免疫组化结果的分析和判断精.ppt

免疫组化结果的分析免疫组化结果的分析和判断和判断第1页，本讲稿共40页第一节第一节第一节第一节 免疫组化结果的判断原则免疫组化结果的判断原则免疫组化结果的判断原则免疫组化结果的判断原则 免疫组化结果的判断原则概括起来有以下免疫组化结果的判断原则概括起来有以下几点：几点：第2页，本讲稿共40页 必必须须同同时时设设对对照照染染色色。没没有有对对照照染染色色的的免疫组化染色结果是不可信的。免疫组化染色结果是不可信的。抗抗抗抗原原原原表表表表达达达达必必必必须须须须在在在在特特特特定定定定部部部部位位位位。如如如如LCALCA应应定定位位在细胞膜上；在细胞膜上；CKCK应定位在细胞浆内；应定位在细胞浆内；应定位在细胞浆内；应定位在细胞浆内；PCNAPCNA及及p53p53p53p53蛋蛋白白应应定定位位在在细细胞胞核核内内；EMAEMA应应定定位位在在细细胞胞膜膜上上，等等等等。不不在在抗抗原原所所在在部部位位的的阳阳性着色，一概不能视为阳性。性着色，一概不能视为阳性。第3页，本讲稿共40页 阴阴阴阴性性性性结结结结果果果果不不不不能能能能视视视视为为为为抗抗抗抗原原原原不不不不表表表表达达达达。由由于于检检测测方方法法灵灵敏敏度度有有高高低低之之分分，有有时时可可因因染染色色方方法法灵灵敏敏度度不不够够，而而导导致致阴阴性性反反应应，判判断断时时应应注注意。意。第4页，本讲稿共40页 尽尽量量避避开开出出血血、坏坏死死及及切切片片刀刀痕痕和和界界面面边边缘缘细细胞胞的的阳阳性性表表达达，特特别别是是酶酶免免疫疫标标记记。因因为为这这类类阳阳性性着着色色多多系系内内源源干干扰扰，或或系系人人为因素所致。为因素所致。第5页，本讲稿共40页 对对免免疫疫组组化化标标记记结结果果的的意意义义不不能能绝绝对对化化，应应应应结结结结合合合合临临临临床床床床资资资资料料料料、X X线线等等影影像像学学及及实实验验结结果综合分析。果综合分析。第6页，本讲稿共40页*第二节第二节 对照染色设计对照染色设计 第7页，本讲稿共40页 (一）对照染色的目的一）对照染色的目的一）对照染色的目的一）对照染色的目的 设设对对照照的的目目的的是是为为了了排排除除假假阴阴性性和和假假阳阳性性。假假阴阴性性的的原原因因主主要要有有三三：组组织织处处理理不不当当，抗抗原原丢丢失失过过多多或或被被遮遮蔽蔽；抗抗体体失失活活、效效价价过过低低或或稀稀释释度度不不合合适适（主主要要指指一一抗抗，即即特特异异性性抗抗体体）；染染色色步步骤骤遗遗漏漏及及差差错错，或或显色剂的选择、缓冲液的显色剂的选择、缓冲液的pHpHpHpH和离子强度不当等。和离子强度不当等。第8页，本讲稿共40页 假阳性均系由多种因素造成的非特异着色假阳性均系由多种因素造成的非特异着色假阳性均系由多种因素造成的非特异着色假阳性均系由多种因素造成的非特异着色所致，原因主要有：所致，原因主要有：所致，原因主要有：所致，原因主要有：自发荧光或内源酶等干自发荧光或内源酶等干扰；扰；抗体试剂不纯抗体试剂不纯(特别是一抗）；特别是一抗）；特别是一抗）；特别是一抗）；操作失操作失操作失操作失误，如污染、切片干枯或显色剂操作不当等；误，如污染、切片干枯或显色剂操作不当等；误，如污染、切片干枯或显色剂操作不当等；误，如污染、切片干枯或显色剂操作不当等；Fc受体的干扰，等等。受体的干扰，等等。