DNA重组技术与基因操作.ppt

第二章第二章DNA重组技术与基本操作重组技术与基本操作限制性内切酶限制性内切酶 克隆载体克隆载体重组基因的导入和筛选重组基因的导入和筛选获得真核生物目的基因的方法获得真核生物目的基因的方法DNA重组重组技术要有技术要有四个必要四个必要条件：条件：工具酶、工具酶、基因、基因、载体、载体、受体细胞受体细胞DNA限制性内切酶可分为三类：限制性内切酶可分为三类：、类限制性内切酶是基因工程中所用的主要工具酶类限制性内切酶是基因工程中所用的主要工具酶、限制性内切酶在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依限制性内切酶在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖于赖于ATP的限制性内切酶活性。的限制性内切酶活性。类酶在识别位点上切割DNA，然后从底物上解离下来。类酶结合于特定的识别位点，但却没有特定的切割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难形成稳定的、特异性切割末端。、酶在基因工程中基本不用 第一节限制性内切酶第一节限制性内切酶一、一、II类限制性内切酶的特点类限制性内切酶的特点识别特定的核苷酸序列，其长度一般为识别特定的核苷酸序列，其长度一般为4 4、5 5或或6 6个个核苷酸且呈二重对称，但有少数酶识别更长的序核苷酸且呈二重对称，但有少数酶识别更长的序列或兼并序列列或兼并序列；具有特定的酶切位点具有特定的酶切位点 ，产生出特定的酶切末端产生出特定的酶切末端55突出粘末端、突出粘末端、33突出粘末端、平末端；突出粘末端、平末端；类限制修饰系统是由两种酶分子组成的二元类限制修饰系统是由两种酶分子组成的二元系统；限制性内切酶、独立的甲基化酶。系统；限制性内切酶、独立的甲基化酶。5突出粘性末端突出粘性末端EcoRI的识别序列为的识别序列为3突出粘性末端突出粘性末端Pst识别位点识别位点平端平端 SmaSma识别位点识别位点5GAATTC33CTTAAG5切割切割5-G-CTTAAAATTC-3G-5+5CTGCAG33GACGTC55-CTGCA3-G G-3ACGTC-5+5CCCGGG3GGGCCC5CCCGGGGGG3CCC+二、使用限制性内切酶时应注意的问题二、使用限制性内切酶时应注意的问题1、仔细查阅酶的识别序列和切割位点。、仔细查阅酶的识别序列和切割位点。同裂酶：不同来源但是识别同样顺序和相同切割位点的限同裂酶：不同来源但是识别同样顺序和相同切割位点的限制性内切酶。制性内切酶。同尾酶：有时有两种限制性内切酶识别不同的核苷酸序列，同尾酶：有时有两种限制性内切酶识别不同的核苷酸序列，但切割后但切割后DNADNA分子所产生的粘性末端却相同，这类酶为具分子所产生的粘性末端却相同，这类酶为具不同酶切位点的不同酶切位点的DNADNA片段重组提供了方便片段重组提供了方便，但要注意，往但要注意，往往相容的粘性末端再用往相容的粘性末端再用DNADNA连接酶连接后，都不能再被其连接酶连接后，都不能再被其切割了。切割了。2、注意酶反应条件，相同反应条件的酶可以同时酶注意酶反应条件，相同反应条件的酶可以同时酶解解DNA样品。样品。3、注意说明书中所列出的、注意说明书中所列出的comments的内容，会提供的内容，会提供有关限制性内切酶识别序列中位点特异性甲基化有关限制性内切酶识别序列中位点特异性甲基化的信息以及引起酶产生的信息以及引起酶产生staractivity的原因。的原因。star activitystar activity：指当酶的反应条件改变时，其在识别序列：指当酶的反应条件改变时，其在识别序列中的酶切位点发生改变。中的酶切位点发生改变。产生的原因：反应体系中甘油的浓度产生的原因：反应体系中甘油的浓度1212；酶：；酶：DNADNA比率比率25u/g25u/g；缺少；缺少NaclNacl和存在和存在MnMn2 2。4、注意酶的浓度，酶切时不是酶加得越多越好。、注意酶的浓度，酶切时不是酶加得越多越好。一般以在一般以在20l20l反应体积中，反应体积中，3737，每小时水解，每小时水解1 1微克微克DNADNA的的酶量定为一个酶单位。酶量定为一个酶单位。5、注意酶在保温过程中的活性变化。、注意酶在保温过程中的活性变化。ACCACC在在5 5 小时内具有全部活力小时内具有全部活力BamHBamH在第一个小时内具有全部活力，在第二小时具有部在第一个小时内具有全部活力，在第二小时具有部分活力，而在分活力，而在2 2小时以后就无活力了。