《间接免疫荧光法》PPT课件.ppt

间接免疫荧光间接免疫荧光 武汉大学基础医学院武汉大学基础医学院免疫学教研室免疫学教研室潘勤潘勤外周血单个核细胞分离-葡蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法 原理 外周血单个核细胞（PBMC）包括淋巴细胞、单核细胞，其体积、形状和比重与其他细胞不同。红细胞和多核细胞比重较大，为左右，而淋巴细胞和单核细胞比重为左右。利用比重为左右的分层液作密度梯度离心，使一定比重的细胞按密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。材料 1、淋巴细胞分层液（葡蔗糖-泛影葡胺，比重为 ）2、2台盼蓝染液 3、Hanks液或者RPMI-1640培养基 4、试管、吸管、水平离心机等方法1、无菌采集静脉血2ml注入盛有2ml Hanks液（含100u/ml肝素）的试管中，混匀。2、吸取淋巴细胞分层液2ml加入离心管中，再将稀释抗凝血液小心沿管壁加至分层液上，应注意保持两者界面清晰。（关键）3、室温2000rmin离心20min。管内可分为四层。4、用毛细吸管轻轻吸出乳白色的单个核细胞，加入另一支已含有25 mlHanks液的离心管中，混匀。5、室温下，1500 rpm离心10 min。6、弃上清，将PBMC用1ml PBS稀释，混匀 间接免疫荧光间接免疫荧光检测人外周血单个核细胞检测人外周血单个核细胞First antibodyTarget cellsTarget cellsPBMCsecondary antibody-fluorochrome原 理材材 料料PBMC兔抗人白细胞血清(Ab1)FITC-抗兔单克隆抗体(Ab2)方方 法法吸管取1滴PBMC液体（约10ul）滴加到标本片黑色圈圈背面中央,静止5-10分钟，待PBMC干燥。15 ml Ab1 加入玻片上湿盒内孵育 30min。甩干玻片,用洗脱液洗5次，甩干玻片玻片上加15 ml 荧光二抗(Ab2)湿盒内孵育 30min。(避光操作)甩干玻片,用洗脱液洗5次，甩干玻片用荧光显微镜观察结果RESULTS思考题为什么用间接免疫荧光法可检测 PBMC细胞？