分子标记及基因芯片技术应用精.ppt

分子标记及基因芯片技分子标记及基因芯片技术应用术应用第1页，本讲稿共114页遗传标记（geneticmarkergeneticmarker）具有多型性具有多型性具有多型性具有多型性易于易于易于易于鉴别鉴别与目与目与目与目标标基因基因基因基因紧紧密密密密连锁连锁n n 性状标记性状标记性状标记性状标记 色泽，色泽，色泽，色泽，形态形态形态形态n n 细胞学标记细胞学标记细胞学标记细胞学标记 倒位，易位，倒位，易位，倒位，易位，倒位，易位，G/N/CG/N/CG/N/CG/N/C带带带带n n 生化标记生化标记生化标记生化标记 同功酶同功酶同功酶同功酶n n 分子标记分子标记分子标记分子标记 RFLP RFLP RFLP RFLP、RAPDRAPDRAPDRAPD、SSRSSRSSRSSR、AFLPAFLPAFLPAFLP、SNPSNPSNPSNP 基础基础基础基础-基因表达基因表达基因表达基因表达结果结果结果结果表现型表现型表现型表现型DNADNA碱基碱基碱基碱基序列变异序列变异序列变异序列变异第2页，本讲稿共114页形态标记形态标记n n遗传学上稳定、可见的外部特征遗传学上稳定、可见的外部特征遗传学上稳定、可见的外部特征遗传学上稳定、可见的外部特征-遗传与环境、结构基因与调控基因综合作用的结果。遗传与环境、结构基因与调控基因综合作用的结果。遗传与环境、结构基因与调控基因综合作用的结果。遗传与环境、结构基因与调控基因综合作用的结果。n n如穗形、芒长、穗长、粒色、穗形、矮秆、卷叶等。如穗形、芒长、穗长、粒色、穗形、矮秆、卷叶等。如穗形、芒长、穗长、粒色、穗形、矮秆、卷叶等。如穗形、芒长、穗长、粒色、穗形、矮秆、卷叶等。n n特点：直观简单特点：直观简单特点：直观简单特点：直观简单n n从基因型到表现型存在基因表达、调控、个体发育等环节，表从基因型到表现型存在基因表达、调控、个体发育等环节，表从基因型到表现型存在基因表达、调控、个体发育等环节，表从基因型到表现型存在基因表达、调控、个体发育等环节，表型差异有时难以反映基因型差异。型差异有时难以反映基因型差异。型差异有时难以反映基因型差异。型差异有时难以反映基因型差异。第3页，本讲稿共114页细胞学标记细胞学标记n n染色体数目变异及结构变异，表现在染色体核型（数染色体数目变异及结构变异，表现在染色体核型（数染色体数目变异及结构变异，表现在染色体核型（数染色体数目变异及结构变异，表现在染色体核型（数目、大小、随体、着丝点位置等）和带型（目、大小、随体、着丝点位置等）和带型（目、大小、随体、着丝点位置等）和带型（目、大小、随体、着丝点位置等）和带型（C C带、带、带、带、N N带、带、带、带、GG带等）。带等）。带等）。带等）。n n随着分带、细胞原位杂交等研究技术的发展，随着分带、细胞原位杂交等研究技术的发展，随着分带、细胞原位杂交等研究技术的发展，随着分带、细胞原位杂交等研究技术的发展，可在染色体水平揭示更多遗传变异。可在染色体水平揭示更多遗传变异。可在染色体水平揭示更多遗传变异。可在染色体水平揭示更多遗传变异。n n特点：直观、快速而经济，但变异十分有限，当染特点：直观、快速而经济，但变异十分有限，当染特点：直观、快速而经济，但变异十分有限，当染特点：直观、快速而经济，但变异十分有限，当染色体数目形态相似时难以分辨。色体数目形态相似时难以分辨。色体数目形态相似时难以分辨。色体数目形态相似时难以分辨。第4页，本讲稿共114页生化标记生化标记贮藏蛋白和同工酶贮藏蛋白和同工酶贮藏蛋白和同工酶贮藏蛋白和同工酶n n贮藏蛋白贮藏蛋白n n同工酶同工酶n n特点：经济、方便、成本较低特点：经济、方便、成本较低n n结构基因表达产物，对非结构基因无能结构基因表达产物，对非结构基因无能为力；所检测位点只是基因组一部分；为力；所检测位点只是基因组一部分；数量有限，有时受发育时期和环境影响。数量有限，有时受发育时期和环境影响。