小时以后就无活力了。CfoCfo仅在第一个小时内具有全部活力，一个小时以后就没仅在第一个小时内具有全部活力，一个小时以后就没有活力了。有活力了。三、连接酶三、连接酶定义：用于将两端乃至数段定义：用于将两端乃至数段DNA片段拼接起来的酶。片段拼接起来的酶。用途：用途：（1）、连接带匹配粘末端的）、连接带匹配粘末端的DNA分子；分子；（2）、使平末端的双链）、使平末端的双链DNA分子相互连接或与合成的分子相互连接或与合成的寡核苷酸接头相连接。寡核苷酸接头相连接。这类反应要比粘末端之间连接慢得多，但单价阳离子这类反应要比粘末端之间连接慢得多，但单价阳离子（150-200mmol/LNacl150-200mmol/LNacl）或低浓度的聚乙二醇（）或低浓度的聚乙二醇（PEGPEG）可提高连接效率。可提高连接效率。四、修饰酶四、修饰酶1、DNA聚合酶：聚合酶：大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I，大肠杆菌，大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I大片段大片段（klenowfragment）、）、T4噬菌体噬菌体DNA聚合酶、聚合酶、T7噬菌体噬菌体DNA聚合酶、耐高温聚合酶、耐高温DNA聚合酶（如聚合酶（如TaqDNA聚合酶）、反聚合酶）、反转录酶、末端脱氧核苷酸转移酶等转录酶、末端脱氧核苷酸转移酶等2、依赖于、依赖于DNA的的RNA聚合酶：聚合酶：SP6噬菌体及噬菌体及T7和和T3噬菌体噬菌体RNA聚合酶聚合酶用途用途:在在invitro条件，合成单链条件，合成单链RNA作为杂交探针。作为杂交探针。3、T4噬菌体多核苷酸激酶：噬菌体多核苷酸激酶：催化催化ATP的的磷酸基转移至磷酸基转移至DNA或或RNA片段的片段的5末末端。端。用途：标记用途：标记DNA片段的片段的5端端，制备杂交探针；基因化，制备杂交探针；基因化学合成中，寡核苷酸片段学合成中，寡核苷酸片段5磷酸化；用于测序引物磷酸化；用于测序引物的的5标记。标记。5HOOH3HOOH355突出末端突出末端5隐蔽末端隐蔽末端532POH3HO32P3532PATP4、碱性磷酸酶：、碱性磷酸酶：用途：用途：去除去除DNA片段片段5末端的磷酸，以防止在重组中自身末端的磷酸，以防止在重组中自身环化，从而提高重组效率；环化，从而提高重组效率；在用在用32pATP标记标记DNA或或RNA的的5末端前，末端前，去除去除DNA或或RNA片段的非标记的片段的非标记的5磷酸。磷酸。5POH3HOP355突出末端突出末端5隐蔽末端隐蔽末端OHHO5HOOH335第二节克隆载体第二节克隆载体基因工程载体应具备的条件：基因工程载体应具备的条件：能自我复制并能带动插入的外源基因一起复制；能自我复制并能带动插入的外源基因一起复制；具有合适的限制性内切酶位点：具有合适的限制性内切酶位点：在载体上单一的限制性酶切位点越多越好，这样可以将不同限制在载体上单一的限制性酶切位点越多越好，这样可以将不同限制性内切酶切割后的外源性内切酶切割后的外源DNADNA片段方便的插入载体片段方便的插入载体；在细胞内拷贝数要多，这样才能使外源基因得以扩增；在细胞内拷贝数要多，这样才能使外源基因得以扩增；载体的分子量要小，这样可以容纳较大的外源载体的分子量要小，这样可以容纳较大的外源DNA插入片段：插入片段：在细胞内稳定性高，这样可以保证重组体稳定传代而不易丢失；在细胞内稳定性高，这样可以保证重组体稳定传代而不易丢失；应该有一个或多个选择标记。应该有一个或多个选择标记。大肠杆菌表达载体应具备：大肠杆菌表达载体应具备：强的启动子，一个强的可诱导的启动子可使外源基强的启动子，一个强的可诱导的启动子可使外源基因有效的转录；因有效的转录；在启动子下游区和在启动子下游区和ATG（起始密码子）上游区有一（起始密码子）上游区有一个好的核糖体结合位点序列（个好的核糖体结合位点序列（SD）；）；在外源基因插入序列的下游区要有一个强的转录终在外源基因插入序列的下游区要有一个强的转录终止序列，保证外源基因的有效转录和质粒的稳定性。止序列，保证外源基因的有效转录和质粒的稳定性。一、质粒一、质粒定义：质粒是能自主复制的双链环状定义：质粒是能自主复制的双链环状DNADNA分子，分子，它们在细菌中以独立于染色体之外的方式存在。它们在细菌中以独立于染色体之外的方式存在。