DNA限制性内切酶消化酶切.ppt

DNADNA限制性内切酶消化酶切限制性内切酶消化酶切 DNA restriction enzyme digestion实验四实验四实验原理实验原理限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链近的特异位点上，并切割双链DNA。限制性内限制性内切酶切酶酶分子酶分子识别位点识别位点切割位点切割位点 限制作用限制作用是否需用是否需用 ATP类类 三三亚亚基基双双功能酶功能酶 二二 分分 非非 对对称称至至 少少 在在 识识别别位位点点外外 1000bpYes类类内内 切切 酶酶 与与甲甲 基基 化化 酶酶分分 子子 不不 在在一起一起4-6bp,大大多多 数数 为为 回回文文 对对 称称 结结构构 在在 识识 别别 位位点点 中中 或或 靠靠近近 识识 别别 位位点点 无无 特特 异异性性No类类二二 亚亚 基基 双双功能酶功能酶 5-7 bp 非非对称对称在在 识识 别别 位位点点下下游游 24-26bpYes限制性内切酶可分为三类限制性内切酶可分为三类类限制性内切酶类限制性内切酶 类类酶酶切切割割位位点点在在识识别别序序列列中中，有有的的在在对对称称轴轴处处切切割割,产产生生平平末末端端的的DNA片片段段(如如Sma:5-CCCGGG-3)；有有的的切切割割位位点点在在对对称称轴轴一一侧侧，产产生生带带有有单单链链突突出出末末端端的的DNA片片段段称称粘粘性性末末端端，如如EcoR切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。5GAATTC3 5 G AATTC3 3CTTAAG 5 3 CTTAA G5 实验材料和试剂实验材料和试剂实验材料：实验材料：DNA：购买或自行提取纯化。：购买或自行提取纯化。重组重组pBS质粒或质粒或pUC19质粒。质粒。实验试剂：实验试剂：EcoR I酶及其酶切缓冲液：购买成品。酶及其酶切缓冲液：购买成品。Hind 酶及其酶切缓冲液：购买成品。酶及其酶切缓冲液：购买成品。琼脂糖琼脂糖(Agarose)：进口或国产的电泳用：进口或国产的电泳用琼脂糖均可。琼脂糖均可。实验仪器实验仪器恒温水浴锅恒温水浴锅DNA 1g反应反应 10缓冲液缓冲液2L重蒸水重蒸水19L1L酶液酶液+用手指轻弹管壁使溶液混匀，使溶液集中在管底用手指轻弹管壁使溶液混匀，使溶液集中在管底混匀反应体系后，混匀反应体系后，37水浴保温水浴保温2-3h每管加入每管加入2L 0.1mol/L EDTA(pH8.0)，电泳检测，电泳检测EP管编号管编号,加样加样实验步骤实验步骤对质粒对质粒DNA酶切反应酶切反应 限限制制性性内内切切酶酶用用量量可可按按标标准准体体系系1g DNA加加1单单位位酶酶,消消化化1-2h。但但要要完完全全酶酶解解则则必必须须增增加加酶酶的的用用量量，一一般般增增加加2-3倍倍，甚甚至至更更多多，反反应应时时间间也也要要适适当当延延长。长。电泳检测示例电泳检测示例实验注意事项实验注意事项1.限限制制性性内内切切酶酶用用量量可可按按标标准准体体系系1g DNA加加1单单位位酶酶，消消化化1-2h。但但要要完完全全酶酶解解则则必必须须增增加加酶酶的的用用量量，一一般般增增加加2-3倍倍，甚至更多，反应时间也要适当延长。甚至更多，反应时间也要适当延长。2.酶酶切切时时所所加加的的DNA溶溶液液体体积积不不能能太太大大，否否则则DNA溶溶液液中中其其他成分会干扰酶反应。他成分会干扰酶反应。3.许许多多实实验验制制备备的的DNA不不易易于于降降解解，需需适适当当增增加加酶酶的的使使用用量量。反反应应液液中中加加入入过过量量的的酶酶是是不不合合适适的的，除除考考虑虑成成本本外外，酶酶液液中的微量杂质可能干扰随后的反应。中的微量杂质可能干扰随后的反应。4.市市场场销销售售的的酶酶一一般般浓浓度度很很大大，为为节节约约起起见见，使使用用时时可可事事先先用用酶酶反反应应缓缓冲冲液液（1）进进行行稀稀释释。另另外外，酶酶通通常常保保存存在在50%的的甘甘油油中中，实实验验中中，应应将将反反应应液液中中甘甘油油浓浓度度控控制制在在1/10之下，否之下，否则酶则酶活性将受影响。活性将受影响。思考题思考题 如如果果一一个个DNA酶酶解解液液在在电电泳泳后后发发现现DNA未未被被酶酶切切或或者者酶酶切切不不完完全全,你你认认为为可可能能是什么原因？是什么原因？