影响。4 4、简单介绍液氮保藏法、简单介绍液氮保藏法保藏：效果好、方法简单、对象最广泛方法：菌悬液+保护剂-封口-每分钟降低 1冷至-25-液氮罐。-150 或-196的液氮中，保藏期一般为 2-3 年。第五章第五章 微生物的代谢调节和代谢工程微生物的代谢调节和代谢工程代谢工程代谢工程：利用基因工程技术改变代谢流、扩展和构建新的代谢途径、通过关联酶将两个代谢途径连接形成新的代谢流等技术酶的激活酶的激活：在某个酶促反应系统中，某种低分子质量的物质加入后，导致原来无活性或活性很低的酶转变为有活性成活性提高，使酶促反应速率提高的过程酶的抑制酶的抑制：在某个酶促反应系统中，某种低分子质量的物质加入后导致酶活力降低的过程同工酶调节：同工酶调节：某一分支途径中的第一步反应可由多种酶催化，但这些酶受不同的终产物的反馈调节.(酶的分子结构不同)协同反馈调节：协同反馈调节：需有一种以上终产物的过量存在方有明显的效果单个终产物过量，不产生或只产生很小的影响EDBCAFG累加反馈调节累加反馈调节：每一种末端产物过量只能部分抑制或阻遏，总的效果是累加的30%EDBCAF40%G58%增效反馈调节增效反馈调节：代谢途径中任一末端产物过量时，仅部分抑制共同反应中第一个酶的活性，但两个末端产物同时过量时，其抑制作用可超过各末端产物产生的抑制作用的总和。15%EDBCAF20%G90%顺序反馈调节顺序反馈调节：分支途径中几个末端产物抑制分支点后面第一个酶，使分支点产物积累，结果分支点产物又反馈抑制共同途径中的第一个酶，最后使整个代谢途径停止。（图见右上方）激活与抑制联合调节：激活与抑制联合调节：由一种生物合成的中间产物参与两个完全独立的、不交叉的合成途径的控制。这种中间体物质浓度的变化会影响这两个独立代谢途径的代谢速率。代谢调节代谢调节：改变发酵工艺条件（PH、温度、通气量、培养基组成）、微生物遗传特性等初级代谢初级代谢：普遍存在于生物中的代谢类型，是与生物生存有关涉及能量产生和能量消耗的代谢类型。代谢产物如单糖、核苷酸、脂肪酸等及蛋白质、核酸、多糖、脂类等。次级代谢次级代谢：微生物为了避免代谢过程中，某种代谢产物的积累造成的不利作用，而产生的一类有利于生存的代谢类型，通常是在生长后期合成。非生长所必需。能荷调节（腺苷酸调节）能荷调节（腺苷酸调节）：指细胞通过改变 ATP、ADP、AMP 三者比例来调节其代谢活动。组成酶：组成酶：不依赖于酶底物或类似物的存在合成（葡萄糖转化为丙酮酸过程中各酶）诱导酶诱导酶：依赖于某种底物或底物的结构类似物的存而合成（大肠杆菌乳糖利用酶）酶合成的诱导作用酶合成的诱导作用：酶合成的阻遏作用酶合成的阻遏作用：1 1、酶活性调节的机制有？、酶活性调节的机制有？（1）变构调节机制：变构酶具有一个以上的结合位点，除了结合底物的活性中心外，在同一分子内还有一些分立的效应物结合位点（副位点）；主位点和副位点可同时被占据；副位点可结合不同的效应物，产生不同的效应；效应物在副位点上的结合可随后引起蛋白质分子构象的变化，从而影响酶活性中心的催化活性；变构效应是反馈控制的理论基础，是调节代谢的有效方法。（2）共价修饰指蛋白质分子中的一个或多个氨基酸残基与一化学基团共价连接或解开，使其活性改变的作用，分可逆和不可逆两种。可逆共价修饰：有些酶存在活性和非活性两种状态，它们可以通过另一种酶的催化作共价修饰而互相转换不可逆共价修饰：典型的例子是酶原激活无活性的酶原被相应的蛋白酶作用，切去一小段肽链而被激活2 2、次级代谢的调节类型包括、次级代谢的调节类型包括诱导调节、碳分解产物调节、氮分解产物调节、磷酸盐调节、反馈调节、生长速度调节等3 3、分支生物合成途径的调节方式、分支生物合成途径的调节方式（1）同工酶（isoenzyme）调节某一分支途径中的第一步反应可由多种酶催化，但这些酶受不同的终产物的反馈调节.