第5页，本讲稿共114页分子标记本质是以核苷酸序列作为标记，一般特点：本质是以核苷酸序列作为标记，一般特点：本质是以核苷酸序列作为标记，一般特点：本质是以核苷酸序列作为标记，一般特点：（1 1）不受季节、环境、基因表达与否的限制；）不受季节、环境、基因表达与否的限制；）不受季节、环境、基因表达与否的限制；）不受季节、环境、基因表达与否的限制；（2 2）多态性高，存在着丰富的等位变异；）多态性高，存在着丰富的等位变异；）多态性高，存在着丰富的等位变异；）多态性高，存在着丰富的等位变异；（3 3）数量丰富，多态性遍及整个基因组；）数量丰富，多态性遍及整个基因组；）数量丰富，多态性遍及整个基因组；）数量丰富，多态性遍及整个基因组；（4 4）表表表表现现现现为为为为“中中中中性性性性”，不不不不影影影影响响响响目目目目标标标标性性性性状状状状的的的的表表表表达达达达，与与与与不良性状无必然的连锁；不良性状无必然的连锁；不良性状无必然的连锁；不良性状无必然的连锁；（5 5）许多分子标记表现共显性，能鉴别纯合杂合基因）许多分子标记表现共显性，能鉴别纯合杂合基因）许多分子标记表现共显性，能鉴别纯合杂合基因）许多分子标记表现共显性，能鉴别纯合杂合基因型，提供完整的信息。型，提供完整的信息。型，提供完整的信息。型，提供完整的信息。第6页，本讲稿共114页分子标记的分类（分子标记的分类（Staub等等1996）分分子子标标记记以以Southern为基础如为基础如RFLP以以PCR为基础为基础单引物单引物单引物单引物PCRPCR标记标记标记标记 有有有有RAPDRAPD、AP-PCRAP-PCR、DAFDAF、ISSRISSR等等等等双引物选择性扩增双引物选择性扩增双引物选择性扩增双引物选择性扩增PCRPCR主要指主要指主要指主要指AFLPAFLP需克隆、测序构建特殊双引物需克隆、测序构建特殊双引物需克隆、测序构建特殊双引物需克隆、测序构建特殊双引物PCRPCR标记标记标记标记如如如如SSRSSR、STSSTS等等等等第7页，本讲稿共114页植物遗传研究中常用的分子标记n nRFLPRestrictionFragmentLengthRFLPRestrictionFragmentLengthPolymorphismPolymorphismn nRAPDRandomAmplifiedPolymorphicDNAsRAPDRandomAmplifiedPolymorphicDNAs(DAF,AP-PCR)(DAF,AP-PCR)n nSSRSimpleSequenceRepeatSSRSimpleSequenceRepeatn nAFLPAmplifiedFragmentLengthAFLPAmplifiedFragmentLengthPolymorphismPolymorphism第8页，本讲稿共114页RFLPn n原理：原理：原理：原理：DNADNA限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切电泳电泳电泳电泳转移到硝酸纤维素滤膜转移到硝酸纤维素滤膜转移到硝酸纤维素滤膜转移到硝酸纤维素滤膜同位素或非放射标记（如地高辛等）的探针杂交同位素或非放射标记（如地高辛等）的探针杂交同位素或非放射标记（如地高辛等）的探针杂交同位素或非放射标记（如地高辛等）的探针杂交胶片放射自显影，显示酶切片段大小胶片放射自显影，显示酶切片段大小胶片放射自显影，显示酶切片段大小胶片放射自显影，显示酶切片段大小第9页，本讲稿共114页n n酶切：酶切：酶切：酶切：3-5ugDNA3-5ugDNA，以以以以1010U U内切酶酶切内切酶酶切内切酶酶切内切酶酶切5 5小时小时小时小时 n n电泳：电泳：电泳：电泳：0.6-0.8%0.6-0.8%琼脂糖胶琼脂糖胶琼脂糖胶琼脂糖胶7070V V电泳电泳电泳电泳1616小时小时小时小时 n n染色：染色：染色：染色：EtBrEtBr染色染色染色染色2020分钟分钟分钟分钟 n n变性：变性：变性：变性：0.250.25MHCl20MHCl20分钟，抽真空，水冼分钟，抽真空，水冼分钟，抽真空，水冼分钟，抽真空，水冼n n印迹：加入印迹：加入印迹：加入印迹：加入0.4NNaOH0.4NNaOH，进行进行进行进行SouthernSouthern印迹印迹印迹印迹n n冲洗：以冲洗：以冲洗：以冲洗：以2 2SSCSSC冼胶，风干冼胶，风干冼胶，风干冼胶，风干酶切酶切电泳电泳印迹印迹第10页，本讲稿共114页杂交洗脱n n预杂交：将杂交膜放人预杂交液（水、预杂交：将杂交膜放人预杂交液（水、预杂交：将杂交膜放人预杂交液（水、预杂交：将杂交膜放人预杂交液（水、55HSBHSB、DenhardtDenhardt）中，中，中，中，封好后置封好后置封好后置封好后置6565温箱中温箱中温箱中温箱中振荡振荡振荡振荡5 56 6小时。小时。小时。小时。