分子生物学课件第10讲.ppt

NanjingUniversity第四章第四章 以修复作用为中以修复作用为中心的心的DNADNA的安全的安全保障体系保障体系NanjingUniversity导致导致DNADNA不稳定的因素不稳定的因素1 1，偶然的复制错误，偶然的复制错误2 2，环环境境紫紫外外线线、电电离离辐辐射射化化学学物物质质（突突变变剂剂）造成的核酸分子损伤造成的核酸分子损伤3 3，外源遗传物质的侵入，外源遗传物质的侵入NanjingUniversity保证保证DNADNA稳定性的机制稳定性的机制1 1，复制修复系统，复制修复系统2 2，损伤修复系统，损伤修复系统3 3，限制，限制-修复系统修复系统NanjingUniversity第一节第一节 复制修复复制修复一、尿嘧啶糖基酶系统一、尿嘧啶糖基酶系统（一）（一）DNADNA中尿嘧啶的产生中尿嘧啶的产生（二二）尿尿嘧嘧啶啶糖糖基基酶酶系系统统的组成的组成（三）修复过程（三）修复过程NanjingUniversity二、错配修复二、错配修复系统系统（mismatch mismatch repair systemrepair system）（一一）错错配配修修复复系系统统的的组组成成（二）错配修复的过程（二）错配修复的过程NanjingUniversity1 1，错错配配矫矫正正酶酶与与未未甲甲基基化化的的GATCGATC及及同同一一条条链链上上的的错错配碱基结合配碱基结合2 2，错错配配矫矫正正酶酶在在两两者者之之间间切切除除一一段段包包括括错错配配碱碱基基的的DNADNA单链单链NanjingUniversity3 3，DNADNA聚聚合合酶酶IIIIII进进行行缺缺口口充充填填4 4，DNADNA连连接接酶酶连连接接切刻切刻NanjingUniversity（三三）错错配配修修复复系系统统其其他他作用作用1 1，去去除除渗渗入入DNADNA的的碱碱基基类类似物似物2 2，在在基基因因转转换换中中起起重重要要作作用用NanjingUniversity第二节第二节 损伤修复损伤修复致损伤因素致损伤因素DNADNA分子损伤的类型分子损伤的类型一一、胸胸腺腺嘧嘧啶啶二二聚聚体体的的产产生生及及其其后果后果二二、胸胸腺腺嘧嘧啶啶二二聚聚体体修修复复的的生生物物学学指指征征（一）细菌的活存曲线（一）细菌的活存曲线（二）修复类型（二）修复类型NanjingUniversity1 1，光复活（，光复活（photoreactivationphotoreactivation）2 2，暗修复，暗修复除除了了可可作作用用于于胸胸腺腺嘧嘧啶啶二二聚聚体体外外，还还可可以以修修复复其其他他类类型型的的损损伤，包括：伤，包括：（1 1）切除修复）切除修复（2 2）重组修复）重组修复（3 3）SOSSOS修复修复（4 4）二聚体糖基酶修复）二聚体糖基酶修复NanjingUniversity三三、胸胸腺腺嘧嘧啶啶二二聚聚体体修修复复的的分分子子生生物学机制物学机制(一）光复活（一）光复活（photoreactivationphotoreactivation）1 1，光复活的定义，光复活的定义2 2，光复活的过，光复活的过（二）切除修复（二）切除修复1 1，切除修复一般过程，切除修复一般过程2 2，大肠杆菌的切除修复，大肠杆菌的切除修复（1 1）修复过程）修复过程NanjingUniversity（2 2）大肠杆菌切除修）大肠杆菌切除修复的类型复的类型A.A.短补丁修复（短补丁修复（short-short-patch repairpatch repair）B.B.