外源基因表达产物的分离纯化.ppt

D D 重组蛋白质的鉴定重组蛋白质的鉴定C C 基因重组蛋白包涵体的分离和复性基因重组蛋白包涵体的分离和复性B B 常用的分离方法常用的分离方法A A 重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则第八章第八章第八章第八章 外源基因表达产物的分离纯化外源基因表达产物的分离纯化一、一、重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则针对不同的产物表达形式采取不同的策略针对不同的产物表达形式采取不同的策略针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型多种分离纯化技术的联合运用多种分离纯化技术的联合运用合适分离纯化介质的选择合适分离纯化介质的选择分离纯化过程的规模化分离纯化过程的规模化1.1.针对不同的产物表达形式采取不同的策略针对不同的产物表达形式采取不同的策略 采用采用分泌型战略分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在表达重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理；纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理；采用采用包涵体型战略包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵体；表达重组蛋白，应先离心回收包涵体；采用采用融合型战略融合型战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶性的，拟首先选表达重组蛋白，一般是胞内可溶性的，拟首先选用亲和层析进行纯化用亲和层析进行纯化 表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应用低浓度的溶的蛋白质，应用低浓度的溶菌酶处理，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。菌酶处理，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。2.2.针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型 等电点等电点处于极端区域（处于极端区域（pIpI55 或或 pIpI88）的重组蛋白应首选离子）的重组蛋白应首选离子交换法进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白；交换法进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白；重组蛋白特异性的重组蛋白特异性的配体配体、底物底物、抗体抗体、糖链糖链等都是首选亲合层析等都是首选亲合层析 疏水层析疏水层析和和反相层析反相层析是根据蛋白质的是根据蛋白质的疏水性差异疏水性差异进行分离的；进行分离的；凝胶过滤层析凝胶过滤层析是根据蛋白的是根据蛋白的分子量和体积差异分子量和体积差异进行分离的；进行分离的；3.3.多种分离纯化技术的联合运用多种分离纯化技术的联合运用在选择分离纯化方法时应遵循下列原则：在选择分离纯化方法时应遵循下列原则：应选择不同分离纯化机理的方法联合使用应选择不同分离纯化机理的方法联合使用应首先选择能除去含量最多杂质的方法应首先选择能除去含量最多杂质的方法应尽量选择高效的分离方法应尽量选择高效的分离方法应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段4.4.合适分离纯化介质的选择合适分离纯化介质的选择 常用的蛋白质分离纯化介质有常用的蛋白质分离纯化介质有SephadexSephadex和和SuperoseSuperose。理想的分理想的分理想的分理想的分离纯化介质应具有下列性质：离纯化介质应具有下列性质：离纯化介质应具有下列性质：离纯化介质应具有下列性质：对目标蛋白具有较高的分离效率对目标蛋白具有较高的分离效率对目标蛋白不会造成变性对目标蛋白不会造成变性化学性能和机械性能稳定，重复性好化学性能和机械性能稳定，重复性好价格低廉价格低廉nSephadex 是由葡聚糖通过环氧氯丙烷交联形成的三维是由葡聚糖通过环氧氯丙烷交联形成的三维网状凝胶颗粒网状凝胶颗粒 nSuperose是在珠状琼脂糖颗粒的基础上经过两次交联后是在珠状琼脂糖颗粒的基础上经过两次交联后得到的得到的 5.5.