《核酸分子杂交技术》PPT课件.ppt

第十章第十章 核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术第一节第一节 核酸分子杂交的基本原理核酸分子杂交的基本原理 具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下 按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知 核酸序列称探针。核酸序列称探针。杂交有固一液相杂交和液相杂交。杂交有固一液相杂交和液相杂交。变性变性变性变性复性复性复性复性 DNA-DNA杂交双链分子杂交双链分子 一、一、DNA变性与复性变性与复性 （一）（一）DNA变性变性 1、定义：某些理化因素导致两条、定义：某些理化因素导致两条DNA链间的链间的氢链断裂变为单链的过程，称氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性变性2、变性的方法：、变性的方法：（1）热变性：温度升高到）热变性：温度升高到90100时，双链核酸时，双链核酸 分子链间的氢键完全断裂。分子链间的氢键完全断裂。（2）酸碱变性：）酸碱变性：pH值低于值低于3或高于或高于10时，双链核时，双链核 酸分子链酸分子链 间的氢键断裂。间的氢键断裂。（3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使 双链核酸分子链间的氢键断裂。双链核酸分子链间的氢键断裂。3、变性后的理化性质变化：、变性后的理化性质变化：粘度降低粘度降低 密度增加密度增加 紫外吸收值增加紫外吸收值增加4、DNA变性曲线变性曲线 AT区先解链区先解链 GC区后解链区后解链 阶梯式曲线阶梯式曲线5、GC含量与含量与Tm值之间的关系值之间的关系 （G+C）%=（二）复性（二）复性 1、定义：变性的单链核酸分子在一定条件下、定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。性或杂交。具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链：具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸和寡核苷酸/RNA。2、复性过程、复性过程（1）单链分子间碰撞形成局部双链）单链分子间碰撞形成局部双链（2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离（3）局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列）局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列（4）形成完整的双链分子）形成完整的双链分子3、复性的速率方程（服从二级反应动力学）、复性的速率方程（服从二级反应动力学）dC dt=K2C2（1）将（1）积分C Co 1 1+K2Cot=（2）一半单链一半单链DNA分子复性时，（分子复性时，（2）式中的）式中的 为为1 21 2 1 1+K2Cot=Cot1/2值越大，复性速度越慢值越大，复性速度越慢C Co（3）1 K2Cot1/2=二、影响杂交的因素二、影响杂交的因素 1、核酸分子的浓度和长度：、核酸分子的浓度和长度：浓度越大，复性速度越快浓度越大，复性速度越快 分子越大，复性速度越慢分子越大，复性速度越慢 单链探针，浓度增加，杂交效率增加单链探针，浓度增加，杂交效率增加 双链探针，浓度控制在双链探针，浓度控制在g,浓度过高影响杂浓度过高影响杂 交效率交效率2、温度：、温度：（1）DNA/DNA杂交，适宜温度较杂交，适宜温度较Tm值低值低2025 （2）RNA/DNA或或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低杂交，加甲酰胺降低 Tm值值 （3）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低值低5 3、离子强度：、离子强度：（1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率增加交率增加 （2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度 4、甲酰胺：、甲酰胺：（1）甲酰胺能降低核酸杂交的）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交值，能降低杂交液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待测核酸与探针同源性不高时，加测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在甲酰胺溶液在3542 杂交杂交 （2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶液在液在68杂交杂交 5、核酸分子的复杂性：、核酸分子的复杂性：（1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总长度的总长度 （2）Cot与反应体系中核酸复杂性成正比与反应体系中核酸复杂性成正比 （3）两个）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对样品浓度绝对一致时，变性后的相对杂交率取决于杂交率取决于DNA的相对复杂性的相对复杂性 6、非特异性杂交反应：、非特异性杂交反应：（1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异性吸附的非特异性吸附 （2）常用的封闭物有两类：即非特异性）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分和高分子化合物。