遗传病的分析扩增产物的鉴定精品文稿.ppt

遗传病的分析 扩增产物的鉴定第1页，本讲稿共15页限制性内切酶酶切技术限制性内切酶酶切技术 琼脂糖凝胶电泳技术琼脂糖凝胶电泳技术第2页，本讲稿共15页一、限制性内切酶酶切技术一、限制性内切酶酶切技术第3页，本讲稿共15页原原 理理限制性内切酶大多由大肠杆菌中提取纯化限制性内切酶大多由大肠杆菌中提取纯化得到，能特异性识别和切割双链得到，能特异性识别和切割双链DNA分子分子中的特异序列（一般识别中的特异序列（一般识别46个核苷酸序个核苷酸序列）列）由于大多数内切酶具绝对的位点特异性，由于大多数内切酶具绝对的位点特异性，因此可以选择合适的内切酶切割扩增产物，因此可以选择合适的内切酶切割扩增产物，通过片段大小鉴定基因是否有缺失或缺陷。通过片段大小鉴定基因是否有缺失或缺陷。第4页，本讲稿共15页原原 理理 本实验使用限制性内切酶（本实验使用限制性内切酶（Lwe I），酶切位点：酶切位点：5.GCATC(N)53 3.CGTAG(N)9.5 正常人样品具有酶切位点，能够被酶切开，正常人样品具有酶切位点，能够被酶切开，分成分成2个片断；而病人组个片断；而病人组G则被则被A替代，酶切替代，酶切位点丧失，不能被酶所切动，所以还是个位点丧失，不能被酶所切动，所以还是个片断。片断。第5页，本讲稿共15页器材与试剂器材与试剂高速离心机、恒温水浴箱、移液枪、高速离心机、恒温水浴箱、移液枪、枪头、塑料离心管等枪头、塑料离心管等Lwe I限制性内切酶、三蒸水、缓冲限制性内切酶、三蒸水、缓冲液等液等第6页，本讲稿共15页操操 作作1、取样品、取样品2份（病人、正常人份（病人、正常人PCR扩增产物）扩增产物）无菌无菌ddH2O 14ul 缓冲液缓冲液10 2ul 扩增产物扩增产物 3.5ul 内切酶内切酶 0.5ul2、置、置37oC水浴水浴3h（或过夜）（或过夜）20ul混匀混匀第7页，本讲稿共15页注意事项注意事项内切酶需在内切酶需在20环境中保存。环境中保存。内切酶活性的发挥需要内切酶活性的发挥需要Mg2。为使酶反应时达到最佳条件，需使用生产为使酶反应时达到最佳条件，需使用生产厂商提供的反应条件或缓冲液。厂商提供的反应条件或缓冲液。第8页，本讲稿共15页二、琼脂糖凝胶电泳技术二、琼脂糖凝胶电泳技术第9页，本讲稿共15页原原 理理溴化乙啶（溴化乙啶（溴化乙啶（溴化乙啶（EBEB）是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于）是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于）是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于）是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖凝胶中的观察琼脂糖凝胶中的观察琼脂糖凝胶中的观察琼脂糖凝胶中的DNADNA。EBEB用标准用标准用标准用标准302nm 302nm 紫外光透紫外光透紫外光透紫外光透射仪激发并放射出橙红色信号，可用带射仪激发并放射出橙红色信号，可用带射仪激发并放射出橙红色信号，可用带射仪激发并放射出橙红色信号，可用带CCDCCD 摄像头的凝胶摄像头的凝胶摄像头的凝胶摄像头的凝胶成像处理系统拍摄。成像处理系统拍摄。成像处理系统拍摄。成像处理系统拍摄。一定量的一定量的一定量的一定量的DNADNA加入琼脂糖凝胶，能与凝胶中的加入琼脂糖凝胶，能与凝胶中的加入琼脂糖凝胶，能与凝胶中的加入琼脂糖凝胶，能与凝胶中的EBEB结结结结合，在合，在合，在合，在TAETAE介质溶液中，进行电泳。