《基础微生物学》PPT课件.ppt

-Try-his+Try+his-Try+his+混合培养AB三、转导三、转导（transduction）等（等（1952）在）在Salmonella typhimurium（鼠伤寒沙门氏（鼠伤寒沙门氏菌）中发现的。菌）中发现的。1.转导及其发现转导及其发现AB-Try+his+Try-his+Try+his-定义：定义：以温和以温和噬菌体噬菌体为媒介，将供体媒介，将供体细胞的胞的DNA片段携片段携带到受体到受体细胞中，通胞中，通过交交换与整合，从而与整合，从而使后者使后者获得前者部分得前者部分遗传性状的性状的现象，称象，称为转导。获得新得新遗传性状的受体性状的受体细胞，称胞，称转导子。子。2.转导的种类转导的种类 完全普遍转导完全普遍转导 普遍转导普遍转导 流产普遍转导流产普遍转导 转导转导 低频转导低频转导 局限转导局限转导 高频转导高频转导（1）普遍性转导（普遍性转导（generalized transduction）定定义义：通通过过完完全全缺缺陷陷噬噬菌菌体体对对供供体体菌菌任任何何DNA小小片片段段的的“误误包包”而而实实现现其其遗遗传传性性状状传传递递至至受受体体菌菌的的转转导导现现象象，称称为为普普遍遍性性转导转导。完完全全(普普遍遍性性)转转导导：complete transduction。1952年年发发现现，在在Salmonella typhimurium中中存存在在转转导导现现象象。在在它它的的完完全普遍性转导实验中：全普遍性转导实验中：以其野生型菌株作为供体菌以其野生型菌株作为供体菌营养缺陷型菌株作为受体菌营养缺陷型菌株作为受体菌P22噬噬菌菌体体作作为为转转导导媒媒介介，对对供供体体菌菌是是烈烈性性噬噬菌菌体体，对对受受体体菌菌是是温温和和噬噬菌体菌体过程：过程：供体菌供体菌 正常噬菌体正常噬菌体+完全缺陷噬菌体完全缺陷噬菌体 少量裂解物少量裂解物+大量受体菌大量受体菌 遗传稳定的转导子遗传稳定的转导子裂解裂解完全普遍转导完全普遍转导（1）普遍性转导（普遍性转导（generalized transduction）过程：过程：P22在在供供体体菌菌内内增增殖殖时时，宿宿主主的的核核染染色色体体组组断断裂裂，待待噬噬菌菌体体成成熟熟与与包包装装之之际际，极极少少数数（10 6 10 8）噬噬菌菌体体的的衣衣壳壳将将与与噬噬菌菌体体头头部部核核心心大大小小相相似似的的一一段段供供体体DNA片片段段误误包包入入其其中中，形形成成了了一一个个完完全全不不含含噬噬菌菌体体自自身身DNA的缺陷噬菌体。的缺陷噬菌体。供供体体菌菌裂裂解解时时，如如把把少少量量裂裂解解物物与与大大量量受受体体菌菌群群体体相相混混，使使其其感感染染复复数数（）1，这这种种完完全全缺缺陷陷噬噬菌菌体体就就会会将将这这一外源一外源DNA片段导入受体细胞内。片段导入受体细胞内。在在这这种种情情况况下下，由由于于一一个个受受体体细细胞胞只只感感染染了了一一个个完完全全缺缺陷陷噬噬菌菌体体，故故受受体体细细胞胞不不会会发发生生往往常常的的溶溶原原化化，也也不不显显示示其其免免疫疫性性，更更不不会会裂裂解解和和产产生生正正常常的的噬噬菌菌体体；而而由由于于导导入入的的外外源源DNA片片段段可可与与受受体体细细胞胞核核染染色色体体组组上上的的同同源源区区段段配配对对，在在通通过过双双交交换换而而整整合合到到受受体体菌菌染染色色体组中，所以使后者成为一个体组中，所以使后者成为一个遗传性状稳定的转导子。遗传性状稳定的转导子。感染复数（，感染复数（，multiplicity of infection）:感染复数感染复数由于每一宿主细胞表面的特异性受体有限，由于每一宿主细胞表面的特异性受体有限，因此所能吸附的噬菌体数目也有一个限量。