ABOCSCLF F质粒质粒：有些携带有帮助其自身从一个细胞转入另：有些携带有帮助其自身从一个细胞转入另一个细胞的信息的质粒。一个细胞的信息的质粒。R R质粒质粒：表达对一种抗生素的抗性的质粒。：表达对一种抗生素的抗性的质粒。降解质粒降解质粒：携带参与或控制一些不同寻常的代谢途：携带参与或控制一些不同寻常的代谢途径的基因的质粒。径的基因的质粒。穿梭载体穿梭载体：在大肠杆菌的载体上放上第二个复制起：在大肠杆菌的载体上放上第二个复制起始位点，使它在另一个宿主细胞中也能进行复制始位点，使它在另一个宿主细胞中也能进行复制。1、质粒载体、质粒载体pBR322大小为大小为4363bp4363bp；含有两个抗生素基因（抗氨苄青霉素和抗四环素）；含有两个抗生素基因（抗氨苄青霉素和抗四环素）；有单一的有单一的BamHBamH、HindHind和和SalSal的识别位点（在的识别位点（在四环素抗性基因内）、四环素抗性基因内）、PstPst识别位点（在氨苄青识别位点（在氨苄青霉素抗性基因内）；霉素抗性基因内）；外源片段在外源片段在BamHBamH、HindHind、PstPst位点插入时，可位点插入时，可引起抗生素失活来筛选重组体引起抗生素失活来筛选重组体。带有一个复制起始点，可以保证这个质粒只在大带有一个复制起始点，可以保证这个质粒只在大肠杆菌里行使复制功能，在大肠杆菌里肠杆菌里行使复制功能，在大肠杆菌里pBR322pBR322以以高拷贝数存在。高拷贝数存在。2 2、质粒载体、质粒载体pUC19pUC19大小为大小为2686bp2686bp；带有带有pBR322pBR322的复制起始位点，一个氨苄青霉素抗性的复制起始位点，一个氨苄青霉素抗性基因；基因；一个大肠杆菌乳糖操纵子一个大肠杆菌乳糖操纵子半乳糖苷酶基因的调半乳糖苷酶基因的调节片段（节片段（lacZlacZ）,一个调节一个调节lacZlacZ基因表达的阻基因表达的阻遏蛋白的基因遏蛋白的基因lacIlacI；含有多个单克隆位点。含有多个单克隆位点。pUC19pUC19的筛选：的筛选：培养基中含有异丙基硫代半乳糖苷（培养基中含有异丙基硫代半乳糖苷（IPTGIPTG，laclac操纵操纵子的一个诱导物）时，子的一个诱导物）时，lacIlacI的产物就不能与的产物就不能与lacZlacZ的启动子区域结合，质粒的启动子区域结合，质粒pUC19pUC19的的lacZlacZ就可以转录，就可以转录，进而翻译，进而翻译，lacZlacZ蛋白会与染色体蛋白会与染色体DNADNA编码的一个蛋白编码的一个蛋白形成具有活性的杂合形成具有活性的杂合半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。在底物在底物5 5溴溴4 4氯氯3 3吲哚吲哚半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（X-X-galgal）存在下，）存在下，X-galX-gal会被杂合会被杂合半乳糖苷酶水解半乳糖苷酶水解成蓝色的产物，没有插入外源成蓝色的产物，没有插入外源DNADNA序列的序列的pUC19pUC19质粒质粒克隆就呈蓝色。克隆就呈蓝色。由于由于pUC19pUC19的单克隆位点的序列是整合在的单克隆位点的序列是整合在lacZlacZ之中之中的，若的，若pUC19pUC19质粒中插入有目的质粒中插入有目的DNADNA片段，就会破环片段，就会破环lacZlacZ的结构，导致细胞无法产生功能性的的结构，导致细胞无法产生功能性的lacZlacZ蛋蛋白，也就无法形成杂合的白，也就无法形成杂合的半乳糖苷酶，因而菌半乳糖苷酶，因而菌落是白色的。落是白色的。穿梭质粒穿梭质粒:人工人工构建的具有两种构建的具有两种不同复制起点和不同复制起点和选择记号，可在选择记号，可在两种不同的寄主两种不同的寄主细胞中存活和复细胞中存活和复制的质粒载体制的质粒载体。二、二、噬菌体噬菌体噬菌体可以进入裂解循环，噬菌体可以进入裂解循环，2020分钟后就可使宿主分钟后就可使宿主细胞发生裂解，同时释放出大约细胞发生裂解，同时释放出大约100100个噬菌体颗个噬菌体颗粒。粒。噬菌体也可以进入溶源循环，即注入的噬菌体也可以进入溶源循环，即注入的DNADNA整合到整合到大肠杆菌的染色体中，以前噬菌体的形式潜伏起大肠杆菌的染色体中，以前噬菌体的形式潜伏起来，永久保留；但在某种营养条件或是环境胁迫来，永久保留；但在某种营养条件或是环境胁迫条件下，整合的条件下，整合的噬菌体噬菌体DNADNA可以切割出来进入可以切割出来进入溶源循环。溶源循环。