分离纯化过程的规模化分离纯化过程的规模化 蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大规模产业化过程蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大规模产业化过程未必合适，如：未必合适，如：实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁）实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁）实验室方法在大规模生产中可能成本过高（超速离心）实验室方法在大规模生产中可能成本过高（超速离心）因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于生产工艺。因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于生产工艺。1.1.离子交换层析离子交换层析离子交换层析离子交换层析二、常用的分离方法二、常用的分离方法二、常用的分离方法二、常用的分离方法离子交换层析的离子交换层析的基本原理基本原理离子交换介质的离子交换介质的基本性质基本性质离子交换层析的离子交换层析的基本操作基本操作离子交换介质的离子交换介质的选择原则选择原则离子交换层析的离子交换层析的基本原理基本原理 离子交换层析是以离子交换层析是以离子交换剂离子交换剂为为固定相固定相，以特定的，以特定的含离子溶液含离子溶液为为流动相流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混合物进行分离的层析技术。合物进行分离的层析技术。离子交换介质的离子交换介质的基本性质基本性质 离子交换剂离子交换剂亦称亦称离子交换介质，离子交换介质，通常是一种不溶性高分子化合物通常是一种不溶性高分子化合物如如树脂树脂，纤维素纤维素，葡聚糖葡聚糖，醇脂糖醇脂糖等；等；离子交换剂离子交换剂中所含的可解离基团在水溶液中能与溶液中的其它阳中所含的可解离基团在水溶液中能与溶液中的其它阳离子交换剂的基本性能离子或阴离子起交换作用离子或阴离子起交换作用 不同蛋白质与离子交换剂之间形成离子键数目不同，即亲和力大不同蛋白质与离子交换剂之间形成离子键数目不同，即亲和力大小有差异，因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的成分逐个小有差异，因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的成分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的洗脱下来，达到分离纯化的目的 阴离子交换剂：强碱型和弱碱型阴离子交换剂：强碱型和弱碱型离子交换剂的分类 阳离子交换剂：强酸型和弱酸型阳离子交换剂：强酸型和弱酸型阳离子交换剂阳离子交换剂分为强酸型、中强酸型和弱酸型三类，强酸型含有分为强酸型、中强酸型和弱酸型三类，强酸型含有RSO3H，中强酸型含有，中强酸型含有PO3H2、PO2H2或或OPO2H2，弱酸型含有弱酸型含有COOH或或OH。阳离子交换进行的反应如下：阳离子交换进行的反应如下：阴离子交换剂阴离子交换剂分为强碱型、中强碱型和弱碱型三类，含有四级铵盐分为强碱型、中强碱型和弱碱型三类，含有四级铵盐 N+(CH3)3 为强碱型，三级以下铵盐为强碱型，三级以下铵盐 N(CH3)2、NHCH3、NH2 都属弱碱型；同时具有强碱和弱碱型基团都属弱碱型；同时具有强碱和弱碱型基团的，为中强碱型。的，为中强碱型。阴离子交换树脂进行的反应如下：阴离子交换树脂进行的反应如下：强离子交换剂强离子交换剂的电离率基本不受的电离率基本不受pHpH值影响，离子交换作用的值影响，离子交换作用的pHpH范围宽范围宽弱离子交换剂弱离子交换剂的电离率受的电离率受pHpH影响很大，离子交换作用的影响很大，离子交换作用的pHpH范围小范围小弱酸性阳离子交换剂在弱酸性阳离子交换剂在pHpH值降低时，其电离率逐渐降低，离子值降低时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱交换能力逐渐减弱弱碱性阴离子交换剂在弱碱性阴离子交换剂在pHpH值升高时，其电离率逐渐降低，离子值升高时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱交换能力逐渐减弱常用的离子交换剂离子交换树脂：离子交换树脂：最常见的最常见的离子交换树脂离子交换树脂是含有酸性或碱性基团的人工合成的是含有酸性或碱性基团的人工合成的聚苯聚苯乙烯乙烯-二乙烯苯二乙烯苯不溶性高分子化合物不溶性高分子化合物 