n n杂交：预杂交液中加入标记好的杂交：预杂交液中加入标记好的杂交：预杂交液中加入标记好的杂交：预杂交液中加入标记好的markermarker和探针，和探针，和探针，和探针，放入杂交膜浸匀。封好杂交盒后，置放入杂交膜浸匀。封好杂交盒后，置放入杂交膜浸匀。封好杂交盒后，置放入杂交膜浸匀。封好杂交盒后，置6565温温温温箱中振荡过夜。箱中振荡过夜。箱中振荡过夜。箱中振荡过夜。n n洗脱：将膜转入洗脱盒，加入洗脱液洗脱：将膜转入洗脱盒，加入洗脱液洗脱：将膜转入洗脱盒，加入洗脱液洗脱：将膜转入洗脱盒，加入洗脱液6565 振荡洗脱振荡洗脱振荡洗脱振荡洗脱两次（两次（两次（两次（1515min/min/次）次）次）次），吸干包好。吸干包好。吸干包好。吸干包好。第11页，本讲稿共114页放射自显影将洗脱好的杂交膜置于增感屏上将洗脱好的杂交膜置于增感屏上将洗脱好的杂交膜置于增感屏上将洗脱好的杂交膜置于增感屏上,于暗室中将于暗室中将于暗室中将于暗室中将 X-X-光片放于杂交膜上，光片放于杂交膜上，光片放于杂交膜上，光片放于杂交膜上，再放上另一张增感屏，再放上另一张增感屏，再放上另一张增感屏，再放上另一张增感屏，装人暗袋，并用夹板夹好。置装人暗袋，并用夹板夹好。置装人暗袋，并用夹板夹好。置装人暗袋，并用夹板夹好。置-70-70超低温冰箱超低温冰箱超低温冰箱超低温冰箱中曝光中曝光中曝光中曝光1010天左右。天左右。天左右。天左右。使用磷屏仪，操作更方便。使用磷屏仪，操作更方便。使用磷屏仪，操作更方便。使用磷屏仪，操作更方便。第12页，本讲稿共114页RFLP探针n n来源：来源：来源：来源：cDNAcDNA探探探探针针与基因与基因与基因与基因组组DNADNA（gDNAgDNA）探探探探针针n ncDNAcDNA探探探探针针:保保保保守守守守性性性性较较强强，探探探探针针检检测测的的的的多多多多态态性性性性频频率率率率较较低。低。低。低。n ngDNAgDNA探探探探针针:检检测测的的的的多多多多态态性性性性频频率率率率较较高高高高，但但但但不不不不同同同同种种种种属属属属特特特特异性异性异性异性较强较强。n n玉米玉米玉米玉米RFLPRFLP探探探探针针：http:/www.maizegdb.org/probes.http:/www.maizegdb.org/probes.HtmlHtml第13页，本讲稿共114页探针标记随机引物法n n2525ngng变性变性变性变性DNADNAn n5 5ulul寡聚核苷酸寡聚核苷酸寡聚核苷酸寡聚核苷酸n n2ulBSA2ulBSAn n3ul-3ul-3232PdCTPPdCTPn n2 2ulKlenowulKlenow酶酶酶酶n n加水至加水至加水至加水至5050ulul，3737温箱中标记温箱中标记温箱中标记温箱中标记2 2小时小时小时小时第14页，本讲稿共114页RFLP标记标记特点特点n n共共共共显显性，可以区性，可以区性，可以区性，可以区别纯别纯合和合和合和合和杂杂合基因型合基因型合基因型合基因型n n稳稳定、重复性定、重复性定、重复性定、重复性强强n n某些植物中开某些植物中开某些植物中开某些植物中开发发探探探探针针已遍及整个基因已遍及整个基因已遍及整个基因已遍及整个基因组组n n缺点：缺点：缺点：缺点：DNADNA需要量需要量需要量需要量较较大，技大，技大，技大，技术术复复复复杂杂；用于做用于做用于做用于做图较费时图较费时，难难以分析大量以分析大量以分析大量以分析大量样样品品品品；在基因在基因在基因在基因组较组较大、大、大、大、严严格自花授粉作物上多格自花授粉作物上多格自花授粉作物上多格自花授粉作物上多态态性很低，性很低，性很低，性很低，使使使使遗传图饱遗传图饱和度低。和度低。和度低。和度低。第15页，本讲稿共114页RAPDn n原理：原理：n n用一个随机引物（用一个随机引物（8-10bp）、）、碱基随碱基随机排列的寡核苷酸序列，非定点地扩机排列的寡核苷酸序列，非定点地扩增基因组增基因组DNA，然后电泳分开扩增片然后电泳分开扩增片段。段。