由于电场作用，介质溶液中，进行电泳。由于电场作用，介质溶液中，进行电泳。由于电场作用，介质溶液中，进行电泳。由于电场作用，DNADNA分子会从分子会从分子会从分子会从负负负负极向极向极向极向正正正正极泳动，分子量小的泳动在前，极泳动，分子量小的泳动在前，极泳动，分子量小的泳动在前，极泳动，分子量小的泳动在前，大的在后，形成不同的大的在后，形成不同的大的在后，形成不同的大的在后，形成不同的DNADNA条带。此时用紫外透射仪条带。此时用紫外透射仪条带。此时用紫外透射仪条带。此时用紫外透射仪可以检测之。可以检测之。可以检测之。可以检测之。以标准以标准以标准以标准MarkerMarker为参照物，可以得知被检为参照物，可以得知被检为参照物，可以得知被检为参照物，可以得知被检DNADNA的大小。的大小。的大小。的大小。第10页，本讲稿共15页器材与试剂器材与试剂紫外透射仪、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪、电泳仪、电泳槽、凝胶板、凝胶梳、橡皮膏、薄膜、凝胶板、凝胶梳、橡皮膏、薄膜、移液枪、枪头、塑料离心管等移液枪、枪头、塑料离心管等1琼脂糖（含琼脂糖（含EB）、）、DNA样品、标准样品、标准Marker、溴酚蓝溶液、溴酚蓝溶液、TAE缓冲液等缓冲液等第11页，本讲稿共15页操操 作作1 1、制备、制备、制备、制备1%1%凝胶板：凝胶板：凝胶板：凝胶板：配置好的琼脂糖溶液加热溶解后，至配置好的琼脂糖溶液加热溶解后，至配置好的琼脂糖溶液加热溶解后，至配置好的琼脂糖溶液加热溶解后，至50-60 50-60 时，浇板；时，浇板；时，浇板；时，浇板；冷却后，置电泳槽内，并轻轻拔出梳子。冷却后，置电泳槽内，并轻轻拔出梳子。冷却后，置电泳槽内，并轻轻拔出梳子。冷却后，置电泳槽内，并轻轻拔出梳子。2 2、制备上样样品、制备上样样品、制备上样样品、制备上样样品3 3份（份（份（份（MarkerMarker、病人及正常人酶切产物）：、病人及正常人酶切产物）：、病人及正常人酶切产物）：、病人及正常人酶切产物）：每份样品在塑料薄膜上加：每份样品在塑料薄膜上加：每份样品在塑料薄膜上加：每份样品在塑料薄膜上加：溴酚蓝溶液溴酚蓝溶液溴酚蓝溶液溴酚蓝溶液 6 1ul6 1ul 样品样品样品样品 ulul3 3、点样：、点样：、点样：、点样：吸取混合好的上样样品，轻轻加入琼脂糖凝胶孔内。吸取混合好的上样样品，轻轻加入琼脂糖凝胶孔内。吸取混合好的上样样品，轻轻加入琼脂糖凝胶孔内。吸取混合好的上样样品，轻轻加入琼脂糖凝胶孔内。4 4、电泳：、电泳：、电泳：、电泳：接通电源（接通电源（接通电源（接通电源（80mA80mA），约），约），约），约30min30min。5 5、鉴定：、鉴定：、鉴定：、鉴定：取凝胶置紫外透射仪察看、照相、分析。取凝胶置紫外透射仪察看、照相、分析。取凝胶置紫外透射仪察看、照相、分析。取凝胶置紫外透射仪察看、照相、分析。混匀混匀第12页，本讲稿共15页结结 果果第13页，本讲稿共15页注意事项注意事项 溴化乙啶（溴化乙啶（EB）是强诱变剂，）是强诱变剂，具有高致癌性！具有高致癌性！第14页，本讲稿共15页定义：定义：细胞培养细胞培养细胞培养细胞培养细胞分裂指数细胞分裂指数细胞分裂指数细胞分裂指数细胞活率细胞活率细胞活率细胞活率细胞的生长曲线细胞的生长曲线细胞的生长曲线细胞的生长曲线细胞周期细胞周期细胞周期细胞周期细胞培养的生命周期细胞培养的生命周期细胞培养的生命周期细胞培养的生命周期细胞系、细胞株细胞系、细胞株细胞系、细胞株细胞系、细胞株细胞细胞细胞细胞“代代代代”微核微核微核微核系谱分析系谱分析系谱分析系谱分析第15页，本讲稿共15页