家蚕关键品质性状分子解析及分子育种基础研究.docx

项目名称：家蚕关键品质性状分子解析及分子育种基础研究首席科学家：夏庆友 西南大学起止年限：2012.1-2016.8依托部门：重庆市科委 教育部一、关键科学问题及研究内容1拟解决的关键科学问题 根据国家蚕丝产业发展重大需求和蚕业科学发展长远需要，以“十一·五”家蚕“973”项目研究为基础，“十二·五”期间紧紧围绕家蚕关键品质性状，重点解决如下两个关键科学问题： 第一：家蚕关键品质性状形成的分子机理 家蚕因食桑产丝，才可供人类利用，其关键品质性状主要有三：第一，丝蛋白合成与分泌机制。丝蛋白的组成和结构特征，决定了蚕丝关键品质性状。研究表明，家蚕丝的各种工艺性状，包括纤度（茧丝直径）、茧丝长度、净度（茧丝表面结构）、强伸力、抱合力以及解舒性能（丝胶溶解性）等，均受丝腺合成与分泌机制所调控；第二，发育变态与调控。家蚕是典型的完全变态昆虫，现行蚕桑生产体系，无不是根据家蚕生长与变态发育特征来安排。特别重要的是，家蚕生长与发育特征（例如个体大小、蜕皮和化蛹时期、成虫孵化时期）决定了蚕丝蛋白合成时期与合成量，整体上决定了家蚕的蚕丝生产特性；第三，对疾病的抵抗性。家蚕经过数千年人工驯化，尽管获得了适合群居饲养和发育整齐等有利于生产的特性，同时也有大规模易受病原微生物感染的不利性状。尽管蚕桑生产过程中的疾病防控受到高度重视，但每年蚕农因蚕感病造成的损失仍然高达25，并且高居不下。上述三个生理过程（或性状），是家蚕诸多影响蚕丝产量和品质中最为关键且相互联系的因素，决定了蚕丝生产的整体水平与效益，是本项目将要解决的第一关键科学问题。 在前一个项目中，家蚕性别决定、丝蛋白合成、发育和免疫等四大性状是作为其中的一个课题来布局的，并打开了关键的突破口。本期项目把性别决定之外的三个性状上升为三个课题，同时布局家蚕干细胞与不同组织器官变态发育过程中的分子基础研究，因为干细胞与组织器官再生与家蚕丝腺发育、变态发育和免疫防御有着重要的密切关系。根据已有基础，家蚕关键品质性状形成分子机理研究的具体科学问题分别如下： 蚕丝蛋白合成机理研究将着重解决丝蛋白基因的分子调控问题。家蚕幼虫期共食下鲜桑叶约22g，丝腺合成并分泌约0.5g丝蛋白。研究表明，家蚕丝蛋白合成调控有三大主要特点，一是蚕丝合成高效性：家蚕丝腺功能高度特异化，类似果蝇唾液腺，而丝蛋白质的合成主要由数目极其有限（140余个）的分泌细胞完成，这些细胞的细胞核内染色体高度多倍化，可达到50100万单倍基因组。二是部位特异性：蚕丝由家蚕体腔内左右对称分布的一对丝腺所合成，每条丝腺分前部、中部和后部三个功能区域，后部和中部分别特异合成家蚕丝素蛋白和丝胶蛋白等茧丝纤维的主要结构成分；这种部位特异性决定了蚕丝各组分，尤其是有效组分丝纤维的所占比例和加工特性。三是时间特异性：家蚕丝腺细胞分化于胚胎发育时期，尽管早期幼虫的蜕皮期能够合成少量蚕丝蛋白，但大量合成丝蛋白并形成丝纤维却是在末龄幼虫第3天开始，具有严格的时间调控。因此，阐明蚕丝品质性状机理，主要的科学内涵是回答上述三个特性的分子调控机制。前期研究表明，丝蛋白编码基因的转录和翻译机制是决定丝蛋白合成机制的关键因素。通过丝腺特异基因的大规模鉴定和功能研究，初步发现丝蛋白编码基因受两大信号通路的调控。一是激素信号通路，主要调控基因转录的时间特异性；二是受发育主控基因，即高度保守的同源异型盒（Homeobox）类转录调控因子所调控，主要决定丝蛋白基因表达的空间特异性。为此，本期项目将重点研究fib-H、fib-L、P25和Ser13等主要丝蛋白编码基因受激素信号和发育主控基因的调节机制，以期系统阐明丝蛋白合成分子机理及其与蚕丝品质之间的相互关系。 激素和营养信号传导与变态发育调控研究着重解决信号传导机制。与其它全变态昆虫一样，家蚕的变态发育主要受激素（神经肽激素、蜕皮激素、保幼激素和类胰岛素等）和营养（氨基酸、糖和脂肪酸等）的协同调控。目前知道，当家蚕从一个龄期幼虫向下一个龄期幼虫转变时，往往同时有高水平的蜕皮激素（20E）和保幼激素（JH）分泌，使得昆虫不会发育成蛹或成虫（蛾）。而在幼虫向蛹期发育时，体内有高水平的蜕皮激素，但保幼激素水平下降，使得幼虫向蛹期变态发育。因此认为，蜕皮激素控制着昆虫的蜕皮与变态发育进程；而保幼激素则调控着昆虫发育的方向。所以，蜕皮激素和保幼激素信号传导系统及其相互作用是变态发育的核心问题。