DNA重组技术的原理及步骤.ppt

DNA重组技术的原理及步骤重组技术的原理及步骤 第五组：郑桂贤第五组：郑桂贤一、发展历史一、发展历史1951年，美国学者E莱德伯格等发现了噬菌体。1957年日本学者发现了抗药性质粒质粒。20世纪70年代初，生物化学研究的进展也为重组DNA技术奠定了基础1978年，诺贝尔生医奖颁给发现DNA限制酶的纳森斯、亚伯与史密斯时，斯吉巴尔斯基在基因期刊中写道：限制酶将带领我们进入合成生物学的新时代。基因工程、遗传工程、分子克隆作为DNA重组技术的代名词被广泛使用。二、二、DNA重组技术的原理重组技术的原理1.目的基因的获取2.克隆载体的选择与构建3.外源基因与载体的连接4.重组DNA导入受体菌5.重组体的筛选6.克隆基因的表达三、DNA重组技术的步骤重组技术的步骤1.分：分离目的基因2.切：对目的基因和载体适当切割3.接：目的基因与载体连接4.转：重组DNA转入受体菌5.筛：筛选出含有重组体的受菌体Recombinant DNA TechnologyRecombinant DNA Technology从细胞中分从细胞中分从细胞中分从细胞中分离出离出离出离出DNADNADNADNA限制酶截取限制酶截取限制酶截取限制酶截取DNADNADNADNA片断片断片断片断分离大肠杆分离大肠杆分离大肠杆分离大肠杆菌中的质粒菌中的质粒菌中的质粒菌中的质粒 DNA DNA DNA DNA重组重组重组重组用重组质粒用重组质粒用重组质粒用重组质粒转化大肠杆菌转化大肠杆菌转化大肠杆菌转化大肠杆菌培养大肠杆菌培养大肠杆菌培养大肠杆菌培养大肠杆菌克隆大量基因克隆大量基因克隆大量基因克隆大量基因重组体的筛选重组体的筛选重组体的筛选重组体的筛选（一）分：目的基因的获取（一）分：目的基因的获取 1.化学合成法:较短的基因（较短的基因（60-80bp60-80bp）用途：）用途：PCRPCR引物引物、测序引物、测序引物、核酸杂交探针、定点突变核酸杂交探针、定点突变2.基因组DNA、cDNA3.聚合酶链反应cDNAcDNA文库文库基因重组基因重组反转录酶反转录酶mRNAcDNA基因组基因组DNADNA文库文库限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶基因组基因组基因组基因组DNADNA基因重组基因重组转化细菌转化细菌体外包装体外包装克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建 理想载体具备的条件：可转移性、复制功能、多克隆位点（广泛、特异）、显著的筛选标志，便于筛选和鉴定、安全性常用克隆载体：质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA 质粒是存在于细菌染色体外的小型环状DNA分子；具有自我复制功能；带有抗性基因及表型识别等遗传性标记;经改造后具有多克隆位点。pBR322是一个人工构建的重要质粒，有万能质粒之称。它是由pSF2124、pMB1及pSC101三个亲本质粒经复杂的重组过程构建而成的。多克隆位点多克隆位点ori复制起始点复制起始点遗传标记遗传标记A Ammp ppolylinker质粒载体质粒载体（二）切：对目的基因和载体适当切割（二）切：对目的基因和载体适当切割（1）与）与DNA分子相关的几种分子相关的几种酶及基因工程的其他工具及基因工程的其他工具限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶在特异位点上切割DNA分子分三类，常用为类酶识别序列呈回文对称5-GAATTC-33-CTTAAG-55-GTTAAC-33-CAATTG-5EcoR的的识别序列序列Hae的的识别序列序列（三）接：目的基因与载体连接（三）接：目的基因与载体连接(三)连接策略1.粘端DNA间的连接(1)同一限制性内切酶切割位点连接(2)不同限制性内切酶切割位点连接2.平端DNA间的连接3.同聚物加尾连接4.人工接头连接粘端连接CCGG CCGGCCGG CCGGGGCC GGCCGGCC GGCC CGG CCGG CC GGCC GGCCGG CCGG CC GGCC GGCCCGGCCGGGGCCGGCCHapHapT4-DNAT4-DNA连连接接酶酶平端连接 AGCTAGCTTCGATCGAAluAluDNADNA连连接接接接酶酶AGCTAGCTAGCTAGCTTCGATCGATCGATCGA同聚物加尾连接（四）转：重组（四）转：重组DNADNA转入受体菌转入受体菌无性繁殖感受态细胞:容易接受外源DNA的状态.方式:转化、转染、感染导入大肠杆菌导入哺乳动物细胞（五）筛：筛选出含有重组体的受菌体（五）筛：筛选出含有重组体的受菌体 直接选择法间接筛选法核酸水平蛋白质水平1.抗药性选择*1.酶切图谱免疫学的技术：*2.核酸探针SDS-PAGE、2.标志补救*3.PCRWesternblot、3.分子杂交法*4.序列测定ELISA、放免、免疫沉淀、荧光抗体等抗药性选择2 2 2 2）标标志志志志补补救（救（救（救（-半乳糖苷半乳糖苷半乳糖苷半乳糖苷酶酶法）法）法）法）（LacZLacZ基因基因）插入片段插入片段（LacZLacZ基因失活）基因失活）LacZLacZ酶酶氨氨苄苄培养基培养基(六)克隆基因的表达原核表达体系表达载体的标准：1.含有大肠杆菌适宜的选择标志2.具有能调控转录、产生大量mRNA的强启动子3.含有适当的翻译控制序列4.含有合理设计的多接头克隆位点真核表达体系关键步骤是将重组DNA导入真核细胞 质粒质粒质粒质粒 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体 病毒病毒病毒病毒 PCR cDNA PCR cDNA PCR cDNA PCR cDNA 人工合成人工合成人工合成人工合成 基因文库基因文库基因文库基因文库限制性内切酶限制性内切酶有切口的载体有切口的载体有切口的目的基因有切口的目的基因DNADNA连接酶连接酶 重组体重组体 转化转化转化转化 转染转染转染转染 体外包装体外包装体外包装体外包装带重组体的宿主细胞带重组体的宿主细胞 表型筛选表型筛选表型筛选表型筛选 电泳法电泳法电泳法电泳法 核酸杂交核酸杂交核酸杂交核酸杂交 免疫学方法免疫学方法免疫学方法免疫学方法目的基因的表达基因载体目的基因粘端连接平端连接尾接法分切接转筛总观参考文章张亚旭 DNA重组技术的研究综述 生物技术进展 2012年第2卷第一期 57-83张洪渊 生物化学教程 第七章 Page479王镜岩 朱圣庚 徐长法 生物化学下册 第40章Page580百度百科马克学 席兴宇 转化、转导、转染和感染的解析 生物学教学 2010（第35卷）第10期谢谢观看看