长补丁修复（长补丁修复（long-long-patch repairpatch repair）3 3，真核生物的切除修复真核生物的切除修复NanjingUniversity（三）重组修复（三）重组修复1 1，除，除UvrUvr系统之外，还存在其系统之外，还存在其他的暗修复系统他的暗修复系统2 2，重组修复（复制后修复），重组修复（复制后修复）的机制的机制（1 1）重组修复的姐妹链交换）重组修复的姐妹链交换假说（图假说（图4-104-10）（2 2）重组修复所涉及的基因）重组修复所涉及的基因NanjingUniversity（四）（四）SOSSOS修复修复1,SOS1,SOS反应反应2,SOS2,SOS修复的概念修复的概念3,SOS3,SOS修复的结果修复的结果4,RecA4,RecA蛋白在蛋白在SOSSOS修复中修复中的作用的作用NanjingUniversity(1)RecA(1)RecA蛋白的主要生化活性蛋白的主要生化活性(2)RecA(2)RecA蛋白的作用蛋白的作用5,LexA5,LexA蛋白在在蛋白在在SOSSOS修复中的修复中的作用作用(1)LexA(1)LexA蛋白的作用蛋白的作用是一种阻遏蛋白是一种阻遏蛋白,结合于结合于SOSSOS系统中各基因的操作子上系统中各基因的操作子上,使使得这些基因不能产生转录产得这些基因不能产生转录产物物NanjingUniversity对自身基因的表达也有负向对自身基因的表达也有负向控制作用控制作用,但正常细胞中其表但正常细胞中其表达量足以阻遏所有达量足以阻遏所有SOSSOS基因的基因的表达表达当细胞当细胞DNADNA复制受阻时，复制受阻时，LexALexA蛋白被蛋白被RecARecA蛋白触发，发生自蛋白触发，发生自身催化的水解作用，身催化的水解作用，SOSSOS系统系统被激活，被激活，lexAlexA基因表达也增加基因表达也增加NanjingUniversityNanjingUniversityDNADNA复制正常后复制正常后,RecARecA蛋白蛋白失活失活,LexALexA蛋白恢复对蛋白恢复对SOSSOS系统的阻遏作用系统的阻遏作用NanjingUniversity(2)(2)由由LexALexA控制的控制的SOSSOS基因构成一个调基因构成一个调控元控元LexALexA控制控制1717个基因个基因,统称统称din(damage din(damage inducible genes)inducible genes)基因基因,或或SOSSOS基因基因SOSSOS框：所有框：所有SOSSOS基因的操作子都含基因的操作子都含有有2020bpbp的的LexALexA结合位点结合位点,称为称为SOSSOS框框(SOS box)SOS box)NanjingUniversity（五五）嘧嘧啶啶二二聚聚体体糖糖基酶修复系统基酶修复系统与与非非标标准准碱碱基基的的修修复复机制相同机制相同NanjingUniversity四、其他损伤类型及其修复四、其他损伤类型及其修复（一）非标准碱基的修复1 1，非标准碱基及其相应的，非标准碱基及其相应的DNADNA糖基酶糖基酶非标准碱基包括：尿嘧啶、次黄嘌呤、非标准碱基包括：尿嘧啶、次黄嘌呤、3-3-甲基腺嘌呤等甲基腺嘌呤等第一类第一类DNADNA糖基酶无内在糖基酶无内在APAP内切酶活内切酶活性性第二类第二类DNADNA糖基酶有内在糖基酶有内在APAP内切酶活内切酶活性性NanjingUniversity2，DNA糖基酶的修复机制与尿嘧啶糖基酶的修复机制相同第一类去除非标准碱基后，还可以通过DNA碱基插入酶进行修复NanjingUniversity（二）碱基的丢失1，去嘌呤作用（depurination）：嘌呤碱基自发水解导致2，无碱基内切酶的作用修复去嘌呤作用造成的损伤，也负责修复DNA中的尿嘧啶和次黄嘌呤特异切断无碱基核糖的5-磷酸的3-酯键NanjingUniversity3，碱基插入酶目前只发现一种嘌呤碱基插入酶专一性在AP位点插入互补的嘌呤碱基嘌呤碱基的供体可以是自由碱基或嘌呤脱氧核苷。大肠杆菌的酶可以利用dATP和dGTPNanjingUniversity（三）烷基化损伤的修复1，烷基化的主要位点嘌呤碱基的N-7、N-3位、O-6位以及磷酸骨架2，Ada蛋白在烷基化损伤的修复中的作用NanjingUniversity（1）ada基因产物Ada蛋白（O6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶，MGMT）有354个Aa，39KDa（2）Ada蛋白的自杀行为Ada蛋白可去除鸟嘌呤O6甲基，及甲基磷酸三酯上的甲基。