噬菌体噬菌体DNADNA大约长大约长50kb50kb，其中大约，其中大约20kb20kb对于整对于整合切割过程极为关键，称为整合切割合切割过程极为关键，称为整合切割（I/EI/E）区域。）区域。对于构建文库，可将这对于构建文库，可将这20kbDNA20kbDNA片段去片段去掉，强迫重组的掉，强迫重组的噬菌体进入裂解循环。噬菌体进入裂解循环。整合切割区域整合切割区域尾部尾部基因基因头部头部基因基因粘性粘性末端末端粘性粘性末端末端负责负责DNA复复制的基因制的基因细胞裂细胞裂解基因解基因噬菌体的噬菌体的DNA示意图示意图左臂左臂右臂右臂噬菌体头的大小足以装下噬菌体头的大小足以装下50kb50kb单元的线性单元的线性DNADNA，DNA38kb DNA52kb,DNA52kb,则无法包装进头部。则无法包装进头部。coscos位点（位点（cos sitecos site）就是保证在超长线性就是保证在超长线性DNADNA分子上分子上每两个每两个coscos位点之间为位点之间为50kb,50kb,使使DNADNA分子能正确的装配分子能正确的装配进噬菌体。进噬菌体。在头的入口处有一种酶，它能识在头的入口处有一种酶，它能识别双链线性别双链线性DNADNA分子上的分子上的coscos序列，并在序列，并在coscos序列处切序列处切断断DNADNA分子，使适当大小的分子，使适当大小的DNADNA进入噬菌体的头部。进入噬菌体的头部。噬菌体噬菌体DNA分子示意图分子示意图三、柯斯质粒（三、柯斯质粒（cosmidcosmid）可携带可携带40kb40kb大小的大小的DNADNA片段，并在大肠杆菌中复片段，并在大肠杆菌中复制保存，制保存，综合了质粒载体和噬菌体载体二者的综合了质粒载体和噬菌体载体二者的优势。优势。柯斯质粒上带有多个单克隆位点、两个柯斯质粒上带有多个单克隆位点、两个coscos位点、位点、DNADNA复制起始位点和抗生素抗性基因，在两个复制起始位点和抗生素抗性基因，在两个coscos位点之间含有一个限制性内切酶位点（位点之间含有一个限制性内切酶位点（RERE）。）。四、四、YACYAC载体载体目前能容纳最大外源目前能容纳最大外源DNADNA片段的载体是片段的载体是YACYAC（酵母（酵母人工染色体，人工染色体，yeast artificial chromosomeyeast artificial chromosome）。）。真核生物染色体三个关键部分：真核生物染色体三个关键部分：着丝粒（着丝粒（centromere,CENcentromere,CEN）,它主管染色体在细它主管染色体在细胞分裂过程中正确的分配到各子细胞中；胞分裂过程中正确的分配到各子细胞中；端粒（端粒（telomere,TELtelomere,TEL）,位于染色体的末端，对位于染色体的末端，对染色体末端的复制以及防止染色体被核酸外切酶染色体末端的复制以及防止染色体被核酸外切酶切断具有重要的意义；切断具有重要的意义；自主复制序列自主复制序列（autonomously replicating autonomously replicating sequence,ARSsequence,ARS）,即在染色体上的多处即在染色体上的多处DNADNA复制起复制起始位点。始位点。作为真核基因表达载体应具备如下条件：作为真核基因表达载体应具备如下条件：含有原核基因的复制起始序列（如含有原核基因的复制起始序列（如ColE1ColE1起始序列起始序列oriori）筛选标记；）筛选标记；含有真核基因的复制起始序列（如含有真核基因的复制起始序列（如SV40SV40病毒的复病毒的复制序列、酵母的制序列、酵母的22质粒的复制起始序列质粒的复制起始序列ARSARS、以及、以及真核细胞筛选标记（如氨基糖苷真核细胞筛选标记（如氨基糖苷G148G148抗性基因、在抗性基因、在酵母细胞中与自养有关的基因）；酵母细胞中与自养有关的基因）；含有有效地启动子序列（可包含增强子序列等各含有有效地启动子序列（可包含增强子序列等各种顺式作用元件）；种顺式作用元件）；RNARNA聚合酶所需的转录终止和聚合酶所需的转录终止和poly(A)poly(A)加入的信号加入的信号序列；序列；合适的供外源基因插入的限制性内切酶位点。合适的供外源基因插入的限制性内切酶位点。应用柯斯质粒载体进行基因克隆的一般程序应用柯斯质粒载体进行基因克隆的一般程序利用柯斯质粒克隆大片段利用柯斯质粒克隆大片段DNApYAC4结构图结构图YAC的构建示意图的构建示意图第三节第三节重组基因的导入和筛选重组基因的导入和筛选氯化钙法氯化钙法电穿孔：电穿孔：将宿主细胞置于一个高强电场中，通过电场脉将宿主细胞置于一个高强电场中，通过电场脉冲在细胞壁上打孔，冲在细胞壁上打孔，DNADNA分子随即进入细胞。