第16页，本讲稿共114页Polymerase Chain Reaction-PCR3553Target DNA sequenceGCTCGCAGTACTTCATGACGAGCGdenature 95 C5335GCTCGCAGTACTTCATGACGAGCGTCATGAGCTCGCanneal primers 60 CTaq polymerase binds 3 and extendsGCTCGC5335AGTACTTCATGACGAGCGTCATGAGCTCGCDNA is doubled with each cycleRepeat 25-40 times第17页，本讲稿共114页RAPD的操作的操作PCR反应：反应：DNADNA（20ng/l20ng/l）1l1lPrimerPrimer15ng15ng10Buffer10Buffer2.0l2.0lMgMg2+2+（25mM25mM）1.2l1.2l Taq Taq酶（酶（酶（酶（5 5U/lU/l）0.15l0.15ldNTPdNTP（25mM25mM）0.2l0.2l加水至加水至加水至加水至2020l l，再加入石腊油，进行再加入石腊油，进行再加入石腊油，进行再加入石腊油，进行PCRPCR扩增扩增扩增扩增第18页，本讲稿共114页Step1952分钟分钟Step29515秒秒Step33630秒秒Step47245秒秒Step5GOTOStep246循环循环Step6725分钟分钟PCR扩扩增：增：第19页，本讲稿共114页主要特点 无需杂交，设计引物也无须知道序列信息；无需杂交，设计引物也无须知道序列信息；无需杂交，设计引物也无须知道序列信息；无需杂交，设计引物也无须知道序列信息；DNADNA需要量少，引物便宜，成本较低；需要量少，引物便宜，成本较低；需要量少，引物便宜，成本较低；需要量少，引物便宜，成本较低；技术简便，操作方便、快速，不涉及分子杂交技术简便，操作方便、快速，不涉及分子杂交技术简便，操作方便、快速，不涉及分子杂交技术简便，操作方便、快速，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术。和放射性自显影等技术。和放射性自显影等技术。和放射性自显影等技术。不同物种间引物通用；不同物种间引物通用；不同物种间引物通用；不同物种间引物通用；vv缺点：大多显性遗传，不能鉴别杂合和纯合缺点：大多显性遗传，不能鉴别杂合和纯合缺点：大多显性遗传，不能鉴别杂合和纯合缺点：大多显性遗传，不能鉴别杂合和纯合子；实验重复性较差，结果可靠性较低。子；实验重复性较差，结果可靠性较低。子；实验重复性较差，结果可靠性较低。子；实验重复性较差，结果可靠性较低。第20页，本讲稿共114页DAF(DNA amplification fingerprinting)：与与RAPD不同的是不同的是:引物引物浓度更高，引物度更高，引物长度更短（一般度更短（一般5 58 8个碱基），且往往用聚丙个碱基），且往往用聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶电泳，泳，通常会通常会产生非常复生非常复杂的的带型，型，谱带信息比信息比RAPDs大得多。大得多。（Caetano-Anolles等，等，19901990）第21页，本讲稿共114页AP-PCR(arbitrarily primed polymerase chain reaction)l l引物引物较长（10105050bp）；l l引物引物浓度度较高；高；l l引物引物长度不定，并且常常来自度不定，并且常常来自为其它其它目的而目的而设计的引物（如的引物（如M13通用通用测序序引物）。引物）。第22页，本讲稿共114页ISSR第23页，本讲稿共114页l l共同共同优点：点：在不需要知道所在不需要知道所扩增增DNA序列情况下，序列情况下，产生生DNA片段的指片段的指纹；需需DNA量少，量少，产生多生多态性丰富。性丰富。l l缺点：缺点：l l对反反应条件非常敏感，重复性差。条件非常敏感，重复性差。第24页，本讲稿共114页SCARs（Sequenced Characterized Amplified RegionsSequenced Characterized Amplified Regions）n n为提高为提高为提高为提高RAPDRAPD标记稳定性，把目标标记稳定性，把目标标记稳定性，把目标标记稳定性，把目标RAPDRAPD片段克片段克片段克片段克隆测序，根据片段两末端的序列设计特定引物隆测序，根据片段两末端的序列设计特定引物隆测序，根据片段两末端的序列设计特定引物隆测序，根据片段两末端的序列设计特定引物（通常（通常（通常（通常2424个碱基），再进行个碱基），再进行个碱基），再进行个碱基），再进行PCRPCR扩增，可把扩增，可把扩增，可把扩增，可把相应的单一位点鉴定出来。相应的单一位点鉴定出来。