(酶的分子结构不同)（2）协同反馈调节(concerted feedback regulation)需有一种以上终产物的过量存在方有明显的效果单个终产物过量，不产生或只产生很小的影响EDBCAFG（3）累加反馈调节每一种末端产物过量只能部分抑制或阻遏，总的效果是累加的30%EDBCAF40%G58%（4）增效反馈调节(cooperative feedback regulation)代谢途径中任一末端产物过量时，仅部分抑制共同反应中第一个酶的活性，但两个末端产物同时过量时，其抑制作用可超过各末端产物产生的抑制作用的总和。15%EDCBAF20%G90%（5）顺序反馈调节(sequential feedback regulation)分支途径中几个末端产物抑制分支点后面第一个酶，使分支点产物积累，结果分支点产物又反馈抑制共同途径中的第一个酶，最后使整个代谢途径停止。（6）联合激活或抑制调节由一种生物合成的中间产物参与两个完全独立的、不交叉的合成途径的控制。这种中间体物质浓度的变化会影响这两个独立代谢途径的代谢速率。4 4、发酵条件的控制包括、发酵条件的控制包括（1）各种发酵条件对微生物代谢的影响啤酒酵母：中、酸性-乙醇+二氧化碳；碱性-甘油（2）使用诱导物诱导酶：蛋白质、糖类或其他物质降解有关的酶类（3）培养基成分和浓度的控制甘油代替果糖-嗜热脂肪酵母-淀粉酶产量（4）添加生物合成前体回避-反馈抑制作用；邻氨基苯甲酸-前体5 5、改变代谢途径的定义、方法、举例、改变代谢途径的定义、方法、举例改变代谢途径：改变分支代谢途径的流向或流量，阻断其他代谢产物的合成，达到提高目标产物的目的。方法：加速限速反应、改变分支代谢途径流向、构建代谢旁路、改变能量代谢途径（1）加速限速反应（2）改变分支代谢途径流向提高代谢分支点的某一代谢途径酶系的活性，在与另外的分支代谢途径的竞争中占据优势，从而提高目的末端产物的产量。例如：芳香族氨基酸合成途径中，色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸三条支路上，任一支路的酶活性被加强，其与另两条支路的竞争将占据优势。（3）构建代谢旁路例如：将枯草杆菌的乙酰乳酸合成酶基因克隆到大肠杆菌，明显地改变了代谢流，使乙酸浓度保持在不引起细胞中毒的浓度以下。（4）改变能量代谢途径改变能量代谢途径或电子传递系统，影响或改变细胞的代谢流如：将血红蛋白基因克隆到酿酒酵母中，由于表达的血红蛋白 存在，活跃了氧化还原过程的电子传递链，间接影响了线粒体的乙醛歧化途径；由于这条途径产生的乙醇占总量的 1/3，因此可显著提高乙醇产量。6 6、次级代谢的反馈调节类型、次级代谢的反馈调节类型次级代谢产物的自身反馈抑制和反馈阻遏末端产物的反馈调节：青霉素、链霉素、氯霉素、嘌吟霉素、霉酚酸、杀真菌素等分解代谢产物调节：葡萄糖、氮分解代谢产物的抑制作用初级代谢产物的调节：两者-共同的合成途径，反馈抑制磷酸盐调节高浓度磷酸盐对抗生素等次级代谢产物的合成有较强的抑制作用。调节机制：抑制酶的作用、能荷变化、竞争金属离子7 7、代谢调控的内容、代谢调控的内容代谢反应的协调是通过细胞自身的代谢调控系统对细胞机能实行精细控制来达到的。但在工业生产中却往往需要单一地积累某种产品，要达到过量积累某种产品的目的，提高生产效率，就必须使原有的调节系统失去控制，在保证微生物适当生存的条件下，建立起新的代谢方式，使微生物的代谢产物按照人们的意志积累。代谢调节：改变发酵工艺条件（PH、温度、通气量、培养基组成）、微生物遗传特性等发酵条件的控制（1）发酵条件的控制；如 PH、温度、通气量、培养基组成（2）改变细胞透性改变细胞的通透-代谢产物分泌-避免末端产物反馈方法：限制生物素浓度、+青霉素、+表面活性剂、控制 Mn2+、Zn2+（3）菌种遗传特性的改变诱变育种-突变株-解除反馈调节-产量提高营养缺陷型突变、抗反馈调节突变、组成型突变、抗性突变等8 8、代谢工程的应用的三个方面、代谢工程的应用的三个方面代谢工程的目的在于构建具有新的代谢途径，能生产特定目的产物或具有过量生产能力的工程菌应用于工业生产。