分子随即进入细胞。聚乙二醇介导的原生质体转化法：聚乙二醇介导的原生质体转化法：常用于转化酵母以及其他真菌细胞常用于转化酵母以及其他真菌细胞活跃活跃生长的细胞或菌丝体用消化细胞壁的酶处理变成生长的细胞或菌丝体用消化细胞壁的酶处理变成球形后，在适当浓度的聚乙二醇球形后，在适当浓度的聚乙二醇60006000（PEG-PEG-60006000）的介导下将外源）的介导下将外源DNADNA转化入受体细胞中。转化入受体细胞中。磷酸钙或磷酸钙或DEAEDEAE葡聚糖介导的转染：葡聚糖介导的转染：将外源基因导入哺乳类细胞中瞬时表达的常规将外源基因导入哺乳类细胞中瞬时表达的常规方法。方法。磷酸钙和磷酸钙和DNADNA共沉淀：将被转染的共沉淀：将被转染的DNADNA同正在溶同正在溶液中形成的磷酸钙微粒共沉淀后可能通过内吞作液中形成的磷酸钙微粒共沉淀后可能通过内吞作用进入受体细胞。用进入受体细胞。DEAEDEAE葡聚糖作用：可能是其与葡聚糖作用：可能是其与DNADNA结合从而抑结合从而抑制核酸酶的作用或与细胞结合从而促进制核酸酶的作用或与细胞结合从而促进DNADNA的内的内吞作用。吞作用。原生质体融合：原生质体融合：通过带有多拷贝重组质粒的细菌原生质体同通过带有多拷贝重组质粒的细菌原生质体同培养的哺乳细胞直接融合。培养的哺乳细胞直接融合。脂质体法：脂质体法：将将DNADNA或或RNARNA包裹于脂质体内，然后进行脂质包裹于脂质体内，然后进行脂质体与细胞膜融合将基因导入。体与细胞膜融合将基因导入。细胞核的显微注射法：细胞核的显微注射法：即将目的基因重组体通过显微注射装置直接即将目的基因重组体通过显微注射装置直接注入细胞核中。注入细胞核中。基因重组的方法：基因重组的方法：根据外源根据外源DNADNA片段末端的性质同载体上适当的酶片段末端的性质同载体上适当的酶切位点相连实现基因的体外重组。切位点相连实现基因的体外重组。当在载体的以及外源当在载体的以及外源DNADNA片段两端的限制酶切位片段两端的限制酶切位点之间，不可能找到恰当的匹配时，可采用下述点之间，不可能找到恰当的匹配时，可采用下述方法解决：方法解决：在线状质粒的末端或外源在线状质粒的末端或外源DNADNA片段的末端用片段的末端用DNADNA连接酶接上接头或衔接头，这种接头可以是连接酶接上接头或衔接头，这种接头可以是含单一的或多个限制性酶切位点，然后通过适当含单一的或多个限制性酶切位点，然后通过适当的限制酶解后进行重组。的限制酶解后进行重组。使用大肠杆菌使用大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I KlenowI Klenow片段部分补平片段部分补平33凹端。凹端。33凹端转变成粘端。凹端转变成粘端。使用使用KlenowKlenow酶在酶在4 4种种dNTPdNTP存在下，将存在下，将33凹端完全补凹端完全补平或用平或用S1S1核酸酶、绿豆核酸酶、核酸酶、绿豆核酸酶、KlenowKlenow酶、酶、T4DNAT4DNA聚聚合酶去除合酶去除33突出端产生平端突出端产生平端DNADNA分子，可与任何分子，可与任何其他平端其他平端DNADNA分子相连。分子相连。可以利用末端转移酶分别在载体酶切位点处和外源可以利用末端转移酶分别在载体酶切位点处和外源DNADNA片段的片段的33端加上相互补的同聚尾端加上相互补的同聚尾同聚物加尾同聚物加尾法，常用于双链法，常用于双链cDNAcDNA的分子克隆的分子克隆。Pst1质粒pGCTGCAACGTCGpCTGCAGGGGGGpGGpGGGGGGACGTCAAAAAAAmRNAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAAAAACCCCCCTTTTTTTCCCCCC用末端转移酶加（用末端转移酶加（dG）残基）残基用末端转移酶加（用末端转移酶加（dC）残基）残基以以oligo(dT)作引物作引物合成合成cDNA第一链第一链合成合成cDNA第二链第二链退火退火CTGCAGGGGGAAAAAAACCCCCCGGCCCCCCTTTTTTTGGGGGGACGTC转化适当的大肠杆菌菌株选转化适当的大肠杆菌菌株选择抗生素抗性择抗生素抗性转化过程中，转化过程中，DNA上的缺口为宿上的缺口为宿主酶所修复，从而在主酶所修复，从而在cDNA两端恢两端恢复复Pst1位点位点Pst1Pst1cDNA多聚酶链反应（多聚酶链反应（PCRPCR）为基因定向重组和构建外源基）为基因定向重组和构建外源基因高效表达治理提供了一个通用方法。