不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳精.ppt

不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳第1页，本讲稿共11页实验原理实验原理电泳：电泳：带电粒子在电场中泳动的现象。带电粒子在电场中泳动的现象。泳动的速度取决于粒子带电的多少、泳动的速度取决于粒子带电的多少、分子的大小和形状分子的大小和形状聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳：被电泳的物质被电泳的物质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，分出的组分形成不在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，分出的组分形成不连续的圆盘形区带。连续的圆盘形区带。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳具有电泳和分子筛的双具有电泳和分子筛的双重作用。重作用。第2页，本讲稿共11页不连续体系：不连续体系：凝胶孔径大小不连续凝胶孔径大小不连续缓冲溶液成分和缓冲溶液成分和 pH pH 不连续不连续电场中形成电位梯度不连续电场中形成电位梯度不连续 样品在浓缩胶中，浓缩成很薄的区带，通过样品在浓缩胶中，浓缩成很薄的区带，通过3 3个物理效应，进行电泳分离。个物理效应，进行电泳分离。3个物理效应：个物理效应：浓缩效应、电荷效应、浓缩效应、电荷效应、分子筛效应分子筛效应实验原理实验原理小分子蛋白质在前，大分子蛋白质在后小分子蛋白质在前，大分子蛋白质在后电荷多蛋白质在前，电荷少蛋白质在后电荷多蛋白质在前，电荷少蛋白质在后第3页，本讲稿共11页操操 作作 步步 骤骤 一、制备凝胶一、制备凝胶 玻管直径玻管直径0.6cm，长，长10cm。底部用白色胶塞。底部用白色胶塞封口，中间用绿色胶塞固定封口，中间用绿色胶塞固定1.分离胶：过硫酸铵分离胶：过硫酸铵-TEMED系统，化学聚合系统，化学聚合依次加入依次加入 A:C:H:G 20mL 轻搅匀轻搅匀 2 4 4 10 mL沿管壁滴入封顶液沿管壁滴入封顶液X 3滴滴 15-20分成胶分成胶 甩去封顶掖甩去封顶掖(底部底部绿胶塞顶部绿胶塞顶部7cm）沿玻管壁加至绿胶塞顶部高度沿玻管壁加至绿胶塞顶部高度 第4页，本讲稿共11页2.浓缩胶：核黄素浓缩胶：核黄素-TEMED系统，光聚合系统，光聚合依次加入依次加入 B:D:E:F 8mL 轻搅匀轻搅匀 1cm/管管1 2 1 4 mL 封顶液封顶液X 3滴滴 垂直放入圆盘电泳仪孔中垂直放入圆盘电泳仪孔中 紫外线照射紫外线照射5-10分成胶分成胶 甩去封顶掖甩去封顶掖电极缓冲液电极缓冲液浓缩胶浓缩胶 1cm 分离胶分离胶 7cm 操操 作作 步步 骤骤 样品样品 绿色胶塞绿色胶塞 上电泳槽上电泳槽下电泳槽下电泳槽电极缓冲液电极缓冲液第5页，本讲稿共11页二、安装凝胶管二、安装凝胶管 1.去除白胶塞，将凝胶小玻管依次垂直安装去除白胶塞，将凝胶小玻管依次垂直安装注意：注意：不能漏水，上槽先加少许缓冲液不能漏水，上槽先加少许缓冲液M检漏检漏三、加样三、加样样品处理：样品处理：血清血清(生理盐水稀释生理盐水稀释)+甘油甘油+溴酚蓝溴酚蓝加样：加样：微量加样器沿壁加样微量加样器沿壁加样100微升微升操操 作作 步步 骤骤 2.电泳仪下槽加电极缓冲液，应浸没下槽电泳仪下槽加电极缓冲液，应浸没下槽在电泳仪上槽小孔内在电泳仪上槽小孔内,塞紧绿胶塞。塞紧绿胶塞。中的电极及小玻管的下端中的电极及小玻管的下端第6页，本讲稿共11页操操 作作 步步 骤骤 四、加电极缓冲液四、加电极缓冲液1.玻管凝胶样品上方，电极缓冲液玻管凝胶样品上方，电极缓冲液M沿壁缓慢沿壁缓慢2.上槽加电极缓冲液上槽加电极缓冲液M浸没玻管顶部及浸没玻管顶部及加入，封满玻管加入，封满玻管圆盘电泳仪盖上的电极圆盘电泳仪盖上的电极 第7页，本讲稿共11页操操 作作 步步 骤骤 五、通电五、通电电泳时间电泳时间1小时小时 绿胶塞下出现染料蓝色带绿胶塞下出现染料蓝色带 关电泳仪开关关电泳仪开关 拔电源插头拔电源插头 取下电极线取下电极线取玻管取玻管 倒去上槽中的缓冲液倒去上槽中的缓冲液通直流电通直流电.恒流恒流 接电极线接电极线 红红A黑黑 红红B黑黑+-下槽下槽 上槽上槽电压电压180-400v（自动，不用调）（自动，不用调）3mA/管，管，312管管=36mA 324管管=72mA 一拖二一拖二600v 100mA 恒流恒流 开开推进推进 推进推进 不推不推 推进推进 调整调整 调整调整mA 36 mA/72mA 电泳仪电泳仪第8页，本讲稿共11页六、固定、染色、脱色（集中进行）六、固定、染色、脱色（集中进行）长针头沿玻管壁插入凝胶中旋转打入长针头沿玻管壁插入凝胶中旋转打入下槽中下槽中的缓冲液的缓冲液，将凝胶滑入烧杯中，将凝胶滑入烧杯中固定：固定：在培养皿中，用固定液在培养皿中，用固定液N固定固定5-10分分操操 作作 步步 骤骤 染色：染色：倒去固定液，用染色液倒去固定液，用染色液O染色染色30秒秒脱色：脱色：倒去染色液倒去染色液自来水冲洗自来水冲洗洗脱液洗脱液P漂漂洗洗3-4次次底色浅，区带清晰底色浅，区带清晰无色透明凝胶无色透明凝胶 乳白色蛋白质带、染料的蓝色带乳白色蛋白质带、染料的蓝色带胶全黑胶全黑胶蓝色、蛋白质蓝黑色带胶蓝色、蛋白质蓝黑色带第9页，本讲稿共11页结果分析结果分析一、一、浓缩胶中的浓缩效应浓缩胶中的浓缩效应二、二、分离胶中的蛋白质分离分离胶中的蛋白质分离第10页，本讲稿共11页注注 意意 事事 项项 1.制备凝胶的高度，可用绿色胶塞固定位置制备凝胶的高度，可用绿色胶塞固定位置2.固定、染色、脱色：集中进行固定、染色、脱色：集中进行3.每台共用：分离胶每台共用：分离胶20mL、浓缩胶、浓缩胶8mL4.每人做每人做1支玻管支玻管(7cm分离胶分离胶+1cm浓缩胶浓缩胶+样品样品+电极缓冲液电极缓冲液)5.每台电泳槽可做每台电泳槽可做12支玻管支玻管第11页，本讲稿共11页