离子交换树脂的优点离子交换树脂的优点是：是：流速快，对小分子物质的交换容量大，流速快，对小分子物质的交换容量大，因而适合用于因而适合用于氨基酸、核苷酸等小分子生化物质的分离纯化氨基酸、核苷酸等小分子生化物质的分离纯化离子交换纤维素：离子交换纤维素：离子交换纤维素离子交换纤维素是携带功能基团是携带功能基团纤维素衍生物，具有松散的亲水纤维素衍生物，具有松散的亲水性网状结构以及较大的表面积，大分子可以自由通过，因而对生物大性网状结构以及较大的表面积，大分子可以自由通过，因而对生物大分子（如蛋白质）的交换容量比离子交换树脂大分子（如蛋白质）的交换容量比离子交换树脂大 阳离子型阳离子型离子交换纤维素包括离子交换纤维素包括羟甲基纤维素羟甲基纤维素（CMCM纤维素）等纤维素）等维素）维素）阴离子型阴离子型离子交换纤维素包括离子交换纤维素包括二乙基氨基乙基纤维素二乙基氨基乙基纤维素（DEAEDEAE纤纤离子交换葡聚糖：离子交换葡聚糖：离子交换葡聚糖离子交换葡聚糖是葡聚糖是葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三维空间网状结构并带有离子交换功能基团。维空间网状结构并带有离子交换功能基团。SephadexSephadex的优点如下：的优点如下：亲水性强、不会引起生物分子的变性和失活，母链对蛋白质、核亲水性强、不会引起生物分子的变性和失活，母链对蛋白质、核酸酸及其它生物分子的非特异性吸附能力小及其它生物分子的非特异性吸附能力小 电离基团在母体上取代程度高，交换容量大，装柱方便，流速快电离基团在母体上取代程度高，交换容量大，装柱方便，流速快 既有离子交换作用，又有分子筛效应既有离子交换作用，又有分子筛效应 因而因而SephadexSephadex是一类广泛应用的色谱分离介质是一类广泛应用的色谱分离介质 常用的离子交换葡聚糖包括：常用的离子交换葡聚糖包括：阳离子交换剂阳离子交换剂CM-Sephadex C-25CM-Sephadex C-25，CM-Sephadex C-50CM-Sephadex C-50 阴离子交换剂阴离子交换剂DEAE-Sephadex A-25DEAE-Sephadex A-25，DEAE-Sephadex A-50DEAE-Sephadex A-50QAE-Sephadex A-25QAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-50QAE-Sephadex A-50 离子交换琼脂糖：离子交换琼脂糖：离子交换琼脂糖离子交换琼脂糖是携带是携带DEAEDEAE或或CMCM基团的基团的Sepharose CL-6BSepharose CL-6B尤其是介质受尤其是介质受pHpH和离子强度的影响所引起的膨胀和收缩效应较小，因和离子强度的影响所引起的膨胀和收缩效应较小，因具有硬度大、性质稳定，流速好，分离能力强等优点具有硬度大、性质稳定，流速好，分离能力强等优点此具有稳定的外形体积此具有稳定的外形体积离子交换介质的离子交换介质的选择原则选择原则一般而言：一般而言：酸性酸性物质用物质用阴离子阴离子交换剂分离交换剂分离氨基酸、核苷酸、蛋白质等氨基酸、核苷酸、蛋白质等两性电解质两性电解质，可根据其，可根据其pIpI值值及及离子化离子化碱性碱性物质用物质用阳离子阳离子交换剂分离交换剂分离曲线曲线来选择来选择1122334466778899101055pHpH+-蛋蛋白白质质净净电电荷荷等电点等电点吸附阴离子交换剂吸附阴离子交换剂吸附阳离子交换剂吸附阳离子交换剂pH pH pI pI pI（-）对对pIpI=5=5的某酸性蛋白质的某酸性蛋白质在在pHpH的范围内，的范围内，当蛋白质为阴离子时，当蛋白质为阴离子时，应首选应首选DEAEDEAE纤维素纤维素；在在pHpH的范围内，的范围内，当蛋白质为阳离子时，当蛋白质为阳离子时，应首选应首选CMCM纤维素纤维素离子交换层析的离子交换层析的基本操作基本操作(1)层析柱平衡平衡缓冲液的用量至少为柱体积的平衡缓冲液的用量至少为柱体积的 2 2 倍倍平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、pHpH值与缓冲液一致值与缓冲液一致 为准，其中为准，其中pHpH值最重要值最重要目的：目的：保证待分离物质如蛋白质的稳定；保证待分离物质如蛋白质的稳定；使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合；使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合；使待分离样品和杂质与离子交换剂的结合有较大的差别。使待分离样品和杂质与离子交换剂的结合有较大的差别。(2)样品进柱为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质交换容量交换容量的的10-20%10-20%为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高交换容量交换容量：离子交换剂中全部可交换的离子或功能基团的总数：离子交换剂中全部可交换的离子或功能基团的总数离子交换层析的基本操作离子交换层析的基本操作(3)样品洗脱恒定洗脱恒定洗脱阶段洗脱阶段洗脱梯度洗脱梯度洗脱101020203030404050506060707080809090分子浓度分子浓度离子强度离子强度pHpH值值1.