如鲑精子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脱脂奶粉溶液或脱脂奶粉 第二节第二节 核酸分子杂交的方法核酸分子杂交的方法按待测核酸是否固定在固相支持物上分：按待测核酸是否固定在固相支持物上分：固固-液相杂交液相杂交 膜上印迹杂交膜上印迹杂交 原位杂交原位杂交 液相杂交液相杂交 RNA酶保护分析法酶保护分析法 核酸酶核酸酶S1保护分析法保护分析法 一、一、Southern印迹杂交印迹杂交（一）待测核酸样品的制备（一）待测核酸样品的制备 1、裂解或破碎细胞、裂解或破碎细胞 2、抽取纯化基因组、抽取纯化基因组DNA 3、限制酶消化、限制酶消化DNA为大小不同的为大小不同的DNA片段片段（二）待测（二）待测DNA样品的电泳分离样品的电泳分离 1、琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶、琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶 分离小片段用高浓度胶分离小片段用高浓度胶 2、凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子、凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子 DNA泳动慢泳动慢,小分子小分子DNA泳动快，泳动快，大小大小 相同的分子处于同一条带相同的分子处于同一条带 3、分子量标准：经、分子量标准：经Hind消化的消化的DNA，杂交，杂交 所用分子量标准可用核素标记所用分子量标准可用核素标记 （三）凝胶中核酸的变性（碱变化）（三）凝胶中核酸的变性（碱变化）凝胶置于凝胶置于NaOH溶液中使溶液中使DNA变性断裂为较短的变性断裂为较短的 单链单链 DNA,中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液 （四）（四）Southern印迹印迹 指将电泳分离的指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固片段转移到一定的固 相支持物上的过程相支持物上的过程1、固相支持物的选择、固相支持物的选择（1）理想的固相支持物应具备的特性）理想的固相支持物应具备的特性 具有较强结合核酸分子的能力具有较强结合核酸分子的能力 不影响与探针的杂交反应不影响与探针的杂交反应 与核酸分子结合稳定牢固与核酸分子结合稳定牢固 具有良好的机械性能具有良好的机械性能 非特异吸附少非特异吸附少（2）常用的固相支持物）常用的固相支持物 硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本 底低。缺点是底低。缺点是DNA分子结合不牢固分子结合不牢固 尼龙膜：优点是结合单链，双链尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸的能力比硝酸 纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高 化学活化膜：优点：化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合；对不同与膜共价结合；对不同 大小的大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结合能片段有同等结合能力；缺点：结合能 力较上述两种膜低力较上述两种膜低2、Southern印迹的常用方法印迹的常用方法（1）毛细管虹吸印迹法）毛细管虹吸印迹法 利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的的DNA转移到固相支持物上。转移到固相支持物上。其基本原理是：其基本原理是：容器中的转移缓冲液含有高浓度的容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动凝胶中的同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝片段垂直向上运动，凝胶中的胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上片段移出凝胶而滞留在膜上（2）电转法）电转法利用电场的电泳作用将凝胶中的利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相转移到固相支持物上。支持物上。（3）真空转移法）真空转移法 此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。维素膜上。