每一敏感细胞因此所能吸附的噬菌体数目也有一个限量。每一敏感细胞所能吸附的噬菌体的数量一般很大，可达所能吸附的噬菌体的数量一般很大，可达250360。由于超的外源噬菌体吸附而引起的、不能产生子代噬菌体由于超的外源噬菌体吸附而引起的、不能产生子代噬菌体的裂解，称为的裂解，称为自外裂解（自外裂解（lysis from without）。噬菌体裂解第一个宿主时可能有三种情况：噬菌体裂解第一个宿主时可能有三种情况：1 1）包入的完全是噬菌体的）包入的完全是噬菌体的DNADNA（正常噬菌体正常噬菌体）2 2）包入的完全是细菌）包入的完全是细菌DNADNA（完全缺陷噬菌体完全缺陷噬菌体）3 3）部分带有噬菌体基因的）部分带有噬菌体基因的DNADNA（部分缺陷噬菌体部分缺陷噬菌体）转导分别是由后两种噬菌体参与进行的。转导分别是由后两种噬菌体参与进行的。噬菌体裂解第一个宿主噬菌体裂解第一个宿主一个稳定的转导子的形成一个稳定的转导子的形成1.第一次交换2.第二次交换3.交换完成，外源DNA掺入染色体组中流产普遍性转导（流产普遍性转导（abortive transduction）概概念念：受受体体菌菌经经转转导导获获得得的的供供体体DNA片片段段在在受受体体菌菌中中不不发发生生配配对对、交交换换和和整整合合，也也不不迅迅速速消消失失，而而只只是是进进行行转转录录和和转转译译（性状表达），这种现象就称为（性状表达），这种现象就称为流产转导流产转导。现现象象：发发生生流流产产转转导导的的细细胞胞在在其其进进行行细细胞胞分分裂裂后后，只只能能将将这这段段外外源源DNA分分配配给给一一个个子子细细胞胞，而而另另一一子子细细胞胞仅仅获获得得供供体体基基因因的的产产物物酶酶，在在表表型型上上表表现现出出轻轻微微的的供供体体菌菌特特征征，每每经经过过一次分裂，就受到一次稀释，一次分裂，就受到一次稀释，所以，能在选所以，能在选择性培养基平择性培养基平板上形成微小板上形成微小菌落就是流产菌落就是流产转导的特点。转导的特点。2.局限性转导局限性转导定定义义：通通过过部部分分缺缺陷陷的的温温和和噬噬菌菌体体把把供供体体菌菌的的少少数数特特定定基基因因携携带带到到受受体体菌菌中中，并并获获得得表表达达的的转转导导现现象。象。特点特点：噬菌体对供体菌和受体菌都是温和噬菌体噬菌体对供体菌和受体菌都是温和噬菌体只只能能转转导导供供体体菌菌的的个个别别特特定定基基因因（一一般般为为噬噬菌菌体体整整合合位位点两侧的基因）点两侧的基因）该特定基因由该特定基因由部分缺陷的噬菌体部分缺陷的噬菌体携带携带缺缺陷陷噬噬菌菌体体使使由由于于其其在在形形成成过过程程中中所所发发生生的的低低频频率率（约约10 5）“误误切切”，或或由由于于双双重重溶溶源源菌菌的的裂裂解解而而形形成成（约形成（约形成50%缺陷噬菌体）缺陷噬菌体）分类分类：低频转导与高频转导：低频转导与高频转导转导的过程转导的过程该溶源菌被诱导裂解时，有极少该溶源菌被诱导裂解时，有极少数（数（10 5）的前噬菌体）的前噬菌体（prophage）发生不正常切离发生不正常切离（abnormal excesion），），其结果其结果会将插入位点两侧之一的少数宿会将插入位点两侧之一的少数宿主基因（如主基因（如 前噬菌体的两侧分前噬菌体的两侧分别为发酵半乳糖的别为发酵半乳糖的gal基因或合基因或合成生物素的成生物素的bio基因基因）连接到噬）连接到噬菌体菌体DNA上（而噬菌体也将相上（而噬菌体也将相应的一段应的一段DNA遗留在宿主的染遗留在宿主的染色体组上），通过衣壳的色体组上），通过衣壳的“误包误包”，就形成了一种特殊的噬菌体，就形成了一种特殊的噬菌体缺陷噬菌体（缺陷噬菌体（defective phage）。）