因高效表达治理提供了一个通用方法。根据载体上的克隆位点设计根据载体上的克隆位点设计PCRPCR引物，使引物上引物，使引物上带有与载体克隆位点相匹配的限制性内切酶识别序带有与载体克隆位点相匹配的限制性内切酶识别序列。列。筛选筛选1 1、重组质粒的快速鉴定：根据有外源基因插入的重组、重组质粒的快速鉴定：根据有外源基因插入的重组质粒同载体质粒同载体DNADNA之间大小的差异区分。之间大小的差异区分。2 2、重组质粒的限制酶解分析。、重组质粒的限制酶解分析。3 3、通过、通过互补使菌落产生的颜色反应来筛选重组体。互补使菌落产生的颜色反应来筛选重组体。4 4、外源、外源DNADNA片段插入失活。片段插入失活。如果载体带有两个或多个抗生素抗性基因并在其如果载体带有两个或多个抗生素抗性基因并在其上分布适宜的可供外源上分布适宜的可供外源DNADNA插入的限制性内切酶插入的限制性内切酶位点时，当外源位点时，当外源DNADNA片段插入到一个抗性基因中片段插入到一个抗性基因中去时可导致此抗性基因失活。去时可导致此抗性基因失活。5 5、分子杂交筛选法：、分子杂交筛选法：原位杂交原位杂交点杂交和点杂交和southernsouthern杂交杂交5353变性、转膜变性、转膜5335加入经标记、变性的加入经标记、变性的探针进行分子杂交探针进行分子杂交53353355*含有杂交信号的含有杂交信号的DNA分子分子6 6、表达文库的免疫学筛选：、表达文库的免疫学筛选：绝大多数构建绝大多数构建噬菌体的噬菌体的cDNAcDNA文库选用文库选用gt11gt11、ZAPZAP或或ORF8ORF8作为表达载体。作为表达载体。这些噬菌体带有一拷贝的大肠杆菌这些噬菌体带有一拷贝的大肠杆菌LacZLacZ基因，克隆基因，克隆位点位于翻译终止密码子上游位点位于翻译终止密码子上游53bp53bp处。处。cDNAcDNA插入方向和阅读框正确时，可以表达氨基端为插入方向和阅读框正确时，可以表达氨基端为半乳糖苷酶序列、羧基端是外源序列的融合蛋半乳糖苷酶序列、羧基端是外源序列的融合蛋白，其中一些外源序列将暴露出可用特异抗体检测白，其中一些外源序列将暴露出可用特异抗体检测的抗原表位。的抗原表位。在培养基上培养菌落在培养基上培养菌落转膜转膜菌落的蛋白质裸露出来菌落的蛋白质裸露出来一抗与裸露的蛋白质结合一抗与裸露的蛋白质结合二抗与一抗结合二抗与一抗结合显色显色找出阳性克隆找出阳性克隆裂解裂解加一抗加一抗洗去游离的一抗，加二抗洗去游离的一抗，加二抗洗去游离的二抗，加显色剂洗去游离的二抗，加显色剂7 7、利用、利用PCRPCR方法来确定基因的重组体。方法来确定基因的重组体。克隆克隆PCR产物；产物；通用引物：通用引物：pUC/M13primer8、DNA的序列分析：的序列分析：这是最后确定分离的基因是否具有与天然基因相这是最后确定分离的基因是否具有与天然基因相同序列的唯一方法，也是最确定的方法。同序列的唯一方法，也是最确定的方法。第四节第四节获得真核生物目的基因的方法获得真核生物目的基因的方法一、一、cDNAcDNA的方法的方法分离表达目的基因的组织或细胞：所用材料要尽分离表达目的基因的组织或细胞：所用材料要尽量新鲜量新鲜mRNAmRNA的分离的分离第一链第一链cDNAcDNA链的合成链的合成第二条第二条cDNAcDNA链的合成链的合成cDNAcDNA的甲基化和接头的加入的甲基化和接头的加入双链双链cDNAcDNA与载体相连：与载体相连：插入片段：载体插入片段：载体1：13：1基因文库的建立基因文库的建立 mRNAmRNA的分离的分离 poly(A)poly(A)尾巴可以用来把尾巴可以用来把mRNAmRNA同同rRNArRNA和和tRNAtRNA分分离开来：离开来：1 1、先提取真核细胞的总、先提取真核细胞的总RNARNA；2 2、把总、把总RNARNA通过一个用纤维素填充的柱子；通过一个用纤维素填充的柱子；在纤维素上结合有许多长度大约为在纤维素上结合有许多长度大约为1515个核苷酸的短链个核苷酸的短链寡聚寡聚dToligo(dT)dToligo(dT)或或dTdT1515，真核基因，真核基因mRNAmRNA分子的分子的poly(A)poly(A)尾巴通过碱基配对作用与尾巴通过碱基配对作用与oligo(dT)oligo(dT)结合，而其它的结合，而其它的RNARNA成成分因为没有分因为没有poly(A)poly(A)尾巴而不能结合尾巴而不能结合 3 3、真核生物、真核生物mRNAmRNA可以用能打断可以用能打断A-TA-T氢键的缓冲液氢键的缓冲液洗脱下来。