（五）（五）Southern杂交杂交 1、预杂交：封闭膜上能与、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点结合的位点 预杂交液为不含预杂交液为不含DNA探针的杂交液探针的杂交液 2、杂交：液相中的、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测探针与膜上的待测DNA杂交杂交 双链双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交探针需加热变性为单链，再杂交 3、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的 DNA （六）杂交结果检测（六）杂交结果检测 1、放射自显影：适用于放射性核素标记的探针、放射自显影：适用于放射性核素标记的探针 2、比色或化学发光检测：适于非核素标记的探针、比色或化学发光检测：适于非核素标记的探针（七）（七）Southern杂交在医学中的应用杂交在医学中的应用 1、酶切图谱分析、酶切图谱分析 2、特定基因定性和定量、特定基因定性和定量 3、基因突变分析、基因突变分析 4、限制性片段长度多态性的分析、限制性片段长度多态性的分析二、二、Northern印迹杂交印迹杂交 1、基本原理和基本过程与、基本原理和基本过程与Southern blot基本相同基本相同 2、鉴别、鉴别RNA 3、探针可用、探针可用DNA或或RNA片段片段 4、待测样品为总、待测样品为总RNA或或mRNANorthern印迹与印迹与Southern 印迹的不同点印迹的不同点 1、变性：、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保电泳前加热变性、电泳时加变性剂保 持持RNA处于变性状态，处于变性状态，DNA电泳前和电泳电泳前和电泳 中不变性中不变性 2、转膜：、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理转膜前不需变性和中和处理,Southern 印迹时，印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理转膜前需进行碱变性及中和处理 3、靶核酸为、靶核酸为RNA三、斑点及狭缝印迹杂交三、斑点及狭缝印迹杂交 1、斑点印迹为圆形、斑点印迹为圆形 2、狭缝印迹为线状、狭缝印迹为线状 3、鉴别、鉴别DNA、RNA 4、简单、快速，同一张膜可检测多个样品、简单、快速，同一张膜可检测多个样品 5、特异性不高、不能鉴别核酸分子量、特异性不高、不能鉴别核酸分子量四、原位杂交四、原位杂交 1、定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组、定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分：与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA 杂交杂交 保持组织细胞的形态保持组织细胞的形态 对核酸无抽提，修饰与降解作用对核酸无抽提，修饰与降解作用 不改变核酸在组织细胞内的定位不改变核酸在组织细胞内的定位 不阻碍核酸与探针的杂交过程不阻碍核酸与探针的杂交过程 对杂交信号无遮蔽作用对杂交信号无遮蔽作用 理化性质稳定理化性质稳定 2、杂交过程：、杂交过程：（1）组织或细胞的固定）组织或细胞的固定 理想固定液应具备：理想固定液应具备：（2）组织细胞杂交前的预处理）组织细胞杂交前的预处理 去垢剂（如去垢剂（如Triton x-100和和SDS）和蛋白酶和蛋白酶 K去除核酸表面的蛋白质去除核酸表面的蛋白质 组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体 控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻 片上脱落片上脱落（3）探针的选择与标记）探针的选择与标记 以获得最好杂交效果为依据选择探针以获得最好杂交效果为依据选择探针 探针的长度一般为探针的长度一般为50300bp,有时达有时达kb 放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定 检测结果分辨率高，但信号检测时间长检测结果分辨率高，但信号检测时间长 非核素标记探针安全、稳定性好、显色快，易非核素标记探针安全、稳定性好、显色快，易 于观察于观察（4）杂交）杂交 杂交液体积小：杂交液体积小：1020l cDNA和和RNA探针杂交温度约为探针杂交温度约为50 杂交时间杂交时间:DNA探针杂交为探针杂交为24探针杂交过夜探针杂交过夜 杂交前一般将组织切片置杂交前一般将组织切片置95 515分钟使分钟使DNA变性变性 冲洗温度一般冲洗温度一般 不超过不超过50（5）杂交结果检测）杂交结果检测 所用探针为核素标记所用探针为核素标记,放射自显影检测放射自显影检测 所用探针为非核素标记所用探针为非核素标记,比色或化学发光检测比色或化学发光检测五、液相杂交五、液相杂交 指待测核酸和探针都存在于杂交液中，碱基互补指待测核酸和探针都存在于杂交液中，碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子的过程。的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子的过程。（一）（一）RNA酶保护分析法酶保护分析法1、RNA酶保护分析法原理酶保护分析法原理 RNaseA和和RNaseT1专一水解杂交体系中的单专一水解杂交体系中的单链链RNA，不水解探针，不水解探针RNA与待测与待测RNA互补形成互补形成的双链的双链RNA，使杂交分子得到保护，称，使杂交分子得到保护，称RNA酶保酶保护分析法。护分析法。