根据微生物的不同代谢特性，代谢工程的应用主要表现在以下三个方面：改变代谢途径、扩展代谢途径、构建新的代谢途径（1）改变代谢途径即改变分支代谢途径的流向或流量，阻断其他代谢产物的合成，达到提高目标产物的目的。（2）扩展代谢途径引入外源基因后，使原来的代谢途径向后延伸，产生新的末端产物，或使原来的代谢途径向前延伸，可以利用新的原料合成代谢产物。（3）转移或构建新的代谢途径将催化一系列生物反应的多个酶基因，克隆到不能产生某种新的化学结构的代谢产物的微生物中，使之获得产生新的化合物的能力；或利用基因工程手段，克隆少数基因，使细胞中原来无关的两条途径联结起来，形成新的代谢途径，产生新的代谢产物；或将催化某一代谢途径的基因组克隆到另一微生物中，使之发生代谢转移，产生目的产物。9 9、酶合成调节的机制并举例、酶合成调节的机制并举例酶合成的调节是一种通过调节酶的合成量进而调节代谢速率的调节机制，这是一种在基因水平上（在原核生物中主要在转录水平上）的代谢调节。第六章第六章培养基培养基促进剂促进剂：指那些非细胞生长所必需的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。抑制剂抑制剂：抑制某些代谢途径的进行，同时刺激另一代谢途径，以致可以改变微生物的代谢途径。孢子培养基孢子培养基：供菌种繁殖孢子的培养基，常用固体培养基。能使菌体迅速生长，产生较多优质孢子，且不易引起菌种发生变异。种子培养基种子培养基：供孢子发芽、生长和菌体繁殖的培养基。发酵培养基发酵培养基：供菌体生长、繁殖和合成大量代谢产物用的培养基。前体前体：指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而又较大的提高。1 1、营养物质的调节内容、营养物质的调节内容（1）不同碳源的利用速度速效碳源：微生物快速利用的碳源。反之为迟效碳源。利用速度：葡萄糖乳酸乳糖；单糖双糖和多糖（2）氮源利用及与碳源利用的关系利用速度：铵氮硝基氮；氨的浓度过高时会造成减产糖代谢的许多中间产物是氦基酸合成的前体：糖利用与氮源利用-正比（3）碳氮比例的调节碳源、氮源比例影响微生物的生长和发酵产物的积累控制碳氮比例：菌体的大量繁殖、大量形成产物（4）前体的控制影响前体利用：菌株、前体种类、使用方式、浓度、不断加入（5）补料中间补料丰富了培养基，起重要作用；补料包括：碳、氮、水及其他物质。第七章第七章 发酵工艺控制发酵工艺控制摄氧率（摄氧率（OUROUR）：单位时间内单位体积培养液中微生物摄取氧的量临界氧浓度临界氧浓度：当不存在其他限制性基质时，若溶氧浓度高于某定值，细胞的比耗氧速率保持恒定氧速率保持恒定；若溶氧浓度低于该值，细胞的比耗氧速率就会大大下降；则该值即为临界溶氧浓度。比耗氧速率比耗氧速率：相对于单位质量的干菌体在单位时间内消耗的氧量，也称呼吸强度氧传质方程氧传质方程：在稳定情况下，氧分子从气体主体扩散到液体主体的传递速率即氧的传质方程式为 OTR=KL a(C*CL)平汉塑性流体平汉塑性流体：主要特征是当剪应力小于屈服应力时，液体不发生流动，只有当剪应力超过屈服应力时才发生流动。它的流态曲线也呈直线，但不通过原点。拟塑性流体拟塑性流体：流体黏度随着剪应速率的增高而降低。流体的剪应力与剪切速率间不呈直线关系，而呈凸形曲线关系，表明剪切速率的增加，剪应力的增加随之减小，即增加流速会降低流体的粘性阻力凯松流体凯松流体：流体剪应力与剪切速率的关系表现为不通过原点的曲线。涨塑性流体涨塑性流体：流体黏度随着剪应速率的增加而增高。流体的剪应力与剪切速率间不呈直线关系，而呈凹形曲线关系，表明剪切速率的增加，剪应力也随之增加，流体的流动阻力随之加大。发酵热发酵热：发酵过程中释放出的净热量 Q 发酵=Q 生物+Q 搅拌Q 蒸发Q 显Q 辐射1 1、发酵热的测定方法、发酵热的测定方法（1）通过测定一定时间内冷却水的流量和冷却水的进出口温度，由下式求得这段时间内的发酵热：（2）通过罐温的自动控制，先使罐温达到恒定，再关闭自动控制装置测得温度随时间上升的速率2 2、温度对发酵的影响、温度对发酵的影响（1）温度微生物细胞生长的影响随着温度的上升，细胞的生长繁殖加快。