两种甲基分别不可逆地结合于该酶的Cys321和Cys69上。去除一个甲基要消耗一个酶分子。NanjingUniversity3，对烷基化的适应性反应（1）Ada蛋白的作用携带了甲基的Ada蛋白成为自身基因和其他三个基因（alkA，alkB，aidB）的诱导物，结合于基因RNA聚合酶结合位点的上游。其结合位点的一致序列为：AAANNAAAGCGCANanjingUniversity（2）alkA基因的作用编码烷基化DNA糖基酶，该酶能去除3-甲基腺嘌呤，3-甲基鸟嘌呤，O2-甲基胞嘧啶，O2-甲基胸腺嘧啶等烷基化碱基（3）alkB的作用基因产物负责细胞毒素损伤的DNA的切除修复NanjingUniversity（四）链的断裂1，造成DNA链断裂的因素2，修复方式（1）单链断裂修复有一部分是直接通过DNA连接酶将切刻两端的5磷酸根与相邻的3羟基连接加以修复NanjingUniversity（2）双链断裂修复已知参与双链断裂修复的哺乳动物基因有：DNA-PK，XR-1，XRFCCI基因修复的简单过程是：断裂的末端被切平，产生3-OH和5-P，然后两个片段被连接起来。NanjingUniversity（五）交联1，致交联因素某些抗生素（如丝裂霉素）致癌剂和化疗药2，交联种类链内交联链间交联3，修复方式主要依靠切除修复NanjingUniversity（六）真核生物的修复系统1，酵母与辐射损伤修复有关的基因统称为rad基因，分成三组：（1）与切除修复有关（2）与复制后修复有关（3）与重组修复有关NanjingUniversity各种修复都与转录过程有关，都倾向性地修复具转录活性的基因，而且是首先修复模板链。可能修复与RNA聚合酶有联系。现已知rad3基因编码一种螺旋酶（helicase），是与RNA聚合酶结合的一种转录因子，是对损伤区切割所必需的。NanjingUniversity2，哺乳动物对损伤DNA的修复机制同原核细胞的切除修复机制相似。已知哺乳动物切除修复相关的基因与酵母的rad基因存在同源性，表明切除修复机制在各种生物中是高度保守的哺乳动物中已发现了重组修复机制。这些修复系统都与遗传重组过程有关NanjingUniversity3，真核生物蛋白质的多聚ADP核糖基化与DNA修复的关系（1）真核生物蛋白质的多聚ADP核糖基化（ADP-ribosylation）在DNA断裂作用的刺激下，ADP核糖基转移酶（ADPRT）迅速从NAD+上将ADP核糖基转移到许多核蛋白（包括ADPRT自身）上。NanjingUniversity（2）多聚ADP核糖基化的可能作用A.观点一核糖基化的蛋白质通过目前未知的途径促进DNA的修复NanjingUniversityB.观点二ADP核糖基化使磷酸核糖焦磷酸（PRPP）和ATP的储备急剧下降，DNA损伤严重的情况下可能导致细胞死亡。意义：防止畸变的DAN修复结果被复制而固定下来NanjingUniversity第三节 限制与修饰（restriction and modification）一、限制-修饰现象1，大肠杆菌噬菌体的限制和修饰模式表4-2NanjingUniversity2，大肠杆菌的限制-修饰系统（1）限制-修饰作用：大肠杆菌的一种酶系统可以识别外来的DNA，并以其限制性内切酶活性将之切断（限制）；另一方面，该系统可以识别细胞内DNA中相同的限制性内切酶切割位点，并对位点内的腺嘌呤或胞嘧啶进行甲基化修饰（修饰），使之免遭限制性切割，这两方面的作用即为限制-修饰作用。大肠杆菌的这种酶系统就称为限制-修饰系统。