而家蚕生长与发育特征（例如个体大小、蜕皮和化蛹时期、成虫孵化时期）决定了蚕丝蛋白合成时期与合成量。因此，激素和营养信号传导对变态发育的调控将极大地影响着蚕丝产量和品质。本项目前期研究发现，家蚕共计有87种神经肽激素、激素受体和激素调节相关基因；鉴定出18种对20E敏感的受体和受体型转录因子。此外，神经肽激素基因，包括滞育激素（DH）、信息素生物合成激活神经肽（PBAN）、脂动激素（AKH）、羽化激素和家蚕素（4K-PTTH）基因也被鉴定。在前一期项目重点开展了家蚕JH和20E合成代谢途径及信号传导途径相关基因的鉴定和功能初探的基础上，本期项目将以丝腺、脂肪体、中肠和表皮等组织器官为主要研究材料，重点研究昆虫变态发育的激素信号传导主要途径和关键调控分子的作用，揭示激素与营养信号与组织器官退化和再生的关系，建立比较完整的家蚕变态发育激素与营养调控的理论体系和机理模型，以期阐释昆虫变态发育这一重大的科学问题。干细胞与家蚕变态发育的组织器官再生机理研究着重解决成虫组织器官形成中的干细胞生物学行为变化及调控机制。家蚕变态发育期一般指5龄末期幼虫至成虫羽化阶段，包括幼虫-蛹和蛹-成虫（蛾）的变化过程。在变态过程中，幼虫专性组织如前胸腺、丝腺等迅速退化消亡，中肠、神经和脂肪体发生结构和功能的转变，翅原基、胸足原基和生殖腺细胞组织快速分化生长，并发育为成虫的器官组织。有关果蝇的研究表明，干细胞在变态发育期多种成虫组织器官分化形成过程中扮演着至关重要的角色，受到复杂的各种信号分子网络的调控。干细胞与组织器官再生不仅与变态发育有密切的关系，与丝腺发育和免疫防御也有着重要的关系。前期研究我们首先关注了家蚕中肠干细胞的鉴定与分化调节，在筛查家蚕中肠干细胞分子标记和鉴定变态发育过程中的家蚕中肠干细胞等方面取得突破进展。本期项目将以中肠、血液、神经、脂肪体、翅原基等组织器官为主要材料，系统研究这些组织器官在家蚕变态发育中分化形成与再生重建的干细胞分子基础，鉴定目标组织器官的干细胞，揭示干细胞在相关组织器官形成或重建过程中的自我维持与分化行为，阐释干细胞分化为相关组织器官的分子调控机制，这是在分子细胞生物学水平阐明昆虫变态发育这个重大科学问题的关键。 家蚕免疫调节与抗性机理研究将着重解决宿主对病原微生物的模式识别问题。昆虫体液免疫在抵抗病原微生物侵染中发挥着最重要的作用。昆虫体液分子免疫系统主要由模式识别、信号传导和效应因子表达三个部分组成。前期项目主要通过基因组分析和微生物诱导实验，基本查明了家蚕体液免疫信号传导过程的关键基因，系统鉴定了家蚕抗菌肽效应因子的组成和功能。研究发现，家蚕的免疫相关基因和信号传导途径比较保守，与模式生物果蝇的Toll和Imd两种先天免疫信号途径应答基本一致，但家蚕效应因子体系与果蝇相比又具有一定的特殊性。前期项目还对Toll信号途径中的Toll受体、Spätzle、MyD88和Tube等，Imd途径中的Imd、FADD、IKK和relish等关键基因进行了深入研究。作为免疫应答的前哨，昆虫病原模式识别受体是激发免疫信号传导通路和效应因子产生的关键。昆虫对不同的病原物具有高度特异的模式识别，剖析昆虫病原物的模式识别，也是阐明和提高家蚕抗病性的重要靶标。在前期项目系统鉴定信号传导和免疫应答体系的基础上，本期项目将重点研究家蚕对不同专有性病原微生物的模式识别分子，以及它们在启动免疫信号通路中的具体功能，以期阐明家蚕重要病害形成的机制，寻求新的防御措施。 丝蛋白合成的分子调控作为昆虫特异基因调控的研究模式，对昆虫发育和分子生物学的基础研究将提供重要补充作用；激素信号与变态发育调控、干细胞与变态发育的组织器官再生机理，以及免疫分子机制，更是昆虫基础科学研究的前沿和热点。因此，这几个方面的科学问题相互联系，不但作为家蚕关键品质性状对蚕丝业生产举足轻重，而且也作为昆虫基础科学的重要领域，对整个昆虫学研究发展和害虫防治新策略的产生都具有十分重要的意义。 第二：家蚕分子育种理论基础与技术体系 在“十一·五”家蚕“973”项目的支持下，许多与重要经济性状相关功能基因得到鉴定，遗传素材创新基础平台建设也已经初具规模。系统研究家蚕分子育种的理论体系，并建立相应的技术平台，培育高产优化的家蚕品系，成为下一个五年计划必需解决的重点问题。 家蚕分子育种理论体系亟需着重解决分子改良靶标和实现思路。家蚕自野蚕经人工选择和驯化而来，与野蚕祖先相比，家蚕的产丝性能提高近10倍。