相应的单一位点鉴定出来。相应的单一位点鉴定出来。n n具有更高的可重复性具有更高的可重复性具有更高的可重复性具有更高的可重复性n n共显性共显性共显性共显性第25页，本讲稿共114页微卫星标记(SSR)l l真核生物基因真核生物基因组普遍存在，呈随机分布普遍存在，呈随机分布,大大约每隔每隔10-50kb就存在一个就存在一个SSR.l l哺乳哺乳动物中物中约为植物的植物的5-6倍倍;植物中平均植物中平均23.3kb有一个有一个SSR;双子叶植物双子叶植物SSR数量大数量大于于单子叶植物子叶植物,核核DNASSR数量多于数量多于细胞胞质DNA;l l根据核心序列碱基数的不同根据核心序列碱基数的不同,可分可分为单碱基、碱基、2 2碱基、碱基、3 3碱基、碱基、4 4碱基等多种重复型。碱基等多种重复型。第26页，本讲稿共114页l l不同物种其重复序列及重复不同物种其重复序列及重复单位位频率不同。率不同。l l通通过对54个植物种核个植物种核DNA和和28个植物种个植物种细胞器胞器DNASSR(1-4bp)的搜索的搜索,发现：l l(AT)(AT)最丰富最丰富,然后依次是然后依次是:(A):(A)n n、(T)(T)n n、(AG)(AG)n n、(CT)(CT)n n、(AAT)(AAT)n n、(ATT)(ATT)n n、(AAC)(AAC)n n、(GTT)(GTT)n n、(AGC)(AGC)n n、(GCT)(GCT)n n、(AAG)(AAG)n n、(CTT)(CTT)n n、(AATT)(AATT)n n、(TTAA)(TTAA)n n、(AAAT)(AAAT)n n、(ATTT)(ATTT)n n及及及及(AC)(AC)n n、(GT)(GT)n n。l l同一同一类内碱基种内碱基种类不同的不同的SSR,丰度差丰度差别很大。很大。SSR的分布特点的分布特点第27页，本讲稿共114页SSR的功能长长期以来一直期以来一直期以来一直期以来一直认为认为SSRSSR是是是是转录哑转录哑区，没有明确的生理区，没有明确的生理区，没有明确的生理区，没有明确的生理功能。但随着研究深入，功能。但随着研究深入，功能。但随着研究深入，功能。但随着研究深入，证证明并非如此。明并非如此。明并非如此。明并非如此。SSRSSR的主要功能的主要功能的主要功能的主要功能:编码编码氨基酸；氨基酸；氨基酸；氨基酸；染色体末端的染色体末端的染色体末端的染色体末端的SSRSSR，有保，有保，有保，有保护护DNADNA完整性、避免降解、完整性、避免降解、完整性、避免降解、完整性、避免降解、融合及融合及融合及融合及丢丢失的功能；失的功能；失的功能；失的功能；提高或降低提高或降低提高或降低提高或降低临临近基因近基因近基因近基因转录转录速率；速率；速率；速率；基因重基因重基因重基因重组组的的的的热热点，是基因点，是基因点，是基因点，是基因变变异的来源；异的来源；异的来源；异的来源；部分部分部分部分SSRSSR可可可可产产生生生生转录转录启启启启动动复合物或活化染色体复合物或活化染色体复合物或活化染色体复合物或活化染色体第28页，本讲稿共114页vv两端序列多是保守的两端序列多是保守的单拷拷贝序列，可序列，可以根据两端序列以根据两端序列设计一一对特异引物，特异引物，通通过PCR将其将其间微微卫星序列星序列扩增出来，增出来，利用利用电泳技泳技术获得得长度多度多态性。性。vv不同材料重复次数的不同不同材料重复次数的不同，导致了致了SSR长度的高度度的高度变异性。异性。SSR分析分析第29页，本讲稿共114页SSR分子标记的创制分子标记的创制基因组文库的构建基因组文库的构建基因组文库的构建基因组文库的构建探针制备探针制备探针制备探针制备-预杂交预杂交预杂交预杂交-带有带有带有带有SSRSSR克隆的选择克隆的选择克隆的选择克隆的选择测序测序测序测序引物设计引物设计引物设计引物设计检测检测检测检测其它方法其它方法其它方法其它方法:EST-SSR:EST-SSR、相关种间、相关种间、相关种间、相关种间SSR.SSR.