肥达试验和沉淀反应实验报告.pdf

实验报告实验报告实验名称实验名称院院系系姓姓名名肥达试验肥达试验专专业业学学号号实验日期实验日期班班级级一、实验目的一、实验目的学会肥达反应的原理、方法以及结果分析。理解肥达反应在伤寒和副伤寒杆菌感染检测中的应用。二、实验器材二、实验器材试剂试剂：生理盐水、患者血清、伤寒杆菌H 菌液、伤寒杆菌O 菌液、甲型副伤寒杆菌H 液、乙型副伤寒杆菌 H 菌液器材器材：水浴锅、冰箱、小试管 32 支、试管架、记号笔、移液枪三、实验原理三、实验原理1.伤寒杆菌有三种抗原：分别为菌体抗原（O 抗原）、鞭毛抗原（H 抗原）、体表抗原（Vi抗原）。其中以 O 抗原及 H 抗原的抗原性较强，而 Vi 抗原的抗原性不强，且相应抗体效价低且为时短暂，随细菌的消除而消失，故不列为肥达试验的检测项目。（但其检查有助于发现伤寒带菌者。）当抗原遇到特异性抗体（抗O 及抗 H）时，便会发生凝集反应，通过对凝集物量多少来推算病人体内抗体的多少，以协助诊断、治疗及判断预后。2.用已知的伤寒沙门菌菌体（O）抗原和鞭毛（H）抗原，以及引起副伤寒的甲型副伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌 H 抗原的诊断菌液与受检血清做试管或微孔板凝集实验，测定受检血清中有无相应抗体及其效价的试验。四、实验过程及步骤四、实验过程及步骤1.取清洁小试管 32 支，分成 4 排，每排 8 支，依次编号。2.32 支小试管，用移液枪各注入0.5ml 生理盐水。3.第一管内加入 1：10 稀释的患者血清 0.5ml，用 1ml 吸管吹吸三次，混匀，吸出 0.5ml 注入第二管作对倍稀释，依次稀释至第7 管，弃去 0.5ml，第 8 管为对照。第二排、第三排、第四排以相同步骤加入患者血清。4.第一排各管内注入伤寒杆菌H 菌液 0.5ml；第二排各管注入伤寒杆菌O 菌液 0.5ml；第三排各加入甲型副作寒杆菌H 液 0.5ml；第四排各管加入乙型副伤寒杆菌H 菌液 0.5ml。5.置于 56水浴箱 24 小时。6.放冰箱过夜或放 37水浴箱 18 小时后观察结果。7.结果观察最强:上液澄清，细菌全部凝集沉淀于管底。强：上液轻度混浊，细菌大部分凝集沉淀于管底。弱：上液混浊，细菌少部分凝集。不凝：液体呈乳状与对照管相同。五、实验总结五、实验总结1.结果与分析：先观察对照管，正确结果应无凝集现象，再观察各试验管的凝集现象，凝集程度以“+”多少表示之。（+）最强，上液澄清，细菌全部凝集沉淀于管底。（+）强，上液轻度混浊，细菌大部分凝集沉淀于管底。（+）弱，上液混浊，细菌少部分凝集。（-）不凝，液体呈乳状与对照管相同。效价判定：以能出现“+”凝集现象的血清最高稀释度为该血清的凝集效价。一般认为 O 抗体效价在 1：80 以上，H 抗体效价在 1：160 以上，有辅助诊断意义。H甲或 H乙达到 1：80 或以上具有诊断意义。但在分析结果时，应注意以下两点：（1）非肠热症患者，由于曾接种过伤寒，副伤寒疫苗或以往在流行区有过隐性感染或患过伤寒，副伤寒，以及回忆反应等原因，也可呈现阳性结果。不过，由这些原因所引起的阳性反应主要是 H 抗体升高，O 抗体效价一般不高，同时，每隔 57 天试血一次，其抗体效价一般不会随病程而升高。上述这些都有别于现症感染。