。它们没有将宿主溶源它们没有将宿主溶源化的能力，而是使宿主成为一个化的能力，而是使宿主成为一个局限转导子，对局限转导子，对 噬菌体没有免噬菌体没有免疫性。疫性。温和噬菌体感染受体菌后，其温和噬菌体感染受体菌后，其DNA会开环，以线状形式整合到宿主染色体的特定会开环，以线状形式整合到宿主染色体的特定位点上，从而使宿主细胞发生溶源化，并获得对相同温和噬菌体的免疫性。位点上，从而使宿主细胞发生溶源化，并获得对相同温和噬菌体的免疫性。一一般般的的转转导导现现象象中中，从从宿宿主主染染色色体体上上切切离离时时发发生生不不正正常常切切离离的的频频率率极极低低，故故这这种种裂裂解解物物中中的的部部分分缺缺陷陷噬噬菌菌体体的的比比例例是是极极低低的的（10 4 10 6）。把把这这种裂解物称为种裂解物称为LFT（低频转导）裂解物（低频转导）裂解物。用用LFT裂裂解解物物以以低低 m.o.i（感感染染复复数数）感感染染宿宿主主，就可获得极少量的局限转导子，即低频转导。就可获得极少量的局限转导子，即低频转导。低频转导（低频转导（LFT，low frequency transduction）E.coli K12()gal+(供体菌供体菌)(大量大量)+dgal+（10-5）E.coliK12Sgal-(受体菌受体菌)E.coliK12Sgal-/dgal+E.coliK12Sgal-/dgal+/12Sgal-/dgal+/（双重容源菌供体）（双重容源菌供体）(50%)+dgal+（50%）12Sgal-(受体菌受体菌)12Sgal-/dgal+（转导子）转导子）（双重容源（双重容源转导子）转导子）高频转导和低频转导图解高频转导和低频转导图解低频转导高频转导U.V.U.V.双重容源菌双重容源菌【E.coliK12(/dg)】转导噬菌体（转导噬菌体（dg）+辅助噬菌体（辅助噬菌体（）转导子菌落转导子菌落噬菌斑噬菌斑U.V.附附当当用用LFT裂裂解解物物以以高高m.o.i 感感染染E.coli gal（不不发发酵酵半半乳乳糖糖的的营营养养缺缺陷陷型型）菌菌株株时时，凡凡是是感感染染有有dgal噬噬菌菌体体任任一一细细胞胞，几几乎乎都都同同时时感感染染有有正正常常的的 噬噬菌菌体体。这这时时 与与dgal同同时时整整合合在在一一个个受受体体菌菌的的核核染染色色体体组组上上，从从而而使使它它成成为为一一个个双双重重溶溶源源菌菌（double lysogen）。当当双双重重溶溶源源菌菌被被紫紫外外线线等等诱诱导导时时，其其中中的的正正正正常常常常 噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体的的的的基基基基因因因因可可可可补补补补偿偿偿偿 dgaldgal缺缺缺缺失失失失的的的的部部部部分分分分基基基基因因因因功功功功能能能能，因因而而两两种种噬噬菌菌体体就就同同时时获获得得复复制制的的机机会会。所所以以在在双双重重溶溶源源菌菌中中的的正正常常 噬噬菌菌体体被称为被称为助体（或辅助）噬菌体（助体（或辅助）噬菌体（helper phage）。双双重重溶溶源源菌菌的的裂裂解解物物中中含含有有等等量量的的 和和dgal粒粒子子，称称为为HFT（高高频转导）裂解物。频转导）裂解物。用用HFT裂裂解解物物以以低低 m.o.I 感感染染另另一一个个E.coli gal（不不发发酵酵半半乳乳糖糖的的营营养养缺缺陷陷型型）受受体体菌菌，就就可可以以高高频频率率地地把把它它转转化化为为能能发发酵酵半乳糖的半乳糖的E.coli gal+转导子。