1930年代开始利用一代杂种优势，蚕丝产量比饲养纯种又提高了近20。自此，家蚕生产能力达到了一个难以逾越的高峰，使得其后近80年间未见革命性突破。与其它植物或动物生产一样，家蚕品种也正处于分子改良甚至系统分子育种的前夜，新的突破机遇需要坚实的理论基础。现有遗传资源中本身就存在着大量发育、变态和抗性突变系。如前所述的三个关键性状中，家蚕激素调节与免疫性状实现分子育种的靶标位点相对较多，而蚕丝蛋白合成调节的靶标位点相对较少。初步研究成果表明，通过调节丝腺发育和丝蛋白编码基因转录，可能是实现丝产量和品质改良的有效途经。本期项目将以前述家蚕几个关键品质性状的分子解析为基础，建立家蚕分子育种的基本思路和策略，为家蚕品种的分子改良奠定坚实的理论基础。 家蚕分子育种技术体系着重解决遗传互作和基因敲除技术的建立。从基因层面讲，分子育种无外乎有两个技术途经：一是已有基因功能的加强甚至新功能的导入；二是已有基因功能的减弱甚至彻底丧失。通过前期项目研究，建立了比较稳定和有效的家蚕转基因技术体系，以及系统RNAi、GAL4/UAS转基因等分子遗传操作方法。但是，从家蚕分子育种的技术储备和现实要求而言，还丞需建立和完善遗传互作和基因敲除等关键技术。为此，本期项目将着重解决：克隆不同发育时期和组织器官的特异启动子或顺式作用元件，建立多个GAL4转基因系，以实现目的基因的时空特异转录调控；利用UAS使目的基因功能加强或获得新功能，并整合RNAi使目的基因功能消弱或丧失；研究建立2个UAS元件控制2个基因的遗传操控及其互作：2个基因同时获得功能、2个基因同时丧失功能、1个基因获得功能而另1个基因丧失功能；结合GAL4/UAS转基因和FRT-FLP mosaic技术，建立Flp-out mosaic方法，分析在任一组织、任一发育时期基因获得功能或丧失功能的细胞与外周野生型细胞的差异。家蚕中至今尚未实现基因的有效定向敲除（knock out）和敲入（knock in），本期项目将通过锌指核酸酶等方法建立家蚕基因定向敲除和敲入技术，通过对分子靶标的操控实现家蚕基因组的有效和定向编辑，为家蚕关键品质性状基因功能研究和分子改良与素材创新搭建关键技术平台。 2主要研究内容 围绕以上两个关键科学问题，计划从三个方面开展研究：（1）家蚕重要功能基因的定位克隆 前期项目已经建立了家蚕突变基因定位克隆平台技术，以此为基础，本期将重点围绕家蚕丝品质、变态发育和抗性性状，定位克隆研究重要的突变基因，在布局上将分解到三个品质性状相关的课题开展研究。开展此研究的主要目的在于保持前沿探索，不断推动家蚕功能基因组研究的长期和可持续发展。 （2）家蚕关键品质性状的分子解析 从基因层面解析家蚕丝蛋白合成、激素调控与变态发育、干细胞分化与组织器官形成以及分子免疫的分子机制，是本项目的核心和重点之一。因此在布局上，三个关键性状以及干细胞分化与组织器官形成均单独列为课题开展研究。丝蛋白合成研究将围绕家蚕丝素重链基因（fib-H）、轻链基因（fib-L）、丝胶基因（Ser13）和P25等蚕丝主要结构蛋白编码基因的转录调控机理展开，重点研究包括丝腺细胞发育与功能分化，丝蛋白编码基因表达与激素信号的相互关系，丝纤维主要组成蛋白晶体结构解析，各组成蛋白数量和结构与丝纤维加工工艺性状之间的关系等内容。家蚕发育激素调控研究将围绕激素信号传导体系展开，重点包括激素结合蛋白或受体及信号传导途径关键转录因子的克隆和功能研究，蜕皮激素和保幼激素信号传导途径关键调控因子的相互作用，昆虫激素与营养调节的关系，以及激素调节与家蚕旧组织退化和新组织形成之间的关系等内容。干细胞与家蚕变态发育的组织器官再生机理重点围绕家蚕变态发育中成虫组织器官形成的干细胞基础展开，重点包括家蚕变态发育中特定组织干细胞的鉴定，组织器官发生或重建中干细胞的自我维持与分化行为，干细胞分化发育与相关组织器官的分子调控机制等内容。家蚕分子免疫研究将围绕家蚕对专有病原微生物的分子识别展开，包括家蚕对主要病原微生物侵染的反应及病原识别因子的鉴定，免疫应答及抗微生物肽表达调控，主要病原微生物与宿主的互作，以及抗病和抗逆的分子基础等内容。 （3）家蚕分子育种理论基础与技术体系研究家蚕分子育种理论基础与技术体系建立是整个项目的终极目标和指引方向，在布局上列为两个课题开展研究。