洗脱下来。第一链第一链cDNAcDNA链的合成链的合成mRNAmRNA纯化以后，样品中加入短的纯化以后，样品中加入短的oligo(dT)oligo(dT)或随机或随机引物分子作为引物，同时加入逆转录酶、缓冲液引物分子作为引物，同时加入逆转录酶、缓冲液和和4 4种脱氧核糖核苷三磷酸（种脱氧核糖核苷三磷酸（dATPdATP、dTTPdTTP、dGTPdGTP、dCTPdCTP）。）。优点优点：可以最大限度的减少：可以最大限度的减少poly(A)poly(A)模板合成模板合成 cDNA cDNA的可能性；的可能性；缺点缺点：cDNAcDNA合成总是从合成总是从mRNA3mRNA3端开始，在最后端开始，在最后 的的cDNAcDNA文库中，代表文库中，代表mRNA3mRNA3区域的组分所占的比例会高，区域的组分所占的比例会高，而且对于一些较长的而且对于一些较长的mRNAmRNA分子来说，由于反转录酶在分子来说，由于反转录酶在cDNAcDNA合成过程中易从合成过程中易从mRNAmRNA分子上脱开，从而造成第一条链合成分子上脱开，从而造成第一条链合成不完整。不完整。oligo(dT)作为引物作为引物 优点优点：合成的：合成的cDNAcDNA文库可能更好地代表最初文库可能更好地代表最初RNARNA模板模板 所代表的组份；所代表的组份；缺点缺点：由于：由于cDNAcDNA在在RNARNA链上的合成是随机的，易产生链上的合成是随机的，易产生较大量的非全长的较大量的非全长的RNARNA模板转录物，从而影响到全长的模板转录物，从而影响到全长的cDNAcDNA分子的获得率。分子的获得率。因此用总体因此用总体RNA和和oligo(dT)引物是最有效的组合。引物是最有效的组合。用逆转录酶在体外合成的用逆转录酶在体外合成的DNADNA链往往不完整，但有一链往往不完整，但有一个特点：在合成停止前，个特点：在合成停止前，DNADNA链会自己折转回来几个链会自己折转回来几个核苷酸形成一个发夹结构。核苷酸形成一个发夹结构。随机随机引物引物第二条第二条cDNAcDNA链的合成链的合成自身引导法自身引导法：利用经一条链上的利用经一条链上的33端序列的折回或端序列的折回或发卡自引导法来合成发卡自引导法来合成效率低，目前已不多用。效率低，目前已不多用。cDNAcDNA第二条链的置换合成法第二条链的置换合成法：作为第一条链合成反作为第一条链合成反应产物的应产物的cDNAcDNA：mRNAmRNA杂交分子充当切口平移的模板。杂交分子充当切口平移的模板。RNaseHRNaseH在杂交分子上的在杂交分子上的mRNAmRNA链上造成切口，产生一系列的链上造成切口，产生一系列的RNARNA引物，它们被的引物，它们被的DNADNA聚合酶聚合酶I I用以合成第二链用以合成第二链效率高，效率高，直接利用第一链反应产物，无须进一步处理和纯化；省去直接利用第一链反应产物，无须进一步处理和纯化；省去S1S1酶的处理，改善了酶的处理，改善了cDNAcDNA的质量，使产生全长的的质量，使产生全长的cDNAcDNA的机的机率大大提高。率大大提高。引物衔接头法合成双链引物衔接头法合成双链cDNAcDNA：通过将通过将cDNAcDNA两端两端加上限制性内切酶位点，使其较方便的克隆入相应的载体。加上限制性内切酶位点，使其较方便的克隆入相应的载体。自身引导法自身引导法反转录酶反转录酶RNaseH（部分降解）（部分降解）DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA连接酶连接酶RNA55cDNA第一链第一链33RNA55555555cDNA第一链第一链3cDNA第二链第二链置置换换合合成成法法基因文库的建立基因文库的建立基因文库：指将基因组基因文库：指将基因组DNADNA通过限制性内切酶通过限制性内切酶部分部分酶解酶解后（必要时对这些后（必要时对这些DNADNA片段进行密度梯度离心片段进行密度梯度离心或经制备型凝胶电泳进行分级分离，以选择长度或经制备型凝胶电泳进行分级分离，以选择长度适合于插入载体的片段）所产生的基因组适合于插入载体的片段）所产生的基因组DNADNA片段片段随机地同相应的载体重组、克隆，所产生的克隆随机地同相应的载体重组、克隆，所产生的克隆群体代表了基因组群体代表了基因组DNADNA的所有序列。的所有序列。