是为转导子。是为高频转导高频转导高频转导（高频转导（HFT，high frequency transduction）比较项目比较项目普遍性转导普遍性转导局限性转导局限性转导转导的基因转导的基因供体染色体或染色供体染色体或染色体外的任何基因体外的任何基因供体染色体上与原噬菌体紧供体染色体上与原噬菌体紧密连锁的少数几个个别基因密连锁的少数几个个别基因噬噬菌菌体体寄寄生生的位置的位置不不结结合合在在寄寄主主染染色色体特定位置上体特定位置上结结合合在在寄寄主主染染色色体体特特定定位位置置上上获获得得转转导导噬噬菌体的方法菌体的方法通通过过敏敏感感菌菌的的裂裂解解或容源菌的诱导或容源菌的诱导紫外线诱导容源菌紫外线诱导容源菌转转导导子子的的区区别别一一般般稳稳定定，非非溶溶原原性性（不不表表现现出出任任何何噬噬菌菌体体的的性性状状，包包括免疫性）括免疫性）一一般般不不稳稳定定，呈呈缺缺陷陷溶溶原原性性（对对同同源源噬噬菌菌体体具具有有免免疫疫性性，但但不不表表现现出出其其它它噬噬菌菌体体的的性性状）状）普遍性转导和局限性转导的比较普遍性转导和局限性转导的比较3.3.溶源转变溶源转变概概念念：当当温温和和噬噬菌菌体体感感染染宿宿主主而而使使其其发发生生溶溶源源化化时时，因因噬噬菌菌体体的的基基因因整整合合到到宿宿主主的的核核基基因因组组上上，而而使使后后者者获获得得了了除除免免疫疫性性以以外外的的新新性性状状的的现现象象，称称为为溶溶源源转变。转变。性质：表面上与转导相似，而本质上不同于转导。性质：表面上与转导相似，而本质上不同于转导。区别：区别：当宿主丧失其原噬菌体时，通过溶源转变而获得的新性状也随之消失当宿主丧失其原噬菌体时，通过溶源转变而获得的新性状也随之消失温温和和噬噬菌菌体体不不携携带带来来自自供供体体菌菌的的外外源源基基因因，是是噬噬菌菌体体自自身身基基因因使使宿宿主主获获得得新性状新性状温和噬菌体使完整的，不是缺陷的温和噬菌体使完整的，不是缺陷的获得新性状的是溶源化的宿主细胞，不是转导子获得新性状的是溶源化的宿主细胞，不是转导子典型实例：典型实例：Corynebacterium diphtheriae（白喉棒杆菌）：白喉毒素（白喉棒杆菌）：白喉毒素/温和噬菌体温和噬菌体Clostridium botulinum（肉毒梭菌）：（肉毒梭菌）：C型或型或D型肉毒毒素型肉毒毒素Salmonella anatum（鸭沙门氏菌）：细胞表面多糖（鸭沙门氏菌）：细胞表面多糖/E15噬菌体噬菌体Streptomyces erythreus（红红霉霉素素链链霉霉菌菌）：合合霉霉素素合合成成和和气气生生菌菌丝丝形形成成/P4温和噬菌体温和噬菌体（四）原生质体融合（四）原生质体融合protoplast fusion概概念念：通通过过人人为为方方法法，使使遗遗传传性性状状不不同同的的两两细细胞胞的的原原生生质质体体发发生生融融合合，并并进进而而发发生生遗遗传传重重组组以以产产生生同同时时带带有有双双亲亲性性状状的的遗遗传传性性稳稳定定的的融融合合子子（fusant）的的过过程程，称称为为原原生生质质体体融合。融合。适适用用范范围围：各各种种生生物物细细胞胞都都能能进进行行原原生生质质体体融融合合，包包括括各各种种原核生物、真核微生物以及高等动植物和人体的不同细胞。原核生物、真核微生物以及高等动植物和人体的不同细胞。意意义义：70年年代代后后发发展展的的一一种种育育种种新新技技术术，继继转转化化、转转导导和和接接合合之之后后一一种种更更有有效效的的转转移移遗遗传传物物质质的的手手段段。