（2）温度对产物形成的影响温度通过影响参与产物形成的酶的活性影响产物的形成。（3）温度影响发酵液的物理性质温度会影响发酵液的氧溶解度、基质的分解速率等（4）温度影响生物合成的方向如：四环素发酵中金色链霉菌同时能产生金霉素。在低于 30下，该菌合成金霉素能力较强；温度提高，合成四环素的比例提高；在温度达到 35时，则只产生四环素，金霉素的合成停止3 3、最适温度的选择、最适温度的选择最适温度是指在该温度下最适于菌的生长或产物的形成。选择最适发酵温度应考虑微生物生长的最适温度和产物合成的最适温度。（1）发酵过程中，在生长初期目的产物还未开始合成，菌体浓度较低，这时的温度应适于微生物的生长；到产物合成期，菌体已长到一定浓度，积累产物是重点考虑，此时应满足生物合成的最适温度。（2）温度的选择还要参考其它发酵条件灵活掌握通气条件：在通气条件差的情况下，最适的发酵温度应比在正常良好通气条件下低一些；这是由于在较低的温度下，氧溶解度相应大些，菌的生长速率相应小些，从而弥补可能因通气不足而造成的代谢异常。培养基成分和浓度：在使用较稀薄或较易利用的培养基时，提高培养温度则养料往往过早耗竭，导致菌丝过早自溶，使抗生素产量降低。4 4、温度的控制方法、温度的控制方法工业上使用大体积发酵罐的发酵过程，一般不须要加热，发酵热往往超过微生物的最适培养温度，需要冷却的情况较多，通常利用发酵罐的热交换装置进行降温。气温较高时，多采用冷盐水降温。常用方法：罐壁调温、夹层调温、罐内调温5 5、搅拌对、搅拌对 KLaKLa 的影响的影响（1）把从空气管中引入发酵罐的空气打成碎泡，增加气-液接触面积 a，即增加氧传递面积。（2）使液体形成涡流，从而延长气泡在液体中的停留时间。（3）增加液体湍流程度，降低气泡周围液膜阻力和液体主流中流体阻力，从而增大 KLa 值（4）减少菌丝结团现象，降低细胞壁表面的液膜阻力，使培养液成分和细胞均匀分布，有利于营养物质的吸收和代谢物的即使分散，同时降低细胞周围“废物”和“废气”的浓度，有利于微生物的代谢。过高的搅拌速度不但浪费动力，还会损伤菌体，引起菌体自溶及减产等。6 6、影响、影响 KLaKLa 的因素的因素（1）搅拌搅拌可从多方面改善通气效率；搅拌速率对 KLa 的影响很大，对微生物的摄氧率也有影响，但对 C*无影响。（2）空气流量 KLa 随空气速度的增加而增大，当空气速度超过“过载”速度后，KLa 并不随之而增加。（3）培养液性质发酵液物理性质的不断变化会影响气体的溶解度、发酵液中气泡的直径和稳定性及其合并为大气泡的速度等，发酵液的性质还影响液体的湍动以及界面或液膜的阻力，因而显著地影响氧的传递效率。（4）微生物生长的影响微生物通过影响培养液的性质进而影响氧气的吸收。随着微生物浓度的升高，培养液的黏度增大，使对氧气的吸收能力降低（5）消泡剂的影响消泡试剂是表面活性物质，其分布在液气表面会增大传递阻力，使La 下降。使用表面活性剂尽管会引起溶解氧能力的暂时下降，但最终会有效改善发酵液的通气效率。（6）离子强度的影响电解质溶液气泡小，有较大的比表面积。KLa 值也比水中的大（7）其它因素：如空气分布器和发酵液高度7 7、影响微生物需氧量的因素、影响微生物需氧量的因素（1）微生物种类种类不同，其生理特性不同，代谢活动中的需氧量也不同（2）培养基的组成与浓度培养基的组成对菌种的需氧量有显著的影响，碳源的种类和浓度影响尤为显著。一般而说，碳源浓度在一定范围内，需氧量随碳源浓度的增加而增加。（3）菌龄不同菌种需氧量情况各异；同一菌种不同菌龄，其需氧程度也不同；一般菌龄低者，呼吸强度高。例如；菌龄为 24 小时的产黄青霉呼吸强度最高（4）培养条件 pH、温度等一般温度愈高，营养越丰富，临界值也相应越高（5）有毒产物的形成及积累 CO2 是菌体代谢产生的气态终产物，它的生成与菌体的呼吸作用密切相关，发酵过程中不及时将培养液中的 CO2 排出，势必影响菌的呼吸，进而影响菌的代谢。