第30页，本讲稿共114页Cross-species SSRTaxonomic Taxonomic TransferabilityTransferabilityPolymorphismPolymorphism Divergence%(N)%(N)Divergence%(N)%(N)Same subgenusSame subgenus 89.8(521)89.8(521)78.3(299)78.3(299)Same genus Same genus 76.4(1800)76.4(1800)86.0(773)86.0(773)Same allianceSame alliance 45.4(403)45.4(403)50.4(141)50.4(141)Same familySame family 35.2(1683)35.2(1683)58.4(363)58.4(363)第31页，本讲稿共114页SSR的操作的操作PCRPCR反应：反应：反应：反应：DNADNA（20ng/l20ng/l）4l4lPrimerPrimer（1mM1mM）0.25l0.25l10Buffer10Buffer2.0l2.0lMgMg2+2+（25mM25mM）1.2l1.2lTaqTaq酶（酶（酶（酶（5 5U/lU/l）0.1l0.1ldNTPdNTP（25mM25mM）0.2l0.2l加水至加水至加水至加水至2020l l第32页，本讲稿共114页混合后，进行混合后，进行混合后，进行混合后，进行PCRPCR扩增扩增扩增扩增：Step1Step1 959522分钟分钟分钟分钟Step2Step295953030秒秒秒秒Step3Step3 56563030秒秒秒秒Step4Step472726060秒秒秒秒Step5Step5GOTOStep231GOTOStep231循环循环循环循环注：注：注：注：SSRSSR引物退火温度在引物退火温度在引物退火温度在引物退火温度在52-6552-65 不等。不等。不等。不等。第33页，本讲稿共114页SSR的特点：的特点：l l两侧顺序保守，在同种间多相同；两侧顺序保守，在同种间多相同；两侧顺序保守，在同种间多相同；两侧顺序保守，在同种间多相同；l l数量丰富，在整个基因组均匀随机分布；数量丰富，在整个基因组均匀随机分布；数量丰富，在整个基因组均匀随机分布；数量丰富，在整个基因组均匀随机分布；l l实验重复性好，结果可靠；实验重复性好，结果可靠；实验重复性好，结果可靠；实验重复性好，结果可靠；l l多数多数多数多数SSRSSR增减重复序列频率高，在品种间具广泛增减重复序列频率高，在品种间具广泛增减重复序列频率高，在品种间具广泛增减重复序列频率高，在品种间具广泛位点变异；位点变异；位点变异；位点变异；l l共显性标记，可鉴别杂合子和纯合子；共显性标记，可鉴别杂合子和纯合子；共显性标记，可鉴别杂合子和纯合子；共显性标记，可鉴别杂合子和纯合子；l l仅需微量组织，适合仅需微量组织，适合仅需微量组织，适合仅需微量组织，适合PCRPCR分析半自动化分析半自动化分析半自动化分析半自动化第34页，本讲稿共114页vv相对的物种专一性；相对的物种专一性；相对的物种专一性；相对的物种专一性；vv由于开发时需针对每个座位的微卫星序列，发现由于开发时需针对每个座位的微卫星序列，发现由于开发时需针对每个座位的微卫星序列，发现由于开发时需针对每个座位的微卫星序列，发现其两端的单拷贝序列设计引物，需建立基因文库、其两端的单拷贝序列设计引物，需建立基因文库、其两端的单拷贝序列设计引物，需建立基因文库、其两端的单拷贝序列设计引物，需建立基因文库、克隆识别与筛选、测序等过程，开发困难，费用克隆识别与筛选、测序等过程，开发困难，费用克隆识别与筛选、测序等过程，开发困难，费用克隆识别与筛选、测序等过程，开发困难，费用较高，耗时长；较高，耗时长；较高，耗时长；较高，耗时长；vv实际分析时一般每次只分析单个位点；实际分析时一般每次只分析单个位点；实际分析时一般每次只分析单个位点；实际分析时一般每次只分析单个位点；vv不同引物退火温度不同，需要探索。不同引物退火温度不同，需要探索。不同引物退火温度不同，需要探索。不同引物退火温度不同，需要探索。不足：不足：第35页，本讲稿共114页SSR的检测的检测uu琼脂糖凝胶检测（同前）琼脂糖凝胶检测（同前）uu聚丙烯酰胺凝胶检测聚丙烯酰胺凝胶检测uu一般采用银染、荧光检测。一般采用银染、荧光检测。