（2）少数肠热症患者，由于发病初期曾使用大量抗生素，或机体有免疫缺陷病，或机体反应性极弱等原因，抗体效价可以很低，甚至为阴性结果。因此不能只根据肥达氏试验的结果去作简单肯定或否定的结论，必须结合当地流行情况，既往接触史，以及临床症状和体征，做出正确的判断。2.肥达反应的诊断标准：肥达反应是诊断伤寒副伤寒的辅助诊断，其结果的解释必须结合临床变现和病程，病史，以及地区流行病学情况。机体患伤寒、副伤寒，一般于发病后 12 周内血液中出现特异性抗体并且随着病程延长而效价渐升，此时即可为阳性，第4 周可达峰值，以后又逐渐降低。一般以“O”凝集效价在 1/80 或以上和H”在 1/160 或以上为阳性。O 抗体主要是 IgM,出现较早；H 抗体主要是 IgG,出现较晚。根据此特点，肥达试验结果有如下诊断价值：二者均超过正常值，患伤寒的可能性大；二者均在正常值内，患伤寒的可能性小；H 抗体效价超过正常值，O 抗体效价正常，可能是接种了伤寒菌苗或者是接种的回忆反应；O 抗体效价超过正常值，H 抗体效价正常，可能是伤寒早期或者其他沙门氏菌感染；一般间隔 12 周复查，若抗体效价比前次结果增高24 倍，则具有诊断价值。六、教师评价六、教师评价实验报告实验报告实验名称实验名称院院系系姓姓名名沉淀反应沉淀反应专专业业学学号号实验日期实验日期班班级级一、实验目的一、实验目的掌握对流免疫电泳的原理和方法，了解其用途。二、实验器材二、实验器材器材器材：电子天平、锥形瓶、200ml 量筒、药匙、称量纸、水浴锅、微波炉、洗耳球、玻片、移液管、废液缸、打孔器、胶头滴管、移液枪、镊子、纱布条、电泳槽试剂试剂：pH8.6 0.05mol/L 巴比妥缓冲液、琼脂粉三、实验原理三、实验原理1.对流免疫电泳也称反向免疫电泳或免疫电渗电泳，其实质是定向加速的电泳技术与免疫双扩散技术的结合。抗原和抗体在一定的 pH 条件下，由于带电荷量的多少及分子量大小不同，在电场中以不同的速度作定向移动。在pH8.6 的缓冲液中，多数蛋白质抗原物质带负电荷，在电场作用下向阳极移动；而其抗体大多为球蛋白，等电点较高，带负电荷较少，且分子量较大，电泳速度慢，受电渗作用影响向负极移动。由于抗原抗体孔相对排列，当两者比例适当时，特异性抗原抗体互相结合形成肉眼可见的白色沉淀线。同时，由于电场限制了抗原抗体分子的自由扩散，从而提高了试验的敏感性，且缩短了试验时间。此法可用于抗原或抗体的快速诊断。但缺点是分辨力低，较复杂的抗原抗体系统不宜用此法。2.在一定温度和电解质存在的条件下，可溶性抗原与相应抗体在比例合适处形成肉眼可见的沉淀线，称为沉淀反应(precipitationreaction)。参与反应的抗原称为沉淀原，抗体称为沉淀素。可溶性沉淀原分子小，单位体积内所含的抗原量多，与抗体结合的总面积大，故试验时需对抗原进行稀释，确保抗原与抗体以合适的比例结合，并以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价。目前广泛应用的沉淀反应是凝胶免疫扩散(Agargelimunodiffusion)。在凝胶内电解质的参与下，特异性抗原、抗体在凝胶内扩散并相遇，免疫复合物在最适比例处（在平衡区带，即抗体决定簇的数目等于抗原决定簇数目时）发生沉淀。常用的12琼脂凝胶形成的构架网孔较大，允许分子量在 20 万以下的物质（如绝大多数可溶性抗原和抗体）通过，在凝胶中自由扩散。而免疫复合物因颗粒较大不扩散，形成沉淀线。