平衡阶段平衡阶段:离子交换剂与离子交换剂与反离子结合反离子结合2.吸附阶段：样品与反吸附阶段：样品与反离子进行交换离子进行交换3、4.解吸附阶段：用解吸附阶段：用梯度缓冲溶液洗脱，先梯度缓冲溶液洗脱，先洗下弱吸附物质，后洗洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质下强吸附物质5.再生阶段：用原始平再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤，既衡液进行充分洗涤，既可重复使用可重复使用12345原始缓冲原始缓冲溶液的反溶液的反离子离子样品溶液样品溶液梯度浓度梯度浓度时时时时刻刻刻刻要要要要记记记记住住住住：蛋蛋白白质质是是由由氨氨基基酸酸聚聚合合形形成成的的聚聚合合物物，所所以以蛋蛋白白质质也也存存在在等等电电点点（pI），蛋蛋白白质质在在溶溶液液中中带带电电状状况况同氨基酸相同，取决于所处溶液的同氨基酸相同，取决于所处溶液的pH 值。值。当当pI pH时时，蛋蛋白质带净正电荷。白质带净正电荷。举一例子：举一例子：举一例子：举一例子：已知蛋白已知蛋白X等电点为等电点为7，设计实验利用阴离子交换树脂纯化。，设计实验利用阴离子交换树脂纯化。答答案案：建建立立阴阴离离子子交交换换柱柱，比比如如Q-Sepharose。用用的的缓缓冲冲液液平平衡衡柱柱子子，同同时时蛋蛋白白X溶溶解解于于的的缓缓冲冲液液中中，在在此此pH值值下下蛋蛋白白X带带有有负负电电，将将含含有有蛋蛋白白X的的混混合合液液上上样样，然然后后用用起起始始液液冲冲洗，蛋白洗，蛋白X会与此柱结合，然后盐梯度洗脱。会与此柱结合，然后盐梯度洗脱。2.2.凝胶层析凝胶层析凝胶层析凝胶层析凝胶层析的凝胶层析的基本原理基本原理凝胶介质的凝胶介质的基本性质基本性质凝胶层析的凝胶层析的基本操作基本操作凝胶介质的凝胶介质的选用原则选用原则凝胶层析的凝胶层析的基本原理基本原理 凝胶层析是凝胶层析是利用有一定孔径范围的利用有一定孔径范围的多孔凝胶多孔凝胶作为固定相，对混合作为固定相，对混合物物中各组份按分子大小进行分离的层析技术，又称为中各组份按分子大小进行分离的层析技术，又称为分子筛。分子筛。分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，会被全部排阻在凝胶颗粒之分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，会被全部排阻在凝胶颗粒之外，即外，即全排阻全排阻；鉴于上述原理，鉴于上述原理，凝胶层析可用于重组蛋白溶液凝胶层析可用于重组蛋白溶液脱盐脱盐、分子量测定分子量测定以及以及分离纯化分离纯化。凝胶过滤的作用机制凝胶过滤的作用机制带网孔的葡带网孔的葡聚糖珠聚糖珠小分子进入葡小分子进入葡聚糖珠内聚糖珠内大分子不大分子不能进入珠能进入珠内，经珠内，经珠之间缝隙之间缝隙流出流出凝胶过滤层析过程示意图凝胶过滤层析过程示意图凝胶过滤层析过程示意图凝胶过滤层析过程示意图小分子小分子大分子大分子凝胶基质凝胶基质凝胶凝胶珠珠凝胶介质的凝胶介质的基本性质基本性质 葡聚糖凝胶的种类有葡聚糖凝胶的种类有G10G10、G15G15、G25G25、G50G50、G75G75、G100G100 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶对碱比较稳定对碱比较稳定，在酸性环境中其糖苷键易水解，在酸性环境中其糖苷键易水解 湿态的葡聚糖可加热到湿态的葡聚糖可加热到110110，干的则能耐受，干的则能耐受120120高温高温葡聚糖凝胶（Sephadex）葡聚糖凝胶G10 700 葡聚糖凝胶G15 1500 葡聚糖凝胶G25 1000-5000 葡聚糖凝胶G50 1000-30,000 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶是由琼脂中分离出来的天然凝胶，常见的有是由琼脂中分离出来的天然凝胶，常见的有SepharoseSepharose（Sepharose 2BSepharose 2B、4B4B、6B6B）。琼脂糖凝胶 当温度高于当温度高于5050时琼脂糖凝胶便融化，只能在较低的温度下使用。时琼脂糖凝胶便融化，只能在较低的温度下使用。琼脂糖凝胶是一种大孔凝胶，因而适合于分离分子量较大的生物大琼脂糖凝胶是一种大孔凝胶，因而适合于分离分子量较大的生物大分子物质（如蛋白质和分子物质（如蛋白质和DNADNA）。）。聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶凝胶是一种以丙烯酰胺为单位由甲叉双丙烯酰胺交联是一种以丙烯酰胺为单位由甲叉双丙烯酰胺交联而成的人工合成凝胶，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶，交而成的人工合成凝胶，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶，交联剂越多，孔隙越小。联剂越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝胶的商品名为聚丙烯酰胺凝胶的商品名为Bio-GelBio-Gel，型号从型号从P-2P-2至至P-300P-300共共1010种种聚丙烯酰胺凝胶凝胶介质的凝胶介质的选用原则选用原则 将样品中的大分子物质与小分子物质分开，称为将样品中的大分子物质与小分子物质分开，称为组别分离组别分离，其分，其分离策略是离策略是使高分子物质完全使高分子物质完全被排阻被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。小分子物质完全渗入凝胶内。组别分离一般选用组别分离一般选用Sephadex G-25Sephadex G-25或或G-50G-50，对于小肽和低分子量对于小肽和低分子量的物质（分子量范围的物质（分子量范围1000-50001000-5000）的脱盐可选用）的脱盐可选用Sephadex G-10Sephadex G-10、G-G-组别分离1515、Bio-Gel P-2Bio-Gel P-2或或P-P-4 4 将样品中一些分子量比较接近的物质分开，这种分离叫将样品中一些分子量比较接近的物质分开，这种分离叫分级分离分级分离 分级分离一般选用分级分离一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶。排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶。在层析过程中，样品中各组份均能不同程度地深入到凝胶内部，但由在层析过程中，样品中各组份均能不同程度地深入到凝胶内部，但由分级分离于深入凝胶空隙程度上的差异，最后得到分离。于深入凝胶空隙程度上的差异，最后得到分离。凝胶层析的凝胶层析的基本操作基本操作平衡溶液的流速应低于层析时需要的流速平衡溶液的流速应低于层析时需要的流速注意凝胶的断层和气泡注意凝胶的断层和气泡层析柱平衡操作压控制平衡和洗脱时应维持流速恒定平衡和洗脱时应维持流速恒定上柱样品溶液的体积根据分离要求来确定：上柱样品溶液的体积根据分离要求来确定：进样体积进行组别分离时，样品溶液最大可为柱体积的进行组别分离时，样品溶液最大可为柱体积的10%10%进行分级分离时，样品溶液的体积要小，使样品层尽可能进行分级分离时，样品溶液的体积要小，使样品层尽可能窄，这样洗脱出的峰形好窄，这样洗脱出的峰形好3.3.亲和层析亲和层析亲和层析亲和层析亲和层析的亲和层析的基本概念基本概念亲和层析亲和层析载体的性质与选择载体的性质与选择亲和层析亲和层析配基的性质与选择配基的性质与选择亲和层析的亲和层析的基本操作基本操作亲和层析的亲和层析的基本概念基本概念 亲和层析亲和层析是利用待分离物质与其特异性配体之间特异性的亲和力是利用待分离物质与其特异性配体之间特异性的亲和力进行分离的一类进行分离的一类进行分离的一类进行分离的一类特殊的层析技术，特殊的层析技术，特殊的层析技术，特殊的层析技术，它有如下特点：它有如下特点：它有如下特点：它有如下特点：纯化过程简单、迅速，且分离效率高纯化过程简单、迅速，且分离效率高特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子亲和层析的基本特点纯化倍数大，产物纯度高纯化倍数大，产物纯度高必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件因此应用范围受到一定的限制因此应用范围受到一定的限制抗原与抗体抗原与抗体DNADNA与互补与互补DNADNA或或RNARNA（cDNAcDNA、mRNA)mRNA)酶与其底物、竞争性抑制剂、酶与其底物、竞争性抑制剂、辅酶因子辅酶因子激素或药物与其受体激素或药物与其受体具有特异性亲和作用的生物分子维生素于其特异性结合蛋白维生素于其特异性结合蛋白糖蛋白与其相应的植物凝集素糖蛋白与其相应的植物凝集素亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂作为固定相吸附剂当含有混合组份的样品（流动相）通过此固定相时，只有当含有混合组份的样品（流动相）通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结亲和层析的基本原理合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出然后改变流动相成份，将结合的亲和物洗脱下来然后改变流动相成份，将结合的亲和物洗脱下来亲和层析亲和层析（affiuity chromatography）应用应用 分离纯化酶、分离纯化酶、抗原、抗体抗原、抗体 分离纯化核酸分离纯化核酸 研究酶的结构与功能研究酶的结构与功能+待纯化分子待纯化分子配体配体a.