二、二、DNA的化学合成的化学合成1 1、基因片段的全化学合成、基因片段的全化学合成特点：首先合成组成一个基因的所有片段，相邻特点：首先合成组成一个基因的所有片段，相邻的片段间有的片段间有4 46 6碱基的重叠互补，在适当的条件碱基的重叠互补，在适当的条件下经退火后，用下经退火后，用T4DNAT4DNA连接酶将各片段以磷酸二连接酶将各片段以磷酸二酯键的共价键形式连接成一个完整的基因。酯键的共价键形式连接成一个完整的基因。化学合成的化学合成的DNADNA片段纯化后其片段纯化后其55和和33端都为羟端都为羟基，在组建基因前要将基，在组建基因前要将DNADNA片段的片段的55端磷酸化端磷酸化（处于基因（处于基因55端的两个寡核苷酸片段不进行磷端的两个寡核苷酸片段不进行磷酸化，以防止基因本身在酸化，以防止基因本身在DNADNA重组时自身环化）。重组时自身环化）。基因的化学合成及克隆图解基因的化学合成及克隆图解535353退火退火DNA连接酶连接酶退火退火DNA连接酶连接酶退火退火DNA连接酶连接酶退火退火T4DNA连接酶连接酶EcoRBamH合成的合成的DNA全基因全基因AmpTetEcoRBamH合成的基因合成的基因转化转化EcoRBamHAmpr TettAmpEcoRBamHAmpr Tett合成的合成的基因基因2 2、基因的化学酶促合成、基因的化学酶促合成特点：不需要合成组成完整基因的所有寡核苷酸特点：不需要合成组成完整基因的所有寡核苷酸片段，而是合成其中一些片断，相邻的片段，而是合成其中一些片断，相邻的33末端有末端有一短的序列互补，在适当的条件下通过退火形成一短的序列互补，在适当的条件下通过退火形成模板引物的复合体，然后在存在四种模板引物的复合体，然后在存在四种dNTPdNTP的条的条件下，用的件下，用的DNADNA聚合酶大片段（聚合酶大片段（klenowklenow大片段）去大片段）去填补互补片段之间的缺口，最后用填补互补片段之间的缺口，最后用T4DNAT4DNA连接酶连连接酶连接及适当的限制性内切酶切割后重组入载体。接及适当的限制性内切酶切割后重组入载体。基因的化学酶促合成图解基因的化学酶促合成图解磷酸化磷酸化退火退火DNA多聚酶多聚酶Iklenow片段片段dNTP限制性内切酶限制性内切酶分子克隆分子克隆5555三、利用三、利用PCR或或RT-PCR分离基因分离基因1 1、反应体系具备的条件：反应体系具备的条件：要有与被分离的目的基因要有与被分离的目的基因55和和33端序列互补的端序列互补的DNADNA引引物（约物（约2020个碱基左右）；个碱基左右）；具有热稳定性的酶，如具有热稳定性的酶，如Taq DNATaq DNA聚合酶；聚合酶；dNTPdNTP；作为模板的作为模板的DNADNA分子。分子。2 2、过程：、过程：变性：模板变性：模板DNADNA置于置于9595的高温下，使双链的高温下，使双链DNADNA的双的双链解开变成单链；链解开变成单链；退火：将反应体系的温度降至退火：将反应体系的温度降至5555左右，使得一对左右，使得一对引物能分别与变性后的两条模板链相配对；引物能分别与变性后的两条模板链相配对；延伸：将反应体系温度调整到延伸：将反应体系温度调整到Taq DNATaq DNA聚合酶作用的聚合酶作用的最适温度最适温度7272，然后以目的基因为模板，合成新的，然后以目的基因为模板，合成新的DNADNA链。链。3 3、引物设计原则：、引物设计原则：33末端序列不能有明显的互补性末端序列不能有明显的互补性易造成引物间二易造成引物间二聚体，导致非特异聚体，导致非特异DNADNA片段的合成；片段的合成；避免引物分子内序列互补避免引物分子内序列互补导致引物分子内双链区导致引物分子内双链区或发夹环结构的形成，引物或发夹环结构的形成，引物33端形成的发夹环会引端形成的发夹环会引起引物内延伸，而发生在近起引物内延伸，而发生在近55端对端对PCRPCR的影响不大；的影响不大；注意熔点温度。注意熔点温度。注意引物内稳定性：注意引物内稳定性：55末端稳定而其末端稳定而其33末端不末端不稳定的引物是进行稳定的引物是进行PCRPCR合成的好引物。合成的好引物。当利用哺乳动物类基因组序列作为当利用哺乳动物类基因组序列作为PCRPCR模板时，对所模板时，对所用的引物要检查其同用的引物要检查其同AluAlu序列或其它短的重复序列的序列或其它短的重复序列的互补性。互补性。逆转录逆转录PCRPCR（retrotranscription PCR,RT-PCRretrotranscription PC