NanjingUniversity3，居民DNA同一细胞内具有同样的限制-修饰模式的不同类型的DNA，包括细胞DNA，质粒DNA，噬菌体DNA等NanjingUniversity二、限制-修饰系统的分类（一）细菌中三种不同类型的修饰-限制酶表4-3（二）II类修饰-限制酶NanjingUniversity1，酶分子的构成限制酶和修饰酶是独立的两个酶2，识别位点一般为4-6个bp的回文序列3，切割位点大多数酶作用于底物DNA双链，位点在识别序列中或靠近识别序列少数酶能作用于回文序列相应DNA单链序列NanjingUniversity4，对底物的作用全甲基化底物：不限制，不修饰半甲基化底物：不限制，修饰非甲基化底物：限制，不修饰NanjingUniversity5，酶切位点粘性末端和平齐末端：限制酶在DNA两条链上的切口位置不同产生不同的末端。粘性末端可以是5端的，也可以是3端的。同位酶：识别相同序列而切点不同的限制酶同尾酶：识别序列不同而切割产生的粘性末端相同的限制酶NanjingUniversity（三）I类酶1，酶分子的构成（1）三个亚基：R、M、S亚基分别由hsdR、hsdM、和hsdS基因编码；三个基因属同一个操纵元NanjingUniversity（2）两种功能R、M亚基负责限制和修饰S亚基负责识别DNA序列上特异靶位点（3）基因突变和万一保安机制三个基因突变的表型万一保安机制：M亚基参与R亚基的功能，使M亚基突变时不致造成致死表型NanjingUniversity2，I类酶的作用位点（1）EcoB和EcoK的识别位点：一段3bp的序列和一段4bp的序列中间夹着一段任意序列EcoB的识别序列：TGA（N）8TGCTEcoK的识别序列：AAC（N）6GTGCNanjingUniversity（2）EcoB和EcoK的甲基化位点EcoB的甲基化位点：DNA双链上N8任意序列两侧的两个腺嘌呤EcoK的甲基化位点：不详（3）I类酶的切割位点距识别位点1000bp以上NanjingUniversity3，I类酶的限制-修饰机制图4-15（1）M亚基首先与辅助因子S-腺苷甲硫氨酸（SAM）结合，酶分子变构处于活化状态（2）酶-SAM与DNA结合后，在ATP的参与下，对不同甲基化程度的底物产生不同的限制-修饰作用限制性切割位点的序列无特异性，但位点的选择也并非是完全随机的NanjingUniversity4，I类酶识别切割位点的机制（1）酶移动假说酶分子与识别位点结合酶分子沿着DNA移动（原因未知）直到它实施切割NanjingUniversity（2）DNA移动假说酶分子有两个位点与识别位点的两端特异性碱基序列结合在ATP存在时，酶分子发生变构，以一个位点与DNA的一端特异性序列结合（可能是四个碱基的序列）NanjingUniversity酶分子将另一边的DNA双螺旋从中间拉过来，通过分子上不结合DNA的结合位点的检查，发现DNA上的切割位点，将DNA的一条链切断消耗大量ATP，释放共约70b的寡核苷酸片段可能由第二个酶分子将DNA的另一条链切断NanjingUniversity（四）III类酶III类酶非常稀有，目前只有三个系统得到了研究，即大肠杆菌质粒P1、P15编码的EcoP1和EcoP15，以及流感菌Rf中的HinfNanjingUniversity1，酶的组成及功能R亚基，负责限制反应；R亚基基因突变，产生R-M+表型MS亚基，负责识别和修饰；MS基因突变，可产生R-M-（识别区突变)或R+M-致死突变（修饰部分突变）NanjingUniversity2，识别和修饰位点同一个位点，也是在腺嘌呤上甲基化，由SAM提供甲基修饰只发生在一条DNA链上甲基化在子代DNA中的维持机制不详，有人认为修饰与复制作用相联系3，限制位点在识别位点的一侧24bp26bpNanjingUniversity三、限制-修饰系统的生物学意义1 1，保护自身的，保护自身的DNADNA的稳定性不受外来的稳定性不受外来DNADNA的影响的影响2 2，可能还有其他功能，可能还有其他功能（1 1）I I类酶可能还有未知功能，如非特异性重类酶可能还有未知功能，如非特异性重组组（2 2）IIII类、类、IIIIII类酶可能促进位点特异重组，类酶可能促进位点特异重组，及质粒之间、噬菌体之间的遗传信息交流及质粒之间、噬菌体之间的遗传信息交流（3 3）限制酶可能为细胞合成）限制酶可能为细胞合成DNADNA提供核苷酸前提供核苷酸前体体