理论依据理论依据：待纯化分子和配体间具有亲和性：待纯化分子和配体间具有亲和性+基质基质b.活性基质与配体结合产生亲和吸附剂活性基质与配体结合产生亲和吸附剂+杂质杂质c.待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离+d.偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子原理原理：基质基质 纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、sepharose、sephadex亲亲和和层层析析原原理理示示意意图图蛋白质混合物蛋白质混合物配体配体与配体结合的蛋与配体结合的蛋白质白质加入的可溶性配加入的可溶性配基基专一性结合专一性结合蛋白质蛋白质没有结合的蛋没有结合的蛋白质白质非专一性结合非专一性结合蛋白质蛋白质蛋蛋白白质质浓浓度度洗脱体积洗脱体积与配体专一性结与配体专一性结合蛋白质合蛋白质加入配基加入配基基质基质亲和层析亲和层析载体的性质与选择载体的性质与选择具有多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过具有多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过具有良好机械性能的均匀珠状颗粒，具有良好的流速具有良好机械性能的均匀珠状颗粒，具有良好的流速亲和层析载体的选择具有惰性，尽量减少非专一性吸附具有惰性，尽量减少非专一性吸附具有相当量的易活化的基团，在温和的条件下能与配基共价合具有相当量的易活化的基团，在温和的条件下能与配基共价合偶联偶联在偶联、吸附和洗脱时，有较好的物理化学稳定性在偶联、吸附和洗脱时，有较好的物理化学稳定性纤维素纤维素葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 常用的亲和层析载体琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶其它新型载体其它新型载体 纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力但亲和力太高也是有害的，因为在解离配基复合物时所需的但亲和力太高也是有害的，因为在解离配基复合物时所需的亲和层析配基的选择条件就要强烈，条件就要强烈，这样可能使生物分子变性这样可能使生物分子变性配基必须具有适当的化学基团，配基必须具有适当的化学基团，这种基团不参与配基与生物这种基团不参与配基与生物分子之间特异结合，但可用于分子之间特异结合，但可用于和载体相连，同时又不影响配和载体相连，同时又不影响配基与生物分子之间的亲和力基与生物分子之间的亲和力酸酐法酸酐法N-N-取代羟基琥珀酰亚胺法取代羟基琥珀酰亚胺法配基的偶联叠氮化作用叠氮化作用还原性烷基化合物（西夫碱）的形成还原性烷基化合物（西夫碱）的形成亲和层析的亲和层析的基本操作基本操作通常采用改变通常采用改变pHpH、离子强度、离子种类或者温度等，离子强度、离子种类或者温度等，降低其亲和力。降低其亲和力。非专一性洗脱化的配基对相应的生物大分子的亲和力降低化的配基对相应的生物大分子的亲和力降低非专一性洗脱剂的作用并不是使被吸附的生物大分子的构象发非专一性洗脱剂的作用并不是使被吸附的生物大分子的构象发生变化，生变化，而是洗脱剂中的某一组分与固定配基形成复合物，使固定而是洗脱剂中的某一组分与固定配基形成复合物，使固定使用使用特异的配基作为洗脱剂特异的配基作为洗脱剂 溶液为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合来洗溶液为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合来洗专一性洗脱使用含有与亲和配基或目标产物具有亲和作用的小分子化合物使用含有与亲和配基或目标产物具有亲和作用的小分子化合物 脱目标产物脱目标产物 亲和双方吸附能力很强，可以用专一的化学方法裂解配基与载亲和双方吸附能力很强，可以用专一的化学方法裂解配基与载特殊性洗脱体的连接键，获得的配基体的连接键，获得的配基-蛋白络合物后，再除去配基。蛋白络合物后，再除去配基。4.4.