第9页，本讲稿共40页（二）对照的种类及其选用目的（二）对照的种类及其选用目的 对对照照染染色色大大致致可可分分为为：阳阳性性组组织织对对照照、阴阴性性组组织织对对照照及及阴阴性性试试剂剂对对照照和和自自身身对照对照四大类四大类：第10页，本讲稿共40页阳阳性性组组织织对对照照 指指用用已已证证实实含含有有靶靶抗抗原原的的同同源源及及不不同同源源组组织织切切片片或或细细胞胞涂涂片片与与待待检检实实验验切切片片同同时时作作同同样样处处理理和和免免疫疫染染色色的的组组织织对对照照。正正确确的的结结果果应应呈呈现现阳阳性性，目目的的是是为为了了证证实实所所用用免免疫疫组组化化染染色色流流程程的的有有效效性性，排排除除假假阴阴性性的可能。的可能。第11页，本讲稿共40页阴阴性性组组织织对对照照 指指指指用用用用已已已已证证证证实实实实不不不不含含含含靶靶靶靶抗抗抗抗原原原原的的的的同同同同步步步步处处处处理理理理和和和和免免免免疫疫疫疫标标标标记记记记染染染染色色色色的的的的组组组组织织织织对对对对照照照照。正正正正确确确确的的的的结结结结果果果果应应应应为为为为阴阴阴阴性性性性，目目目目的的的的是是是是除除除除外假阳性。外假阳性。外假阳性。外假阳性。第12页，本讲稿共40页阴阴性性试试剂剂对对照照 是是指指用用于于证证实实在在免免疫疫组组化化染染色色中中所所用用试试剂剂，尤尤其其是是特特异异性性抗抗体体试试剂剂的的有有效效性性和和可可靠靠性性而而所所设设立立的的同同步步免免疫疫染染色色对对照照，包包括括有有：空空白白对对照照；替替代代对对照照；吸吸收收试试验验和和抑抑制制试试验验等等等等。目目目目的的的的在在在在于于于于除除除除外外外外假假假假阳阳阳阳性性性性和和和和证证证证实实实实所所所所用用用用免免免免疫疫疫疫组组组组化化化化试试试试剂剂剂剂及及及及其其其其技技技技术术术术方方方方法法法法的的的的有有有有效效效效性性性性和和和和待待待待检检检检实实实实验验验验切切切切片片片片免免免免疫疫疫疫标标标标记记记记阳阳阳阳性性性性结结结结果果果果的的的的可可可可靠靠靠靠性。性。性。性。第13页，本讲稿共40页空空白白对对照照 指指以以缓缓冲冲液液（PBS、TBSTBS等等）取取代代第第一一抗抗体体（主主要要的的，必必要要时时还还可可做做第第二二抗抗体体及及桥桥联联抗抗体体的的空空白白取取代代），其其他他各各步步不不变变的的试试剂剂对对照照染染色色，结结果果应应为为阴性。阴性。第14页，本讲稿共40页取取代代对对照照 指指指指以以以以所所所所用用用用方方方方法法法法第第第第一一一一抗抗抗抗体体体体同同同同源源源源动动动动物物物物的的的的正正正正常常常常血血血血清清清清，或或或或与与与与本本本本实实实实验验验验无无无无关关关关的的的的抗抗抗抗体体体体(靶靶生生物物缺缺如如的的)取取代代第第一一抗抗体体，其其他他步步骤骤不不变变的的试试剂剂对对照照染染色色，结果应为阴性。结果应为阴性。吸吸收收试试验验 是是是是指指指指用用用用事事事事先先先先经经经经过过过过量量量量抗抗抗抗原原原原吸吸吸吸收收收收的的的的第第第第一一一一抗抗抗抗体体体体上上上上清清清清液液液液取取取取代代代代第第第第一一一一抗抗抗抗体体体体，其其其其他他他他步步步步骤骤骤骤不不不不变变变变的的的的免免免免疫疫疫疫染染染染色色色色试试试试剂剂剂剂对对对对照照照照。结结结结果果果果应应应应是是是是阴阴阴阴性性性性或或或或阳阳阳阳性性性性着着着着色色色色明明明明显显显显减减减减弱（吸收不全时）。弱（吸收不全时）。弱（吸收不全时）。弱（吸收不全时）。第15页，本讲稿共40页抑抑制制试试验验 是是指指用用标标记记抗抗体体和和未未标标记记抗抗体体（可可以以是是一一抗抗，也也可可以以是是二二抗抗或或桥桥抗抗体体）两两者者的的混混合合物物作作试试剂剂，其其他他步步骤骤不不变变的的免免疫疫组组化化染染色色试试剂剂对对照照，结结果果其其阳阳性性着着色色应应成成比比例例的的减减弱弱（等等量量或或1：9）。