原原生生质质体体融融合合不不仅仅能能在在不不同同菌菌株株或或种种间间进进行行，还还能能做做到到属属间间、科科间间甚甚至至更远缘的微生物或高等生物细胞间的融合。更远缘的微生物或高等生物细胞间的融合。发发展展点点：有有关关原原生生质质体体融融合合的的遗遗传传机机制制，尚尚未未研研究究清清楚楚，目目前还在探索中。前还在探索中。l原生质体融合的优点：原生质体融合的优点：可以提高重组率可以提高重组率 双亲可以少带标记或不带标记双亲可以少带标记或不带标记 可进行多亲本融合可进行多亲本融合 有利于不同种间、属间微生物的杂交有利于不同种间、属间微生物的杂交 通过原生质体融合提高产量通过原生质体融合提高产量 原生质体融合的主要步骤：原生质体融合的主要步骤：选择亲株选择亲株 制制备备原原生生质质体体原原生生质质体体融融合合 原生质体原生质体 再生再生 筛筛选选优优良良性性状状的的融融合合重组子重组子二、真核微生物的基因重组二、真核微生物的基因重组主要方式：主要方式：有性杂交有性杂交准性杂交准性杂交原生质体融合（略）原生质体融合（略）转化（略）转化（略）（一）有性杂交（一）有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的过程。组，并产生新遗传型后代的过程。凡是能产生有性孢子的酵母菌或霉菌，原则上凡是能产生有性孢子的酵母菌或霉菌，原则上都能采用与高等动、植物杂交育种相似的有性都能采用与高等动、植物杂交育种相似的有性杂交方法进行育种。杂交方法进行育种。酵母菌的有性杂交育种酵母菌的有性杂交育种（一）酵母菌的（一）酵母菌的生活史生活史（复习）（复习）（二）酵母菌有性杂交技术（二）酵母菌有性杂交技术酵母菌有性杂交程序一般为酵母菌有性杂交程序一般为：亲本的单倍化亲本的单倍化有性杂交有性杂交杂交后代的检出杂交后代的检出筛选优良性状个体筛选优良性状个体1.亲本的单倍化亲本的单倍化1)杂交亲本单倍体细胞的分离杂交亲本单倍体细胞的分离A.子囊孢子的形成子囊孢子的形成a.形成子囊的条件形成子囊的条件b.一般方法一般方法B.单倍体子囊孢子的分离单倍体子囊孢子的分离a.显微操作器分离单倍体子囊孢子法显微操作器分离单倍体子囊孢子法b.酶法酶法c.机械研磨法机械研磨法C.单倍体菌株的确定单倍体菌株的确定a.单倍体细胞与二倍体细胞在单倍体细胞与二倍体细胞在形态方面的区别形态方面的区别b.生孢子能力的测定生孢子能力的测定c.单倍体细胞结合型的确定单倍体细胞结合型的确定2)杂交亲本单倍体细胞遗传标记的制作杂交亲本单倍体细胞遗传标记的制作酵母菌有性杂交的方法：酵母菌有性杂交的方法：1.可口可乐可口可乐2.酵母菌有性杂交酵母菌有性杂交1.孢子杂交法孢子杂交法2.群体交配法群体交配法3.单倍体细胞杂交法单倍体细胞杂交法3.杂交后代的检出杂交后代的检出4.筛选优良性状个体筛选优良性状个体S.Cerevisiae S.Cerevisiae 的双倍体和单倍体细胞的比较的双倍体和单倍体细胞的比较项项 目目双倍体双倍体 单倍体单倍体细细 胞胞大，椭圆形大，椭圆形小，球形小，球形菌菌 落落大，形态均一大，形态均一小，形态变化较多小，形态变化较多液体培养液体培养繁殖快，细胞较分散繁殖快，细胞较分散繁殖较慢，细胞常聚集成团繁殖较慢，细胞常聚集成团在产孢子培养基上在产孢子培养基上 形成子囊及子囊孢子形成子囊及子囊孢子不形成子囊不形成子囊自自 或或然然 人人破破 工工壁壁 破破 壁壁减数分裂减数分裂接合接合子囊孢子发芽子囊孢子发芽定义和意义：定义和意义：类类似似于于有有性性生生殖殖但但更更原原始始的的生生殖殖方方式式，是是通通过过同同一一物物种种两两个个不不同同菌菌株株的的体体细细胞胞发发生生融融合合，不不经经过过减减数数分分裂裂而而导导致低频率基因重组并产生重组子。