第36页，本讲稿共114页银染检测程序银染检测程序脱色脱色脱色脱色：加：加：加：加1 1升升升升10%10%HACHAC液，脱色液，脱色液，脱色液，脱色2020分钟分钟分钟分钟冲洗冲洗冲洗冲洗：用重蒸水冲洗胶板：用重蒸水冲洗胶板：用重蒸水冲洗胶板：用重蒸水冲洗胶板2 2次，每次次，每次次，每次次，每次5 5分钟分钟分钟分钟染色染色染色染色：加染色液：加染色液：加染色液：加染色液(1%AgNO1%AgNO3 3，0.075%0.075%甲醛甲醛甲醛甲醛)30)30分钟分钟分钟分钟冲洗冲洗冲洗冲洗：用重蒸水冲洗胶板不超过：用重蒸水冲洗胶板不超过：用重蒸水冲洗胶板不超过：用重蒸水冲洗胶板不超过5 5秒钟；秒钟；秒钟；秒钟；显显显显影影影影：预预预预冷冷冷冷显显显显影影影影液液液液（3030g/LNaCOg/LNaCO3 3，0.075%0.075%甲甲甲甲醛醛醛醛，0.40.4mg/mlNamg/mlNa2 2SOSO3 3），），），），轻摇到带纹出现；轻摇到带纹出现；轻摇到带纹出现；轻摇到带纹出现；定影定影定影定影：在固定：在固定：在固定：在固定/停止液并轻摇停止液并轻摇停止液并轻摇停止液并轻摇3-53-5分钟；分钟；分钟；分钟；冲洗冲洗冲洗冲洗：用重蒸水冲洗：用重蒸水冲洗：用重蒸水冲洗：用重蒸水冲洗2 2次，每次次，每次次，每次次，每次2 2分钟；分钟；分钟；分钟；干胶干胶干胶干胶：室温下自然干燥过夜。：室温下自然干燥过夜。：室温下自然干燥过夜。：室温下自然干燥过夜。第37页，本讲稿共114页AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism)n n原理：原理：n n基于基于RFLP技术和技术和PCR技术的结合技术的结合第38页，本讲稿共114页DNAMseI-MseI MseI-EcoRI EcoRI-EcoRIn nMseI-MseI片段环化，不利小片段扩增；片段环化，不利小片段扩增；n nEcoRI-EcoRI 引物的退火温度高；引物的退火温度高；n nMseI-EcoRI 片段优先扩增片段优先扩增酶切连接酶切连接酶切连接酶切连接第39页，本讲稿共114页接头序列接头序列n nMseMse 接头、接头、接头、接头、PstPst 分别为：分别为：分别为：分别为：n nMseMse：n n 5 5-GACGATGAGTCCTGAG-3-GACGATGAGTCCTGAG-3 n n 3 3-TACTCAGGACTCAT-5-TACTCAGGACTCAT-5 n nPstPst：n n 5 5-CTCGTAGACTGCGTACC-3-CTCGTAGACTGCGTACC-3 n n 3 3-CTGACGCATGGTTAA-5-CTGACGCATGGTTAA-5 n nEcoEcoR R：n n 5 5-CTCGTAGACTGCGTACC-3-CTCGTAGACTGCGTACC-3 n n 3 3-CTGACGCATGGTTAA-5-CTGACGCATGGTTAA-5 第40页，本讲稿共114页M00:5-GATGAGTCCTGAGTAA-3M00:5-GATGAGTCCTGAGTAA-3；P00:5-P00:5-GACTGCGTACCAATTC-3;GACTGCGTACCAATTC-3;E00:5-GACTGCGTACCAATTC-3;E00:5-GACTGCGTACCAATTC-3;MseMseI-primers+3:5-GATGAGTCCTGAGTAANNN-3I-primers+3:5-GATGAGTCCTGAGTAANNN-3 EcoEcoRI-primers+3:5-GACTGCGTACCAATTCNNN-3RI-primers+3:5-GACTGCGTACCAATTCNNN-3 PstPstI-primers+3:5-GACTGCGTACATCGAGNNN-3I-primers+3:5-GACTGCGTACATCGAGNNN-3 第41页，本讲稿共114页 AFLP技术的特点（1 1）由由由由于于于于内内内内切切切切酶酶酶酶及及及及选选选选择择择择性性性性碱碱碱碱基基基基组组组组合合合合数数数数和和和和种种种种类类类类很很很很多多多多，产产产产生标记数无限，可覆盖整个基因组。生标记数无限，可覆盖整个基因组。生标记数无限，可覆盖整个基因组。生标记数无限，可覆盖整个基因组。（2 2）多多多多态态态态性性性性远远远远远远远远超超超超过过过过其其其其它它它它分分分分子子子子标标标标记记记记，一一一一般般般般可可可可检检检检测测测测到到到到50-50-100100个个个个AFLPAFLP扩扩扩扩增增增增产产产产物物物物，能能能能够够够够在在在在遗遗遗遗传传传传关关关关系系系系十十十十分分分分相相相相近近近近的的的的材材材材料料料料产产产产生生生生多多多多态态态态性性性性，被被被被认认认认为为为为是是是是指指指指纹纹纹纹图图图图谱谱谱谱技技技技术术术术中中中中多多多多态性最丰富的一项技术。