理论基础围绕家蚕分子改良的分子靶标和实现途径开展研究，重点包括丝蛋白编码基因上调表达研究，丝腺组织发育分子调控以及与对产丝量的影响，家蚕激素信号传导对丝蛋白合成的影响，家蚕分子免疫信号调控与疾病抵抗性的调节等主要内容，整体上要求明确关键品质性状人为调节的可能环节和关键因子，形成家蚕分子育种的理论体系。分子育种技术体系围绕家蚕分子遗传操作体系和基因定向敲除技术开展工作，重点包括利用GAL4/UAS双开关实现目的基因的时空特异调控，研究2个基因的同步调控及其遗传互作，建立Flp-out mosaic技术并分析突变体细胞和野生型细胞的差异，利用锌指核酸酶等技术实现家蚕基因的定向敲除和基因替换，家蚕基因敲除与转基因技术的整合和遗传调控等内容。整体上要求实现可人为干预任何一个靶标基因功能的分子育种平台。该两个课题还将利用整个项目产出的基础研究成果，创新家蚕遗传素材，培育新型高产优质和满足特殊需求的新品种，推动蚕丝产业整体技术水平和综合效益的大幅度提升，为国民经济建设和蚕农增收服务。二、预期目标1总体目标根据国家蚕丝产业发展重大需求和蚕业科学发展长远需要，以“十一·五”家蚕“973”项目研究为基础，“十二·五”期间总体目标是：1）充分挖掘利用家蚕全基因组生物信息学资源和突变资源，围绕关键品质性状，尤其是丝蛋白产量和质量性状，克隆或鉴定重要关键基因，解析其调控途径，阐明关键品质性状形成的分子机理；2）建立和完善家蚕基因调控和定向敲除等关键平台技术，实现完整的功能丧失和功能获得等遗传分析及素材创新必需手段，建立分子育种的理论基础和技术体系，创制新型素材，培育新型品种。总体上要求围绕解决提高蚕丝产量和质量这个具体的科学和生产问题，取得系统性和标志性的重大理论突破，以推进我国蚕丝产业技术革命，并进一步夯实我国家蚕基础研究的国际领先优势，培养造就一批具有国际影响的中青年学术带头人和技术骨干。2五年预期目标（1）阐明四个机制，形成一个理论基础，建立一个技术体系：以家蚕基因组和功能基因组学研究成果为基础，通过分子、细胞和个体水平的系统研究，阐明家蚕关键品质性状形成的分子机制，即家蚕高效特异合成丝蛋白的分子调控机制，家蚕激素信号传导途径与变态发育调节机制，家蚕干细胞分化形成成虫组织器官的分子机制，家蚕分子免疫系统中病原模式识别与抗性形成的分子机制；通过研究，明确家蚕分子改良关键靶标和策略模型，建立完善的家蚕分子育种理论基础；建立包括基因敲除等在内的家蚕基因遗传操控和基因组定向编辑技术，以形成分子育种的完整技术体系。整体上将家蚕功能基因组研究深化和拓展到系统的性状分子解析与产业应用新阶段。（2）定位克隆至少25个以上的重要突变基因，通过功能验证和机理解析揭示新的信号通路或调控途经。（3）深入研究至少25个与丝产量品质、变态发育激素调节、成虫组织干细胞发育分化和抗病性密切相关的调控基因，获取15个左右的关键顺式作用元件，取得基因专利40项。（4）创制15个以上的高产、优质、强健新型遗传素材，培育2个标志性新蚕品种。（5）出版学术专著3部，在国内外核心刊物发表论文300篇，其中有重要影响的论文50篇以上，并发表35篇有重要理论突破的高水平研究论文；培养和造就一批中青年学术带头人和不同层次的科技新人，其中包括硕士研究生200名、博士研究生100名和博士后15名。三、研究方案1学术思路 利用家蚕全基因组序列和高精度遗传变异图谱，通过家蚕基因定位克隆、基因敲除和敲入，转基因及RNA干扰等现代分子生物学技术，以家蚕丝蛋白合成、变态发育激素调节、组织器官形成的干细胞基础以及分子免疫为目标，系统深入研究关键基因的调控方式和信号传导，解析关键品质性状的分子机理；利用GAL4/UAS系统在特定组织特定时间解析特定基因的功能和调控；利用锌指核酸酶等技术实现家蚕基因组的定向编辑，研究建立家蚕分子育种理论和技术；通过对关键分子靶标的遗传操作实现品质性状的分子改造、素材创新和品种育成，奠定产业实际应用的基础。同时，使家蚕作为鳞翅目模式昆虫的研究提升到一个新的台阶。 2技术途径 项目总体采用三条主要技术路线：一是精细图谱变异图谱基因定位，二是基因功能调控机理性状形成，三是关键基因素材创新产业应用。具体如下： （1）精细图谱变异图谱基因定位 基于家蚕重测序建立的高精度变异图谱，筛选有效的SNPs定位标记；制作突变材料作图群体（BF1或F2），利用经典连锁信息和精细图谱，确定多态型标记；对群体进行分子标记和性状之间的连锁分析，逐步缩短性状连锁区间至最小范围；利用精细图谱确定所在区间候选基因，通过表达分析、突变位点分析基因功能确定突变基因。 （2）基因功能调控机理性状形成 针对不同基因，设计不同技术路线研究基因调控机理：丝蛋白编码基因主要通过生物信息分析筛选候选顺式作用元件，利用DNA蛋白质结合技术鉴定顺式作用元件和转录调控因子，进而探索转录调控与激素信号等通路之间的联系；激素与发育相关基因将主要通过转基因和RNAi等技术，对目标基因进行功能研究和调控分析，以及通过组织和细胞分离与离体转化和培养技术对基因表达调节和功能在分子、细胞、器官和个体水平上进行研究；干细胞发育分化相关基因主要通过荧光示踪鉴定特定组织的干细胞和寻找干细胞发育和分化的关键节点，结合基因芯片、基因诱捕、生物信息学等技术手段，建立成虫组织干细胞的分化调控网络；免疫相关基因主要通过Pull-down等鉴定与病原物结合的蛋白，通过基因在细胞或者个体表达调控研究对下游信号通路、抗菌效应因子和病原诱导存活率的影响。 （3）关键基因素材创新产业应用 根据家蚕分子育种理论和设计，以piggyBac为载体，实现有用基因的正向改良（新功能获得或加强），利用转基因RNAi或者锌指核酸酶技术，实现基因功能的反向改良（削弱或者彻底丧失功能），利用转基因技术和GAL4/UAS遗传开关，实现对多个基因同时操作，实现优良性状整合，创制新型素材；通过经典育种程序，选择稳定的品系，育成高产优质品种。 总体技术路线如下：3创新点与特色 （1）重要品质性状关键基因作用机理及其调控网络的系统性解析 重点抓住蚕产量和品质关键，通过丝编码基因调控机理、变态发育激素调控、成虫组织干细胞发育分化和免疫与抗性四个密切相关的课题，系统并深入解析家蚕重要品质形成的关键基因和调控网络。因此，从整体上讲，本项目是在完整基因组生物信息学基础上，将首次实现生物信息学、基因组学和功能基因组学等大规模分析平台与分子生物学、发育生物学和遗传学等分析方法的有机结合，高起点、高通量、高效率地解剖决定重要品质性状的关键途径的机理，将系统地揭示家蚕特有的和区别于其它昆虫、动物和植物的基因作用方式。 （2）突破分子育种理论和技术关键 其它昆虫（主要是害虫）的基础研究主要以控制和防治为目的，而本项目的主要目标集中于有效利用，具有特殊性。项目将率先建立家蚕分子育种理论和技术体系，实现素材创新和育种。与蚕丝产业技术传统研究相比，具有理论上的先进性、技术方法的现代性和研究方案的高效性，将突破传统育种无法逾越的障碍，推动蚕丝业技术革命并奠定长远可持续发展基础。 （3）推动家蚕作为昆虫研究模式的发展 项目所重点涉及的家蚕丝蛋白合成、发育变态激素调节、成虫组织干细胞发育分化和免疫抗性的分子机理研究等内容，在理论上属于昆虫科学前沿性重大科学问题。另一方面，与小鼠、线虫、果蝇、斑马鱼、拟南芥等其它模式生物相比，现代昆虫学研究还缺乏一种重要的模式昆虫，其主要障碍之一是缺乏有效的、专一的、定向的和可控的基因敲除与敲进等遗传操控技术体系。通过本项目将回答昆虫学前沿科学问题的同时，建立家蚕有效的遗传操控技术体系，突破家蚕昆虫模式化道路中的关键瓶颈，有力推动家蚕这一“中国果蝇”基础研究的快速发展。4可行性分析项目承担单位近年来共完成家蚕相关研究项目70余项，包括1项“973”项目、10项“863”项目、15项“九·五”和“十·五”重大科技攻关项目、4项国家自然科学基金重点项目和40余个面上项目，完成了项目的基础积累。特别是“十一·五”期间认真执行“973”家蚕项目，至少在三个方面奠定了本项目的重要基础：一是集中了全国优势力量，形成紧密的分工协作研究框架，通过引进和培养形成了一支强有力的研究队伍；二是各个承担单位建设了高水平的研究平台，并形成了各自的特色和优势；三是完成了前一期项目各项研究任务，建立了较为完善的平台技术，关键性状研究取得了突破。特别是，本期项目及时吸纳了从国外回国的华南师范大学冯启理教授和中科院上海生命科学研究院植物生理生态研究所李胜研究员两个优秀团队以及多名学术骨干，进一步加强了传统家蚕研究力量与模式昆虫（果蝇）和害虫防治研究力量的交叉整合，研究力量得到大幅度提升。 在工作保障方面，先后召开了多次全国性家蚕基础研究讨论会，统一了学术认识和研究思路，确立了有机的整体方案，形成了有效的协作机制。各成员单位均开展了具体的前期研究。通过国际学术交流和国际合作项目，与世界高水平研究机构建立了稳定的合作关系，为本项目的开展提供了良好的国际合作空间。