8 8、PHPH 值对发酵菌的影响值对发酵菌的影响（1）pH 影响菌体的生长繁殖：当 pH 抑制菌体中某些酶的活性时，使菌体的新陈代谢受阻（2）pH 影响微生物细胞膜所带电荷的状态，从而改变细胞膜的渗透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的排泄，因此影响代谢的正常进行。（3）影响培养基某些组分和中间产物的稳定性，从而影响微生物对这些物质的利用。（4）pH 不同影响生物合成途径，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。9 9、最佳、最佳 PHPH 值的控制值的控制（1）在基础培养基配方中考虑到维持 pH 的需要：例如加 CaCO3，使用缓冲液等（2）通过补加酸、碱来调节控制（3）通过中间补料来控制例如改变加糖速率来控制 pH,也可中间补加尿素或硫酸铵等调节1010、二氧化碳对发酵的影响、二氧化碳对发酵的影响（1）二氧化碳是微生物的代谢产物，同时也是某些合成代谢的基质（2）对菌体的生长具有抑制作用对发酵也有影响，一定浓度的二氧化碳对发酵产物有刺激或者抑制作用（3）主要影响细胞膜的结构，CO2 主要作用于细胞膜的脂质核心部位，HCO3-则影响细胞膜的膜蛋白。（4）CO2 除影响菌体生长、形态及产物合成外，还影响酸碱平衡，形成碳酸盐沉淀，溶氧浓度下降。1111、化学消泡的消泡机理和种类、化学消泡的消泡机理和种类（1 1）机理）机理降低泡沫的机械强度，使泡沫破裂当泡沫表层存在着由极性的表面活性物质形成的双电层时，可以加入另一种具有相反电荷的表面活性剂，以降低泡沫的机械强度；或加入某些具有强极性的物质与发泡剂争夺膜上的空间，降低液膜强度，使泡沫破裂。降低液膜的表面黏度，使液膜的液体流失，导致泡沫破裂当泡沫的液膜具有较大的表面黏度时，可以加入某些分子内聚力较小的物质，以降低液膜黏度（2 2）种类）种类 天然油脂：常用豆油、玉米油、米糠油（能兼作碳源）聚醚类：聚氧丙烯甘油、聚氧乙烯氧丙烯甘油 高级醇类：主要是十八醇 硅酮类：聚二甲基硅氧烷1212、泡沫对发酵的危害、泡沫对发酵的危害（1）过多的泡沫若不加控制会引起逃液现象，造成损失（2）发酵为了留出容纳泡沫的空间，必须降低发酵罐的装料系数，0.6-0.7（3）泡沫增加了杂菌污染的机会（4）泡沫中的气体不容易被带走，妨碍了菌体呼吸第八章第八章 发酵过程的参数检测和自动控制发酵过程的参数检测和自动控制离线测量离线测量：在发酵罐外进行样品的处理和分析测量就地信号系统就地信号系统：对发酵过程不发生影响，pH、溶解氧浓度、罐压在线测量系统在线测量系统：利用连续的取样系统与相关的分析器联接，取得测量信号。气体分析器、培养液挥发成分分析系统、流动注射式分析器。自适应控制自适应控制：须提取有关的输入、输出信息，对模型和参数不断进行辨识，使模型逐渐完善，同时自动修改控制器的控制动作，使之适应于实际过程反馈控制反馈控制：根据系统输出变化的信息来进行控制即依据结果进行控制基本的自动控制：基本的自动控制：指在没有人直接参与的情况下，利用外加的设备或装置，使机器、设备或生产过程的某个工作状态或参数自动地按照预定的规律运行1 1、发酵过程的自动控制三方面、发酵过程的自动控制三方面（1）与发酵过程的未来状态相联系的控制目标：如温度、pH、生物量等；（2）一组可供选择的控制动作：如阀门的开或关、泵的开与停等；（3）能够预测控制动作对过程状态影响的模型（数学表达式）2 2、发酵过程的参数分类及内容、发酵过程的参数分类及内容（1）直接参数 物理参数：温度、压力、搅拌速度、通气流量、泡沫水平、生物热、黏度 化学参数：pH、溶氧浓度、溶解 CO2 浓度、碳/氮源含量、代谢物浓度（2）间接参数：摄氧率 OUR、CO2释放率 CER3 3、发酵过程的参数检测形式、发酵过程的参数检测形式发酵过程的参数可以通过传感器或其他检测系统，以各种方式把非电量信号转换成电量信号变化，方便的通过二次仪表显示、