态性最丰富的一项技术。态性最丰富的一项技术。态性最丰富的一项技术。（3 3）AFLPAFLP分分分分析析析析由由由由于于于于扩扩扩扩增增增增片片片片段段段段较较较较短短短短（30-70030-700bp)bp)，分分分分辨率高。辨率高。辨率高。辨率高。第42页，本讲稿共114页（4 4）AFLPAFLP分分分分析析析析用用用用样样样样量量量量少少少少（0.05-0.50.05-0.5 ggDNADNA），而且对模板浓度的变化不敏感。而且对模板浓度的变化不敏感。而且对模板浓度的变化不敏感。而且对模板浓度的变化不敏感。（5 5）由由由由于于于于特特特特定定定定引引引引物物物物扩扩扩扩增增增增，退退退退火火火火温温温温度度度度高高高高，因因因因而而而而假假假假阳阳阳阳性性性性低低低低，可靠性高。可靠性高。可靠性高。可靠性高。（6 6）引引引引物物物物在在在在不不不不同同同同物物物物种种种种间间间间是是是是通通通通用用用用的的的的，可可可可用用用用于于于于没没没没有有有有任何分子生物学研究基础的物种。任何分子生物学研究基础的物种。任何分子生物学研究基础的物种。任何分子生物学研究基础的物种。（7 7）银银银银染染染染技技技技术术术术具具具具有有有有快快快快速速速速、方方方方便便便便的的的的特特特特点点点点，在在在在1-21-2天天天天内内内内可可可可以以以以得到指纹。得到指纹。得到指纹。得到指纹。第43页，本讲稿共114页AFLPAFLP操作具体包括三个步骤：操作具体包括三个步骤：操作具体包括三个步骤：操作具体包括三个步骤：1.1.酶切酶切酶切酶切-连接；连接；连接；连接；2.2.PCRPCR扩增，使目的序列扩增到扩增，使目的序列扩增到扩增，使目的序列扩增到扩增，使目的序列扩增到0.50.51 1gg；3.3.电泳分离（利用聚丙烯酰胺凝胶）。电泳分离（利用聚丙烯酰胺凝胶）。电泳分离（利用聚丙烯酰胺凝胶）。电泳分离（利用聚丙烯酰胺凝胶）。对对对对于于于于基基基基因因因因组组组组较较较较大大大大的的的的物物物物种种种种，需需需需要要要要进进进进行行行行两两两两步步步步扩扩扩扩增增增增预预预预扩增和选择性扩增。扩增和选择性扩增。扩增和选择性扩增。扩增和选择性扩增。AFLP操作步骤：操作步骤：第44页，本讲稿共114页模板模板DNADNA的酶切与连接的酶切与连接DNADNA（200ng/l200ng/l）2.5l2.5lMseMse3 3单位单位单位单位 PstPst3 3单位单位单位单位MseMse 接头（接头（接头（接头（5050pmol/lpmol/l）1.0l1.0lPstPst 接头（接头（接头（接头（55pmol/lpmol/l）1.0l1.0l10NEBBuffer10NEBBuffer2.5l2.5l100BSA100BSA0.25l0.25lATPATP（10mM10mM）2.0l2.0lT T4 4-连接酶（连接酶（连接酶（连接酶（3 3U/lU/l）0.4l0.4l加水至加水至加水至加水至2525l l，3737酶切酶切酶切酶切-连接连接连接连接4-64-6小时，或过夜小时，或过夜小时，或过夜小时，或过夜。AFLP实验程序第45页，本讲稿共114页DNADNA片段的预扩增取取取取2.02.0l l完成的样品，加入完成的样品，加入完成的样品，加入完成的样品，加入1818l l如下混合液：如下混合液：如下混合液：如下混合液：MseMse 引物（引物（引物（引物（M00M00，50ng/l50ng/l）0.6l0.6l Pst Pst 引物（引物（引物（引物（P00P00，50ng/l50ng/l）0.6l0.6l10PCRBuffer10PCRBuffer 2.0l2.0lMgMg2+2+（25mM25mM）1.2l1.2l TaqTaq酶（酶（酶（酶（5 5U/lU/l）0.1l0.1ldNTPdNTP（25mM25mM）0.16l0.16l加加加加ddHddH2 2OO至至至至2 20l第46页，本讲稿共114页混合后，在如下混合后，在如下混合后，在如下混合后，在如下PCRPCR条件下扩增：条件下扩增：条件下扩增：条件下扩增：Step1Step1959522分钟分钟分钟分钟Step2Step295953030秒秒秒秒Step3Step356563030秒秒秒秒Step4Step472726060秒秒秒秒Step5Step5GOTOStep231cycle