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免疫荧光技术 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望主要内容主要内容技术原理技术原理1实验流程实验流程2注意事项注意事项3常见问题常见问题4 免疫免疫荧荧光技光技术术(immunofluorescence)技术原理技术原理将免疫学方法免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧荧光光标记标记技技术术结合起来研究特异蛋白抗原在研究特异蛋白抗原在细细胞内分布胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，利用定量技术测定含量，从而可对抗原进行细细胞胞定性和定性和定位定位分析分析。根据实验方法分类：根据实验方法分类：直接法 间接法 补体法 其他补体法：补体法：利用补体反应，通过形成 抗原-抗体-补体复合物发射荧光。其他免疫荧光技术：其他免疫荧光技术：时间分辨免疫荧光分析 荧光偏振免疫分析技术时间分辨免疫荧光测定时间分辨免疫荧光测定时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）是一种非同位素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。荧光偏振免疫分析技术荧光偏振免疫分析技术荧光偏振免疫分析法(fluorescence polarization immunoassay，FPIA)是一种定量免疫分析技术，其基本原理是荧光物质经单一平面的蓝偏振光(485nm)照射后，吸收光能跃入激发态，随后回复至基态，并发出单一平面的偏振荧光(525nm)。偏振荧光的强弱程度与荧光分子的大小呈正相关，与其受激发时转动的速度呈反相关。FPIA最适宜检测小至中等分子物质，常用于药物、激素的测定。激光共聚焦扫描显微镜激光共聚焦扫描显微镜（Confocal laser scanning microscopeConfocal laser scanning microscope，CLSMCLSM）用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量,配合焦点稳定系统可以实现长时间活细胞动态观察。荧光显微镜的不足之处：荧光显微镜的不足之处：1、无法实现对荧光、透射光的同时采集，无法实现多重荧光的同时采集和共定位。2、荧光的散射光太强，造成实际分辨率的大大下降。3、荧光漂白及对细胞组织的照射损伤。4、无法对样品进行断层扫描，完成3D的工作。5、滤镜对荧光信号衰减大，灵敏度和荧光强度不够。6、可以观察活细胞和组织，但是细胞或组织内机构高度重叠。7、只能在二维坏境下观察。8、样品不能太厚。9、放大倍率小。荧光常见基础术语：荧光常见基础术语：荧光物质：荧光物质：某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比照射光长的光线，即荧光。受激发后能产生荧光的物质称为荧光物质或荧光素。激发光：激发光：能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线称为该荧光素的激发光。荧光探针：荧光探针：能产生荧光的特异性生物染料（PI，DAPI）、标有荧光素的特异性蛋白结合物（荧光抗体）。自发荧光：自发荧光：组织和细胞中某些成分受激发时可发出荧光，即自发荧光。漂白：漂白：荧光物质受激发时，其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失，即漂白现象。多激光器系统（多激光器系统（多通道激光检测多通道激光检测）：）：在可见光范围内使用多谱线氩离子激光器，发射波长为457nm、488nm和514nm的蓝绿光，氦氖绿HeNe（G）激光器提供发射波长为543nm的绿光，氦氖红HeNe（R）激光器发射波长为633nm的红光，新的405nm的半导体激光器的出现可以提供近紫外谱线。目前常用于标记抗体的荧光素有以下几种目前常用于标记抗体的荧光素有以下几种：异硫氰酸荧光异硫氰酸荧光(fluorescein isothiocyanate,FITC)FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。有两种异构体，其中异构体型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490495nm，最大发射光波长为520530nm，呈现明亮的黄绿色荧光黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。四乙基罗丹明四乙基罗丹明(rhodamine,RB200)RB200为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为 570nm，最大发射光波长为595600nm，呈现橘红色荧光橘红色荧光。四甲基异硫氰酸罗丹明四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethyl rhodamine isothiocynate,TRITC)TRITC为罗丹明的衍生物，呈紫红色粉末，较稳定。最大吸收光波长为 550nm，最大发射光波长为620nm，呈现橙红色荧光橙红色荧光，与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。因其荧光淬灭慢，也可用于单独标记染色。酶作用后产生荧光的物质酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如，4-甲基伞酮-D半乳糖苷受-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。其他如碱性磷酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基苯乙酸等。镧系镧系镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3）、铽（Tb3）、铈（Ce3）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3 应用最广。