这种沉淀线是一组抗原抗体的特异性复合物。如果凝胶中有多种不同抗原抗体存在时，便依各自扩散速度的差异，在适当部位形成独立的沉淀线，因此广泛地用于抗原成分的分析。琼脂扩散试验可根据抗原抗体反应的方式和特性分为单向免疫扩散、双向免疫扩散、免疫电泳、对流免疫电泳、火箭电泳、免疫固定电泳等试验。以下为对流免疫电泳测定血清中的AFP。四、实验过程及步骤四、实验过程及步骤任务一：制备巴比妥琼脂板任务一：制备巴比妥琼脂板1.电子天平称取 0.500g 琼脂粉，加入锥形瓶，用量筒量取50mlpH8.6 0.05mol/L 巴比妥缓冲液加入锥形瓶。混匀后微波炉加热2 分钟。再放入 56恒温水浴锅中。（0.05ml/LpH8.6 巴比妥缓冲液的配制方法：巴比妥-1.84g；巴比妥钠-10.3g；加蒸馏水至1000ml）2.取 4.5ml 已融化的 1%巴比妥琼脂溶液滴于载玻片上提示：（1）所用载玻片要洁净、边缘无破损，否则难以浇制琼脂板，可用75乙醇冲洗干净，晾干备用。（2）吸取琼脂溶液的量，太少不能铺满整张玻片，太多将溢出玻片，都会导致琼脂板制备失败。（3）浇制琼脂板时动作要迅速，过于缓慢容易边加边凝，使琼脂板凹凸不平。任务二：打孔任务二：打孔1.待琼脂板凝固后在琼脂板中间部分打四个孔，孔径3mm，孔距10mm。在左上角打一个孔作为标记。用胶头滴管吸去空上废液。提示：（1）打孔时要小心，勿使琼脂层脱离载玻片或琼脂板底层开裂，以免加样时顺裂缝或底部散失。一旦出现裂缝或脱离现象，可向孔内滴加少许温琼脂加以弥补或将琼脂板在火焰高处来回通过几次补底。（2）在琼脂板左上角打上标记孔，有助于确定正负极方向和样本上样位置，通常情况下，有标记孔侧，放置于正极端。任务三：加样任务三：加样1.如下图所示加样，用移液枪每个孔加10 微升对应液体：C：人待测血清；D：人阳性血清；E：抗人血清抗体/诊断血清提示：（1）抗原和抗体在一定的 pH 条件下，由于带电荷量的多少及分子量大小不同，在电场中以不同的速度作定向移动。在 pH8.6 的缓冲液中，多数蛋白质抗原物质带负电荷，在电场作用下向阳极移动，而其抗体大多为Y 球蛋白，等电点较高，带负电荷较少，且分子量较大，电泳速度慢，受电渗作用影响向负极移动。（2）加样时勿使样品外溢或在边缘残存小气泡，以免影响扩散结果。（3）抗原、抗体的量应相接近时容易出现沉淀带，反之不易发生，如抗原过多，可造成假阴性结果，可通过稀释抗原加以解决。任务四：正确放置琼脂板至电泳槽任务四：正确放置琼脂板至电泳槽1.向电泳槽中加入约2/3体积的pH8.6 0.05mol/L巴比妥溶液，将加好样的琼脂板放入电泳槽，有标记孔的一侧放在正极端。2.用纱布条搭在琼脂板两侧，以便电泳。提示：（1）电泳时抗原、抗体电极方向不可放反。（2）搭桥时应注意与凝胶接触紧密，否则会使电流不均匀，致使沉淀线歪斜、不均匀。任务五：确定电泳电压任务五：确定电泳电压1.设置电泳仪 Us=6V，Is=4mA，Ts=60：00提示：电压、电流增大时，电泳时间可更短。但电压过高则孔径变形，可将琼脂融化，电流过大抗原抗体蛋自易变性，干扰实验结果；电压过低时沉淀线出现的时间会延长。五、实验总结五、实验总结1.待测孔与抗血清之间出现白色沉淀线为阳性，不出现白色沉淀线为阴性。如沉淀线不清晰，可把琼脂板放在湿盒中 37数小时或置电泳槽中过夜再观察。六、教师评价六、教师评价