此此试试剂剂对对照多用于直接法。照多用于直接法。第16页，本讲稿共40页 这这这这类类类类阴阴阴阴性性性性试试试试剂剂剂剂对对对对照照照照的的的的选选选选用用用用原原原原则则则则是是：空空白白对对照照不不能能省省，其其他他对对照照在在预预实实验验中中应应尽尽量量多多做做，尤尤其其是是应应用用新新抗抗体体试试剂剂；对对照照必必需需与与实实验验片片同同步步进进行行染染色色；对对照照的的结结果应附合要求。果应附合要求。第17页，本讲稿共40页自自身身对对照照 是是指指在在同同一一标标记记切切片片上上的的自自身身组组织织成成分分的的阴阴性性背背景景对对照照。即即即即与与与与靶靶靶靶抗抗抗抗原原原原阳阳阳阳性性性性反反反反应应应应细细细细胞胞胞胞或或或或成成成成分分分分相相相相邻邻邻邻的的的的阴阴阴阴性性性性背背背背景景景景结结结结构构构构的的的的显显显显色色色色，结结结结果果果果应应应应为为为为阴阴阴阴性性性性或或或或着着着着色色色色较较较较浅浅浅浅，需需需需与与与与阳阳阳阳性性性性着着着着色色色色成成成成分分分分呈呈呈呈鲜鲜鲜鲜明明明明对对对对比比比比。目目目目的的的的在在在在于于于于排排排排除除除除内内内内源源源源性性性性干干干干扰扰扰扰产产产产生生生生的的的的假假假假阳性和因抗原弥散移位造成的错误结果。阳性和因抗原弥散移位造成的错误结果。阳性和因抗原弥散移位造成的错误结果。阳性和因抗原弥散移位造成的错误结果。第18页，本讲稿共40页*第三节第三节 非特异染色非特异染色 第19页，本讲稿共40页 非特异染色非特异染色是指免疫组化染色过程中是指免疫组化染色过程中产生的非靶抗原的呈色结果，属假阳性，产生的非靶抗原的呈色结果，属假阳性，又称背景着色，能严重干扰免疫组化染色又称背景着色，能严重干扰免疫组化染色结果的正确判断，应竭力避免或减轻。其结果的正确判断，应竭力避免或减轻。其原因涉及免疫组化染色流程的各个环节，原因涉及免疫组化染色流程的各个环节，可来自：可来自：第20页，本讲稿共40页内内源源性性干干扰扰(自自发发荧荧光光、内内源源酶酶、内内源源性生物素等性生物素等)；试试剂剂污污染染(质质质质量量量量差差差差，交交交交叉叉叉叉反反反反应应应应，Fc受受受受体体体体干干干干扰扰扰扰等等等等)；组组织织处处理理不不当当(组组组组织织织织固固固固定定定定不不不不及及及及时时时时或或或或固固固固定定定定不不不不良良良良所所所所导导导导致致致致的的的的抗抗抗抗原原原原弥弥弥弥散散散散移移移移位位位位、洗洗洗洗涤涤涤涤不不不不充充充充分分分分所所所所导导导导致致致致的的的的游离试剂残留等游离试剂残留等游离试剂残留等游离试剂残留等)。第21页，本讲稿共40页 纠纠正正的的方方法法视视原原因因而而异异，可可在在预预实实验验基基础础上上，采采用用有有针针对对性性的的纠纠正正对对策策，即即对对症症下下药药(具具具具体体体体纠纠纠纠正正正正方方方方法法法法不不不不展展展展开开开开讲讲讲讲了了了了，同同同同学学学学们们们们可可可可以自己阅读讲义以自己阅读讲义以自己阅读讲义以自己阅读讲义p123-126)。第22页，本讲稿共40页*第四节第四节 阳性标记的形态特征和判断阳性标记的形态特征和判断第23页，本讲稿共40页 免免疫疫组组化化标标记记具具有有一一定定形形态态特特点点，若若能能熟熟练练掌掌握握则则有有助助于于对对免免疫疫组组化化标标记记结结果果的的正正确确判判断断。内内容容包包括括定定性性、定定位位和和定定量三方面。