Eu3螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。藻红蛋白藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE）PE是在红藻中所发现的一种可进行光合作用的自然荧光色素，分子量为240kD的蛋白，最大吸收峰为564 nm，当使用488 nm激光激发时其发射荧光峰值约为576 nm，对于单激光器的流式细胞仪来说，推荐使用58521nm的带通滤光片，双激光器的流式细胞仪推荐使用57513nm的带通滤光片。FL2探测器检测PE。多甲藻叶多甲藻叶绿绿素蛋白素蛋白（PerCP）PerCP是在甲藻和薄甲藻的光学合成器中发现的，是一种蛋白复合物，分子量约为35kD，最大激发波长的峰值在490nm附近，当被488nm氩离子激光激发后，发射光的峰值约为677nm。FL3探测器检测PerCP。碘化丙碘化丙啶啶（propidium iodide，PI）可选择性地嵌入核酸（DNA、RNA）的双螺旋碱基对中。在对DNA染色时，需用RNase对细胞进行处理，以排除RNA对DNA荧光定量精度的影响。在488nm波长激发下，PI的发射光谱为610-620nm。FL2探测器检测PI。细细胞爬片免疫荧光实验胞爬片免疫荧光实验流程流程1.细胞爬片的制作；2.固定（4%的多聚甲醛）；3.细胞膜通透（0.5%Triton X-100，20min）；4.封闭（6%山羊血清，30min）；5.一抗孵育（一抗浓度，湿盒，4过夜，PBS漂洗）；6.二抗孵育（二抗种属，湿盒，室温1h，避光，PBS漂洗）；7.复染核（DAPI，避光，5min，PBS漂洗）；8.封片（荧光淬灭剂的封片液）；9.荧光显微镜下观察采集图像。1.1.细胞的固定细胞的固定【固定的定【固定的定义】将新鲜的活体组织或细胞，立即加入固定液中，以此使细胞保持原有形态、结构的一种方法。【固定的意【固定的意义】1、组织和细胞的蛋白质凝固，终止内源性或外源性酶反应，原位保存抗原，避免抗原失活或弥散。2、停止细胞中的生化反应，固定其中的各种生化物质状态，防止细胞死亡后出现自溶分解。3、使细胞中蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变为不溶性物质，以保持生前形态。4、固定细胞形态，防止其变形或破裂。5、使组织内各种物质产生不同的折光率，便于观察和鉴定。6、使不同组织成分对染料有不同的亲和力，便于染色。免疫免疫荧荧光光实验实验流程中一些注意事流程中一些注意事项【固定液的【固定液的选择】2 2、冰、冰冻冻切片制切片制备备：建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。3、血清封、血清封闭闭：为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清（与二抗来源一致）封闭，减弱背景着色。封闭是血清与非特异性位点结合，以消除非特异性染色，提高目的蛋白的准确性和降低背景。血清封闭的时间是可以调整的，一般30min。4、一抗孵育条件：、一抗孵育条件：在免疫荧光实验中最重要，包括孵育时间和抗体浓度；一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min；具体条件还要摸索。6、复染：、复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位；一般常用DAPI复染。7、封片：、封片：为了长期保存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液；避免产生气泡。5、二抗孵育条件：、二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索；而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度；切记要避光反应；但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间；最后，荧光素标记的二抗随着保存时间的延长，可能后有大量的游离荧光素残留，需要注意配制时小包装和并进行适当的离心。8、切片清洗：、切片清洗：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，一般在一抗的清洗是5min*3次；注意（1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。（2）温柔冲洗，防止切片的脱落；（3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。（4）PBS的PH和离子强度的使用和要求，建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。（中性及弱硷性条件（PH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解）9 9、拍照：、拍照：封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度；正确使用荧光显微镜，防止紫外线对眼睛的损害；检查时间每次以12h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现象；所以最多不得超过23h；荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。后欲再启用时，须待灯光充分冷却后才能点燃，一天中应避免数次点燃光源，关闭汞灯至少在开启15-30分钟后；时效性：标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发；使用的玻片等载体，都必须厚度均匀，无明显的自发荧光，如果使用油镜，还必须保证镜油为无荧光镜油；电源最好装稳压器，否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命，也会影响镜检的效果。免疫免疫荧荧光技光技术术常常见问题见问题1、石蜡切片和冰、石蜡切片和冰冻冻切片的比切片的比较较？