此外，通过农业部行业技术体系，建立了国家蚕桑产业技术研发中心和技术研发服务网络，将有力支撑本项目成果的转化和应用。我们相信，通过立项，集成优势，紧密合作，完全可以在家蚕基础研究上做出更大更出色的标志性成果，为丝绸之路增添异彩，为中华民族产业的发展做出历史性贡献。5课题设置按总体研究目标和思路，将本项目分解为6个课题进行，具体目标和主要研究内容如下：课题1：蚕丝蛋白合成分子调控与蚕丝品质形成机理解析 研究目的：定位克隆与产丝量和丝品质相关的重要突变基因，探明家蚕发育主控信号对家蚕前部、中部和后部丝腺发育与细胞功能的异化关系，剖析蚕丝蛋白编码基因转录调控网络与调控机制，阐释决定家蚕产丝量和蚕丝主要工艺性状形成的分子机理。该课题为项目的核心。研究内容： （1）家蚕产丝量和丝品质相关突变基因克隆与功能研究一个新突变基因的获得，往往会导致一条控制重要生物性状的新机制的发现。在长期自然和人为选择过程中，积累了大量的家蚕突变品系，有关突变基因遗传研究基础相当扎实。在这些家蚕突变资源中，报道与蚕丝合成相关的近30个品系，其中相当一部分都保存至今，弥足珍贵。其中，与蚕丝产量相关的有5个，包括薄纸茧（flc，3连锁群-49.0座位（下同），后部丝腺分泌能力低下）、裸蛹（Nd，25-0.0，不分泌丝素）、丝胶茧（Nd-s，14-19.2，丝素轻链不能合成）和裸蛹b（Nd-b，遗传座位未知，丝腺退化）等；与蚕丝品质相关的有5个，绵茧（Fl，7-32.1，茧层浮松）和软茧（Sc，遗传座位未知，茧层柔软似绵）等；与蚕茧颜色相关的有12个，包括黄色、绿色、锈色等系列；与蚕营茧行为相关的有4个，包括破风茧和吐平板丝等。上述突变除裸蛹（Nds）基因已被定位克隆（编码基因外显子）外，其余突变基因和机制都不清楚。如能分离克隆这些突变基因，极有可能为家蚕丝蛋白合成研究和分子机制研究打开突破口。 前期项目重点建立了基于SNP标记的图位法克隆体系，并已经克隆或者精细定位了5个突变基因，其中包括与茧丝产量相关的裸蛹基因（Nd）和品质相关突变绵茧基因（Fl），均已被锁定到数百K距离，候选基因不超过10个。这两个突变具有重要的研究价值：首先，这两个突变基因座位都与具体的编码基因相去甚远，因此不可能是编码基因突变；其次，从候选基因的情况看，推测与激素和丝腺细胞发育信号相关。因此，本期项目将选一些与产量和质量相关重要突变，配制定位材料，通过高密度SNP标记，精细定位并分离克隆突变基因，重点通过对突变性状产生的分子机理研究，寻找家蚕丝蛋白合成调控中的信号通路，探索其与蚕丝产量和品质形成的关系。 （2）家蚕丝腺发育调控与丝蛋白编码基因表达的空间特异性 家蚕丝腺是起源于外胚层的器官，发生在胚子最长期和反转期。丝腺细胞仅在胚胎期发生10次细胞分裂。幼虫期，丝腺细胞不再发生分裂，至5龄后期，一个丝腺细胞核内DNA的复制次数达到2930次，细胞核内的DNA量增加至107g和214g，分别相当于原来的54万倍或108万倍。以满足后期丝蛋白大量合成的需要。丝腺细胞分化不但形成了功能特异的前、中和后部三个部分，而且决定了丝蛋白编码基因表达的空间特异性。项目将研究胚胎期丝腺细胞形成和分化，研究不同丝腺部位分子结构特征与功能的关系。丝蛋白编码基因存在着一些关键的顺式作用元件，我们将重点研究丝蛋白编码基因顺势作用元件Pax4、Pax6、FOX类的转录因子结合位点的功能。挖掘未知转录因子对丝蛋白编码基因的转录调控关系，鉴定家蚕丝蛋白编码基因与转录空间特异性相关的顺式作用元件，以阐明家蚕丝蛋白合成空间特异性的分子机制，并探索通过转录因子或者顺式作用元件的改造，提高丝产量或者改变蚕丝组分的可能性。 （3）家蚕丝腺发育调控与丝蛋白编码基因转录的时期特异性形成机理 家蚕在孵化之后，就具有合成少量丝蛋白的能力。幼虫各个生长龄期后部丝腺都能检测到丝素mRNA的转录；但是在眠期却没有丝素mRNA表达，表现为反复的“开与关”特征。当幼虫发育到末龄第3天，丝腺开始大量合成丝蛋白，直至幼虫期结束，丝蛋白充满整个丝腺腔体，以后则进入吐丝营茧期，表明家蚕丝蛋白合成具有严格的时期特异性。丝纤维三个组要组分，即丝素重链H、丝素轻链L和P25具有严格的比例（H:L:P25=6:6:1），这是形成丝素蛋白小体并最终形成丝纤维的决定性因素，表明不同丝蛋白编码基因的表达量调控具有协调性。 