量三方面。第24页，本讲稿共40页 免免疫疫显显色色强强度度和和阳阳性性细细胞胞密密度度是是定定性性定定量量指指标标，实实际际工工作作中中常常采采用用强强度度和和密密度度结结合合的的方方法法综综合合计计量量，与与抗抗原原含含量量有有关关；阳阳性性细细胞胞的的着着色色形形态态及及组组织织分分布布特特点点主主要要是定位指标，与功能有关。是定位指标，与功能有关。第25页，本讲稿共40页 一一、阳阳性性标标记记免免疫疫特特征征：分分 弱弱(+)(+)、中中(+)(+)(+)(+)、强强(+)(+)三三级级。免免疫疫荧荧光光法法（FITC为为例例）则则表表现现为为浅浅绿绿色色荧荧光光、明明显显绿绿色色荧荧光光和亮绿色耀眼荧光；和亮绿色耀眼荧光；第26页，本讲稿共40页 免免疫疫酶酶标标记记（HRP-DAB/H2O2）则则表表现现为为淡淡黄黄色色细细颗颗粒粒、棕棕黄黄色色颗颗粒粒和和褐褐黄黄色色粗粗颗颗粒粒，后后者者耀耀眼眼易易见见。图图像像摄摄影影，原原则则上多取强阳性区域。上多取强阳性区域。第27页，本讲稿共40页二二二二、阳阳阳阳性性性性标标标标记记记记细细细细胞胞胞胞学学学学特特特特征征征征（以以HRP-DAB/H2OO2为为例例）可可分分为为胞胞膜膜型型；胞胞核核型型；胞胞质质(浆浆)型型型型；微微微微绒绒绒绒毛毛毛毛型型型型和和和和复复复复合合合合型型型型（胞胞膜膜-胞胞质质兼兼有有，胞胞核核-胞胞质质兼兼有有，或或微微绒绒毛毛-胞胞质质兼兼有有）等等五五种种阳阳性性细细胞胞类类型型。这这与与抗抗原原所所在在部部位位相相关关联联，但但应应注注意意排排除除因因组组织织固固定定不不好好引引起起的的抗抗原原弥弥散散假假象象，尤其是复合型图像。尤其是复合型图像。第28页，本讲稿共40页三三、阳阳性性标标记记组组织织学学特特征征（以以HRP-DAB/H2 2O2为为例例）免免疫疫组组化化染染色色阳阳性性细细胞胞在在组组织织中中的的分分布布排排列列形形式式可可以以有有如如下下7种种种种：局局灶灶型型；弥弥漫漫型型；片片块块型型；网网状状型型；腺腺管管型型；腔腔缘缘型型和和菊菊团团型型，等等等等。这这这这主主主主要要要要取取取取决决决决于于于于抗抗抗抗原原原原抗抗抗抗体体体体复复复复合合合合物物物物在在在在细细细细胞胞胞胞内内内内的的的的分分分分布布布布和和和和阳阳阳阳性性性性细细细细胞胞胞胞在在在在组组组组织织织织内内内内的的的的群群群群体体体体分布特点。分布特点。分布特点。分布特点。第29页，本讲稿共40页四四、阳阳性性标标记记强强度度特特征征 依依照照细细胞胞阳阳性性着着色色程程度度（抗抗原原含含量量），可可分分为为弱弱阳阳性性（+）1分分；中中 等等 阳阳 性性（+）2分分分分；强强强强 阳阳阳阳 性性性性（+）3分分。依依照照阳阳性性细细胞胞数数量量，可可分分为为：弱弱阳阳性性（+，指指阳阳性性细细胞胞数数在在25%以以下下）1分；分；第30页，本讲稿共40页中中等等阳阳性性（+,+,指指阳阳性性细细胞胞数数在在25%49%)25%49%)2 2分分分分；强强强强阳阳阳阳性性性性（+，指指阳阳性性细细胞胞数数在在50%以以以以上上上上)3分分。目目前前多多采采用用积积分分综综合合计计量量。计计计计算算算算公公公公式式式式：两两两两者者者者相相相相乘乘乘乘（或或相相加加）。大大多多主主张张34者者为为阳阳性性，6者者为为强强阳性，阳性，至少随机观察至少随机观察5-10个个HPF,取其均值取其均值。