（1）要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。（2）冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫荧光时不需抗原修复这一步。缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。当你买一抗时，目录上都写着做什么样的切片，如果它写着只能做冰冻，就不能做石蜡，如写着两者都可，那就都能做。（3）石蜡切片的优点可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温，而冰冻切片比较麻烦，一定要存在-80度的低温冰箱中。由于石蜡切片可以切到4微米左右，抗体容易渗透到组织中去，而且得到的颜色/形态都较冰冻切片好。2、一抗的、一抗的选择选择要点和技巧是什么？要点和技巧是什么？（1）单克隆和多克隆抗体的选择。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就像导弹精确地命中目标一样。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可以通过封闭等避免）。（2）应用范围的选择。有的一抗只能用于Western blotting，或免疫组化、免疫荧光、免疫沉淀等；甚至表明石蜡切片或冰冻切片。（3）种属反应性的选择（species reactivity）。这一点很重要，表明这种抗体可能存在种属差异，且这种抗体适合检测哪种种属动物体内的抗原。（4）种属来源，一般兔来源的多是多克隆；而小鼠来源的多是单克隆，但也有另外。根据此来源来选择相应的二抗。（5）生产厂家的选择。如santa Cruz公司抗体一般1ml，价格2100元左右；而chemicon公司一抗一般100ul，价格2800元左右。这两个厂家的同一种抗体它的实际效价稳定是不同的，我一般用后者抗体做免疫组化效果较好，而前者做Western blotting效果还可以。3、在什么情况下使用、在什么情况下使用Triton-X100（1）Triton X-100化学名称为聚乙二醇辛基苯基醚，是一种去污剂。在免疫组织化学（10um厚切片）和免疫细胞化学中一般用Triton X-100 作为细胞通透剂，在膜上打孔。（2）其作用原理：Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。（3）Triton X-100既是一种表面活性剂，也有抗氧化作用。4、封、封闭闭血清的血清的选择选择原原则则是什么？是什么？（1）膜上或切片上有剩余的位点可以非特异性吸附抗体，造成后续结果的假阳性！（2）封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合，否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合，会造成背景。（3）也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。5、抗体孵育条件的比、抗体孵育条件的比较较？（1）一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。（2）二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索。6、一抗、一抗4 4度孵育后度孵育后为为什么要什么要进进行行37度复温？度复温？（1）一方面，防止切片从4度直接放入PBS易脱片；（2）另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要，但对表达较弱的抗原可能有，4度和37度时分子运动方式不同，前者分子碰撞机率和运动速度小于后者，后者结合更快，但敏感性也提高了并易造成非特异染色。7 7、如何最大限度地降低如何最大限度地降低组织组织非特异性染色？非特异性染色？（1）缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条。（2）一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。（3）非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；（4）适当增加PBS冲洗次数和浸洗时间，在一抗、二抗孵育之后的浸洗尤为重要；（5）防止标本染色过程中出现干片，这容易增强非特异性着色。8 8、背景染色背景染色较较深的原因有哪些？深的原因有哪些？（1）抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。（2）抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。要根据染色结果进行调整。（3）组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细，采用DAKO笔或PAP Pen在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也能提高操作速度。（4）切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于24小时）：原因尚不清楚，但现象存在。如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太长。（5）一抗变质、质量差的多克隆抗体：注意抗体的有效期，过期的抗体要么不显色要么背景着色。用新买的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。9 9、做间接法免疫荧光染色，如何设置对照？做间接法免疫荧光染色，如何设置对照？最好是同一视野在未用荧光激发下进行对照，看是否非特异性染色。（1）空白对照：如果你做的是石蜡切片免疫荧光，这个对照必须有，目的是看自发荧光，脱蜡后直接在荧光显微镜下观察。（2）阴性对照：标本直接滴加二抗，呈阴性反应。（3）抗原对照：标本加同种动物的未免疫血清，以PBS冲洗后，在加抗免疫球蛋白荧光抗体。因未免疫动物的血清中无特异性抗体，应呈阴性反应。1010、免疫免疫荧光双染抗体的光双染抗体的选择注意哪些？注意哪些？THANK YOU！