目前为止，已发现了几个丝腺特异因子，如SGF-1和SGF-3，它们参与了丝胶基因及丝素基因的转录调控。但其它几个重要的转录因子，如SGF-2、SGF-4及PSGF等却还未鉴定，它们很可能与丝素基因调控相关。前期项目在丝蛋白编码基因上游鉴定了两个与转录因子BR-C Z4和BR-C Z1结合的重要位点。BR-C是一个含有BTB蛋白结合结构域及1-4个锌指结构的转录因子，具有4种蛋白异构体，它是蜕皮激素的重要初级反应基因，并对家蚕的蜕皮和变态期基因的转录调控起着重要的作用。研究还发现，BR-C的表达时期与丝蛋白的表达时期是相反的，很可能与丝蛋白基因的上游结合位点序列结合，抑制丝素基因在眠期的表达。以此为基础，本期项目将重点研究家蚕丝蛋白主要编码基因上游顺式作用元件与激素信号系统之间的相互作用关系，结合本项目课题3，研究激素受体及各下游应答因子对丝蛋白合成的调控作用机制，阐明家蚕丝蛋白合成的时期特异性和不同丝纤维蛋白组分协同调控性对产丝量的影响。 （4）家蚕丝产量和丝品质形成机理一般认为，家蚕产丝能力受多个基因调控并具有伴性遗传特征，而部分茧丝品质具有较高的遗传力。本部分研究将产丝量和品质形成机制的阐明作为重点，主要包括三个研究内容： 首先是定位和克隆产量主性状候选基因。家蚕的产丝性状主要包括茧重、茧层量和茧层率等指标，是长期以来育种工作的主要选择对象，虽然有不少提高但机制形成不明。前期项目中，我们利用高产品种“菁松”和低产品系“兰10”为材料，通过自交，分别得到这两个品系20代以上的自交系。然后利用近19万个SNP位点，对该材料进行了全面扫描，初步获得了全茧重、茧层量和丝长等性状显著密切相关的QTL位点，而茧层率也具有潜在的QTL位点。本期项目将在此基础上，进一步加大样本数量和标记密度，对主要产量性状主效QTL进行精细定位，并克隆分离主要基因或者调控区域，通过分子生物学手段，研究这些基因或者调控序列对家蚕产丝量的影响和作用机制。 其次是解析蚕丝主要成分蛋白的晶体结构。尽管我们知道蚕丝纤维由丝素重链H、丝素轻链L和P25蛋白所组成，但是对有关蛋白空间结构和蛋白质-蛋白质相互作用却毫不知情。日本提出了这三种蛋白的初步构象关系（丝蛋白小体结构模式），但缺乏结构生物学证据。丝纤维结构成为了悬而未决的世界难题。前期项目我们克隆了丝素重链N段序列，并获得了其编码蛋白的高分辨率晶体结构，首次发现了其立体结构以片层为主，并初步提出了丝纤维空间构象。以此为基础，本期项目将解析主要成分蛋白，包括丝素重链H、丝素轻链L和P25的晶体结构，不但破解这一世界难题，而且将探索丝蛋白空间结构与物理、化学特性之间的关系，探索丝蛋白结构与蚕丝加工工艺性状之间的关系。以结构生物学为指导，还将探索改变蚕丝蛋白编码基因或者蛋白质组分，以改进蚕丝工艺缺陷，开发新功能的可能途经。 第三是分析影响产丝产量和质量的其它重要因素。前期项目中，通过构建不同家蚕品系和野蚕全基因组高精度遗传变异图谱，共计鉴定了354个与产丝性状相关的蛋白质编码基因作为驯化的候选基因。特别重要的是，分析发现了若干与产丝性状相关的人工选择印记，其中有4、32和54个基因分别在丝腺、中肠和精巢中高量表达。在丝腺表达基因中，丝腺特异因子-1（Sgf-1）是与果蝇Fkh同源的一个基因，Sgf-1调控家蚕丝胶-1基因编码的丝胶蛋白和三个分别编码丝素重链、轻链和fhx/P25丝素基因的转录。另一个家蚕丝腺高量表达的基因是BGIBMGA005127，与果蝇sage基因同源。它在高丝量品种中的含量是常规品系“大造”的4倍。在果蝇中，Fkh和sage分别协调控制丝胶基因SG1和SG2的转录，它们在丝胶蛋白的合成和分泌中起着重要的作用。本期项目将重点探讨这些候选基因在蚕丝产量和品质形成中的重要作用，综合上述各方面的研究成果，探索家蚕较之野蚕产丝能力和丝品质差异的主要分子机制。 五年预期目标：（1）丝腺突变基因的定位克隆。定位克隆至少9个与丝腺突变相关基因，完成包括这些基因在内的9个与丝产量和丝品质密切相关的调控基因的功能研究，解析突变性状产生的分子机理，揭示家蚕丝蛋白合成调控中的信号通路及其与蚕丝产量和品质形成的关系。 （2）阐明家蚕丝蛋白合成时空特异性的分子机制。包括家蚕丝蛋白合成空间特异性和时期特异性的分子机制，以及不同丝纤维蛋白组分协同调控性对产丝量的影响；获取5个左右的关键顺式作用元件，并探索通过转录因子或顺式作用元件的改造，提高丝产量或改变蚕丝组分。 （3）阐明家蚕丝产量和丝品质形成机理。对主要产量性状主效QTL进行精细定位，克隆获得主要基因或者调控区域，探明这些基因或调控序列对家蚕产丝量的影响和作用机制；解析丝素重链H、丝素轻链L和P25的晶体结构，探明丝蛋白空间结构与物理、化学特性以及与蚕丝加工工艺性状之间的关系；分析与产丝性状相关的蛋白质编码基因在蚕丝产量和品质形成中的重要作用，探明家蚕较之野蚕产丝能力和丝品质差异的主要分子机制。总体上阐明决定家蚕产丝量和蚕丝主要工艺性状形成的分子机理，探索通过改变蚕丝蛋白编码基因或蛋白质组分，改进蚕丝工艺缺陷，开发新功能的可能途经，为进一步的分子育种奠定理论基础。 （4）取得基因专利6项；出版专著1部，在国内外核心刊物发表论文55篇，其中有重要影响的论文10篇以上，发表1篇有重要理论突破的高水平研究论文。 （5）培养和造就一批中青年学术带头人和不同层次的科技新人，其中包括硕士研究生35名、博士研究生15名和博士后2名。经费比例： 17.32% 承担单位： 浙江大学、西南大学、安徽农业大学、中国科学技术大学 课题负责人： 钟伯雄 学术骨干： 缪云根、刘春、孟艳、李卫芳课题2：家蚕激素和营养信号传导与变态发育调控研究研究目的：重点研究家蚕变态发育的昆虫激素信号转导主要途径和关键调控分子的作用，揭示激素调控与营养代谢及其与器官退化和再生的关系，比较完整地建立关于家蚕变态发育的理论体系和机理模型以解释昆虫变态发育这个重大的科学问题，促进通过控制变态发育以提高家蚕蚕丝产量和质量的技术和策略的发展及应用，并为以变态发育相关基因和蛋白为分子靶点进行鳞翅目害虫的生物防治和研制新型杀虫剂的发展策略提供理论依据与技术指导。研究内容：（1）蜕皮激素和保幼激素协同调控家蚕变态发育的分子机制 幼虫蜕皮时，血淋巴中同时有高水平的蜕皮激素（20E）和保幼激素（JH）；而在幼虫-蛹变态时，血淋巴中只有高水平的蜕皮激素，而保幼激素水平较低。总体而言，蜕皮激素控制着昆虫的蜕皮与变态发育进程，而保幼激素控制着昆虫发育的方向。所以，蜕皮激素和保幼激素信号传导途径及其分子互作是变态发育的核心问题。前期项目已经完成了家蚕变态发育期基因表达谱的全基因组芯片分析，并着重分析了家蚕20E和JH合成代谢途径相关的基因，以及20E和JH信号传导途径相关基因的功能。已克隆获得激素受体EcR-A、EcR-B和USP-1、USP-2和转录因子HR3、HR39、BR-C-Z4、FTZ-F1、E75A、E75B、E75C等基因，并分析了这些基因在不同时期和组织中的表达情况，初步明确了这些基因表达的时空特征与20E的滴度变化以及与变态发育调控的关系。 本期项目将以家蚕丝腺、脂肪体、中肠和表皮为主要研究材料，阐明20E和JH的信号传导途径及其分子互作，这两种激素如何协同决定家蚕的变态发育。主要内容包括：1）比较家蚕蜕皮与变态过程的基因表达特征，鉴定差异表达基因并探究其与20E或JH应答关键因子作用的关系，阐释其在两种不同蜕皮与变态形式中的分子作用；2）基于家蚕眠性突变基因品系和家蚕分子标记（SNP或SSR）连锁图谱，通过定位克隆技术，对家蚕眠性突变材料与正常品种的回交群体及亲本进行分子标记连锁分析，锁定眠性突变区域，分离克隆眠性突变基因，详细分析其在眠性形成（幼虫蜕皮）中的功能；阐明咪唑类激素诱导家蚕眠性变化机制，明晰家蚕眠性变化过程中和二眠化后，20E和JH合成及作用相关的基因和蛋白表达谱变化规律；3）基于家蚕化性突变基因品系，分离克隆家蚕化性决定基因，探讨其与20E的作用关系及其在化性调节中的分子作用机理；4）对家蚕中眠性和化性突变体基因、JH和20E合成途径（如JHAMT）和信号传导途径（如MET）中的一些关键基因进行RNAi、基因敲除和转基因研究；5）家蚕JH和20E的信号传导和分子互作。发现MET与20E受体形成超级受体复合体，探究MET与EcR-USP的蛋白质-蛋白质相互作用，阐释MET如何参与JH和20E信号、如何桥接JH和20E信号传导的分子互作；6）JH和20E信号传导途径中关键转录因子基因对家蚕丝腺发育和蚕丝产量的调控；7）研究调控蛹期专一表达的表皮蛋白基因的调控，如JH和20E两个激素信号系统对蛹期专一转录因子BR-C和其上游调控基因met、gce和Kr-h1等的调控；研究BR-C转录因子对其下游转录因子POUM2和bFTZ-F1的调控作用的分子机理；分离和鉴定与转