致低频率基因重组并产生重组子。为半知菌育种提供了一个重要手段。为半知菌育种提供了一个重要手段。存在范围：存在范围：常见于一些真菌尤其是半知菌中常见于一些真菌尤其是半知菌中准性生殖的过程准性生殖的过程：（二）准性生殖（二）准性生殖（parasexual hybridization）准性准性生殖的过程：生殖的过程：菌菌丝联结 异核体形成（异核体形成（质配）配）核配形成核配形成杂合二倍体合二倍体体体细胞交胞交换和和单倍体倍体化化。异核体：异核体：同一菌同一菌丝有不同有不同遗传性状的核在同一性状的核在同一 细胞胞质中生中生长。同核体：同核体：同一菌同一菌丝中只有一种核。中只有一种核。异核体的特点：异核体的特点：1）具有感受性的两种菌）具有感受性的两种菌丝间才可形成异核体；才可形成异核体；2）具有野生型性状，可在基本培养基上生）具有野生型性状，可在基本培养基上生长；（基因互（基因互补功能）功能）3）大多数异核体的分生）大多数异核体的分生孢子不能在基本培养基子不能在基本培养基 上生上生长；如能生；如能生长，则为异核体、或异核体、或为杂合合 二倍体（重二倍体（重组子）。子）。体细胞交换和单倍体化体细胞交换和单倍体化 杂合体合体细胞中有极少数胞中有极少数细胞核在胞核在进行有行有丝分裂的分裂的过程中，程中，能能发生体生体细胞染色体胞染色体间的交的交换、分离（、分离（单倍体化）而倍体化）而产生具生具有新性状的有新性状的单倍体倍体杂合子、双倍体及非整倍体。合子、双倍体及非整倍体。ABA+B（同核体）（同核体）（异核体）（异核体）AABBABAABB（杂合二倍体）合二倍体）单倍体倍体杂合子合子准性生殖与有性生殖的比较准性生殖与有性生殖的比较 项项 目目 准性生殖准性生殖 有性生殖有性生殖参与接合的亲本细胞参与接合的亲本细胞形态相同的体细胞形态相同的体细胞形形态态或或生生理理上上有有分分化化的的性性细胞细胞独立生活的异核体阶段独立生活的异核体阶段 有有 无无接合后双倍体细胞形态接合后双倍体细胞形态与单倍体基本相同与单倍体基本相同 与单倍体明显不同与单倍体明显不同双倍体变单倍体的途径双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂通过有丝分裂 通过减数分裂通过减数分裂 接合发生的几率接合发生的几率偶然发现，几率低偶然发现，几率低 正常出现，几率高正常出现，几率高准性杂交：准性杂交：选择亲本：选择亲本：以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强强制制异异合合：将将两两菌菌亲亲株株的的分分生生孢孢子子（106107）混混合合涂涂-平平板板，并并做做各各单单亲亲本本对对照照，-平平板板上上长长出出的的菌菌落落是是异异核核体体或或杂杂合合二二倍体倍体移单菌落：移单菌落：纯化菌落，并将纯化后的菌落移入纯化菌落，并将纯化后的菌落移入-斜面斜面验验稳稳定定性性：在在-夹夹层层平平板板上上培培养养后后，再再倒倒上上一一层层+，再再培培养养后后若若出出现现大大量量新新菌菌落落，说说明明是是不不稳稳定定的的异异核核体体，反反之之是是杂杂合二倍体合二倍体促促进进变变异异：用用诱诱变变剂剂进进行行处处理理，以以促促进进染染色色体体发发生生交交换换、染染色色体体在在子子细细胞胞分分配配不不均均、染染色色体体缺缺失失或或畸畸变变、点点突突变变等等，使使分离后的子代提高增加新性状的可能分离后的子代提高增加新性状的可能筛选：筛选：Penicillum urticae 的准性杂交步骤的准性杂交步骤