第31页，本讲稿共40页第五节第五节 染色失败的可能原因染色失败的可能原因 第32页，本讲稿共40页 免免免免疫疫疫疫组组组组化化化化染染染染色色色色的的的的基基本本要要求求有有二二：实实验验切切片片的的阳阳性性抗抗原原定定位位准准确确，呈呈色色鲜鲜明明，背背景景着着色色浅浅或或无无，二二者者的的比比值值应应大大于于1（阳阳阳阳性性性性/背背景景）；对对照照染染色色的的结结果果应应附附合合要要求求。否否则则，所所得得实实验验结结果果都都是是错错误误的的，或或为为假假阳阳性或为假阴性。性或为假阴性。第33页，本讲稿共40页 假阳性是指实验切片呈阳性，阴性组假阳性是指实验切片呈阳性，阴性组织对照或阴性试剂对照也呈阳性的结果，织对照或阴性试剂对照也呈阳性的结果，谓之假阳性。其原因与内源性干扰，试剂谓之假阳性。其原因与内源性干扰，试剂不纯，交叉反应等有关。不纯，交叉反应等有关。第34页，本讲稿共40页 假假假假阴阴阴阴性性性性是是是是指指指指实实实实验验验验切切切切片片片片呈呈呈呈阴阴阴阴性性性性，阳阳阳阳性性性性组组组组织织织织对对对对照照照照及及及及阴阴阴阴性性性性试试试试剂剂剂剂对对对对照照照照也也也也均均均均呈呈呈呈阴阴阴阴性性性性的的的的结结结结果果果果，谓谓谓谓之之之之假假假假阴阴阴阴性性性性。其其其其原原原原因因因因与与与与组组组组织织织织处处处处理理理理不不不不当当当当，组组组组织织织织细细细细胞胞胞胞抗抗抗抗原原原原丢丢丢丢失失失失或或或或试试试试剂剂剂剂错错错错误误误误(如如如如漏漏漏漏加加加加、错错错错加加加加、失失失失效效效效、变变变变质质质质等等等等),操作失误等有关。操作失误等有关。第35页，本讲稿共40页对照结果判断：表中表中1 15 5结果无效，结果无效，6 6、7 7结果可靠结果可靠（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）检测标本含抗体，结果可靠检测标本含抗体，结果可靠（）（）（）（）（）（）7 7检测标本不含抗体结合可靠检测标本不含抗体结合可靠（）（）（）（）（）（）6 6非特异染色非特异染色（）（）（）（）（）（）5 5阳性对照不含定位抗原阳性对照不含定位抗原（）（）（）（）（）（）4 4阴性对照内含定位抗原阴性对照内含定位抗原()()()（）（）（）（）3 3非特异性染色非特异性染色（）（）（）（）（）（）2 2抗体失活，操作有误抗体失活，操作有误（）（）（）（）（）（）1 1结果判断结果判断检测结果检测结果替代对照替代对照阴性对照阴性对照阳性对照阳性对照第36页，本讲稿共40页染色失败原因：均为阴性均为阴性均为弱阳性（除阴性对照）均为弱阳性（除阴性对照）背景染色过深背景染色过深阳性对照好，待检标本弱阳性阳性对照好，待检标本弱阳性阳性对照无背景，待检标本背景深阳性对照无背景，待检标本背景深第37页，本讲稿共40页判断原则：实验设计实验设计抗体选择抗体选择抗原定位性抗原定位性抗原分布不均一性抗原分布不均一性第38页，本讲稿共40页假阴性常见原因：抗原丢失或减弱抗原丢失或减弱 抗体失效或稀释度不当抗体失效或稀释度不当 操作失误操作失误假阳性常见原因：抗原弥散抗原弥散 抗原异位表达抗原异位表达 瘤细胞吞噬瘤细胞吞噬 病变中正常组织残留病变中正常组织残留 抗体交叉反应抗体交叉反应 内源性物质着色内源性物质着色第39页，本讲稿共40页 边缘、刀痕、皱折、坏死或挤压区域边缘、刀痕、皱折、坏死或挤压区域不作为判断依据，应用不作为判断依据，应用“正反法正反法”原则。原则。免疫组化标准化：抗原特异性抗原特异性抗体交叉反应和标记谱系抗体交叉反应和标记谱系方法规范化方法规范化结果综合分析和判断结果综合分析和判断第40页，本讲稿共40页