2、杂交过程、杂交过程 制备待测制备待测RNA RNA探针的制备与标记：体外转录法制备和标探针的制备与标记：体外转录法制备和标 记记RNA探针探针 杂交：待测杂交：待测RNA与与RNA探针在液相中杂交探针在液相中杂交 RNaseA和和RNaseTI除去单链除去单链RNA 电泳分离电泳分离RNA 放射自显性检测杂交结果放射自显性检测杂交结果（二）核酸酶（二）核酸酶S1保护分析法保护分析法 1、原理、原理 核酸酶核酸酶S1在一定条件下专一水解杂交体系中在一定条件下专一水解杂交体系中的单链的单链DNA和单链和单链RNA，不水解，不水解DNA探针与待测探针与待测RNA杂交形成的杂交体，使杂交分子得到保护，杂交形成的杂交体，使杂交分子得到保护，称核酸酶称核酸酶S1保护分析法保护分析法2、杂交过程、杂交过程 制备待测制备待测RNA：总：总RNA或或mRNA均可均可 单链单链DNA探针的制备与标记探针的制备与标记 杂交：单链杂交：单链DNA探针与待测探针与待测RNA在液相中杂交在液相中杂交 核酸酶核酸酶S1除去单链除去单链DNA和单链和单链RNA 电泳分离电泳分离DNA/RNA杂交体分子杂交体分子 放射自显影检测杂交结果放射自显影检测杂交结果第三节第三节 探针的标记探针的标记一、探针的种类一、探针的种类 基因组基因组DNA探针探针 cDNA探针探针 RNA探针探针 寡核苷酸探针寡核苷酸探针二、标记物二、标记物 （一）理想标记物应具备的特性：（一）理想标记物应具备的特性：高度灵敏性高度灵敏性 不影响碱基配对的特异性不影响碱基配对的特异性 不影响探针分子的主要理化性质不影响探针分子的主要理化性质 对酶促反应活性无影响或影响不大对酶促反应活性无影响或影响不大 检测方法具有高度灵敏性和高度特异性检测方法具有高度灵敏性和高度特异性(二二)标记物种类标记物种类 核素核素标记物：标记物：32p、35s、3H 非核素标记物非核素标记物 半抗原：生物素、地高率半抗原：生物素、地高率 配体：生物素是亲和素的配体配体：生物素是亲和素的配体 荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等 化学发光探针：标记物与某种底物反应发光，化学发光探针：标记物与某种底物反应发光，如生物素酰化的碱性磷酸酶如生物素酰化的碱性磷酸酶 可使发光底物发光可使发光底物发光 三、标记方法三、标记方法 体内标记法：体内标记法：将核素标记的化合物作为合成代将核素标记的化合物作为合成代谢的底物，在细胞合成代谢时使谢的底物，在细胞合成代谢时使 核素掺入到新合核素掺入到新合成的核酸分子中，如成的核酸分子中，如3H-胸苷可掺入到胸苷可掺入到DNA中，中，3H-尿苷可掺入到尿苷可掺入到RNA中中 体外标记法：体外标记法：化学标记法：标记物分子上的活性基因与化学标记法：标记物分子上的活性基因与 探针分子上的某些基因反应，探针分子上的某些基因反应，标记物直接结合到探针分子上标记物直接结合到探针分子上 酶促标记法：标记物预先标记核苷酸，然酶促标记法：标记物预先标记核苷酸，然 后利用酶促法将标记的核苷酸后利用酶促法将标记的核苷酸 掺入到探针上掺入到探针上 酶促标记法酶促标记法（一）切口平移法（一）切口平移法（nick translation)1、利用、利用DNase I在在DNA双链上造成单链切口双链上造成单链切口2、利用大肠杆菌、利用大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I的的53 核酸核酸外切酶活性在切口处将旧链从外切酶活性在切口处将旧链从5 末端逐步切末端逐步切除除3、在、在DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合酶催化下，聚合酶催化下，以互补的以互补的DNA单链为模板依次将单链为模板依次将dNTP连接到连接到切口的切口的3 末端末端-OH上，合成新的上，合成新的DNA链，同链，同时将标记的核苷酸掺入到新的时将标记的核苷酸掺入到新的DNA链中链中（二）随机引物法（二）随机引物法 其原理是随机引物能与各种单链其原理是随机引物能与各种单链DNA模板结合，模板结合，作为合成新链的引物，在作为合成新链的引物，在DNA聚合酶的催化下，聚合酶的催化下，按按53 方向合成一新的方向合成一新的DNA链，其核苷酸序链，其核苷酸序列与模板列与模板DNA完全互补。另一单链完全互补。另一单链DNA模板同样模板同样合成一条新的完全互补的合成一条新的完全互补的DNA链。合成时，带放链。合成时，带放射性核素标记的核苷酸掺入到新合成的射性核素标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子分子中中随机引物法所具有的优点：随机引物法所具有的优点：1、能进行双链、能进行双链DNA、单链、单链DNA或或RNA探针的标记探针的标记2、操作简单方便，避免因、操作简单方便，避免因DNaseI处理浓度掌握不处理浓度掌握不当所带来的一系列问题当所带来的一系列问题3、标记活性高，标记活性可达、标记活性高，标记活性可达108cpm/gDNA以以上上4、可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记、可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记（三）（三）PCR标记法：标记法：将标记的核苷酸作为将标记的核苷酸作为PCR反反 应的底物，以待标记的应的底物，以待标记的DNA为模板，经为模板，经PCR反应，标记的核苷酸掺入到新合成的反应，标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分分子中子中四、探针的纯化四、探针的纯化1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可片段，可去除去除dNTP和蛋白质和蛋白质2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将大分子大分子DNA和小分子和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷、磷酸根离子及寡核苷酸（酸（80bp)等物质分离，常用凝胶基质是等物质分离，常用凝胶基质是Sephadex G-503、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此法则是利用离心的方式来纯化探针法则是利用离心的方式来纯化探针