膜分离膜分离膜分离膜分离膜分离的膜分离的基本原理基本原理分离膜的分离膜的主要性能主要性能影响膜分离的因素影响膜分离的因素膜分离的膜分离的基本原理基本原理 膜分离是利用膜的选择性，以膜的两侧存在一定量的能量差作为膜分离是利用膜的选择性，以膜的两侧存在一定量的能量差作为膜分离的基本定义推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移速率不同而实现的分离。推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移速率不同而实现的分离。依据滤膜孔径和物质粒子的大小而达到物质分离的目的依据滤膜孔径和物质粒子的大小而达到物质分离的目的分离效率高分离效率高膜分离的特点不涉及相变，能耗低，运行成本低不涉及相变，能耗低，运行成本低膜分离为单纯物理变化，无二次污染膜分离为单纯物理变化，无二次污染分离膜的选择通透性：是物质分离的分离膜的选择通透性：是物质分离的第一机制第一机制膜分离过程的重要参数膜分离过程的推动力：膜分离过程的推动力：静压力差静压力差、浓度差浓度差、电位差电位差物质通过分离膜的速度：是物质分离的物质通过分离膜的速度：是物质分离的第二机制第二机制 根据分离膜根据分离膜膜内平均孔径、推动力和传递机制不同，膜分离可膜内平均孔径、推动力和传递机制不同，膜分离可膜分离的主要类型反渗透反渗透（Reverse osmosis ROReverse osmosis RO）透析（透析（Dialysis DSDialysis DS）分成分成下列几类：下列几类：超滤（超滤（Uitrfiltration UFUitrfiltration UF）微滤（微滤（Microfitration MFMicrofitration MF）电渗析电渗析（Electrodialysis EIElectrodialysis EI）透析透析半透膜袋半透膜袋蛋白质溶液蛋白质溶液透析液透析液磁棒磁棒 磁力搅拌器磁力搅拌器 透析是利用蛋白质等大分子不能通透析是利用蛋白质等大分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐单糖等分开。常用分子物质如无机盐单糖等分开。常用的半透膜：的半透膜：玻璃纸（赛璐玢纸，玻璃纸（赛璐玢纸，cellophane paper）火绵纸（赛璐玎纸火绵纸（赛璐玎纸,celloidin paper）其他改型纤维素材料其他改型纤维素材料按照分子大小按照分子大小进行分离。分进行分离。分离取决于透析离取决于透析袋截留的分子袋截留的分子量。量。透析液透析液浓缩的蛋白混浓缩的蛋白混合样品合样品 透析袋透析袋 开始透析开始透析处于平衡状态处于平衡状态反渗透反渗透（Reverse osmosis ROReverse osmosis RO）反渗透反渗透其主要原理是在高于溶液渗透压的作用下，使其它物质其主要原理是在高于溶液渗透压的作用下，使其它物质溶解盐类、胶体、微生物、热源、有机物等，因而主要用于海水、溶解盐类、胶体、微生物、热源、有机物等，因而主要用于海水、不能透过半透膜，而将这些物质与水分离开来，有效地去除水中的不能透过半透膜，而将这些物质与水分离开来，有效地去除水中的苦咸水淡化和产纯水制备等方面苦咸水淡化和产纯水制备等方面超滤（超滤（Uitrfiltration UFUitrfiltration UF）超滤超滤是一种是一种根据高分子溶质之间或高分子与小分子溶质之间相根据高分子溶质之间或高分子与小分子溶质之间相相应的截留分子量范围从相应的截留分子量范围从500500到到100100万左右。万左右。对分子质量的差别进行分离的方法。筛分孔径范围对分子质量的差别进行分离的方法。筛分孔径范围1 1 nm-0.1 nm-0.1 m mmm，n n超滤分离膜的基本性能分离膜的基本性能 分离膜是膜分离技术的核心，分离膜的性能主要包括分离膜是膜分离技术的核心，分离膜的性能主要包括分离透过分离透过性、耐酸碱性、抗氧化性、抗微生物降解性、亲水性、疏水性、电性、耐酸碱性、抗氧化性、抗微生物降解性、亲水性、疏水性、电性能和性能和化学物理化学物理性能两部分。其中，化学物理性能主要涉及到耐热性能两部分。其中，化学物理性能主要涉及到耐热性能、毒性、机械强度等。性能、毒性、机械强度等。膜的化学物理性能微滤膜微滤膜0.025-14 0.025-14 m mmm反渗透膜反渗透膜0.0001-0.001 0.0001-0.001 m mmm超滤膜超滤膜0.001-0.02 0.001-0.02 m mmm纳米过滤膜纳米过滤膜平均孔径平均孔径 2 2 nmnm膜的分类按膜的孔径大小分类：按膜的孔径大小分类：对称性膜对称性膜膜截面上的孔道结构均匀膜截面上的孔道结构均匀不对称性膜不对称性膜由表面活性层（超薄层）和惰性层（支撑层）构成由表面活性层（超薄层）和惰性层（支撑层）构成按膜的结构分类：按膜的结构分类：传质阻力大，透过通量低，易污染、难清洗传质阻力大，透过通量低，易污染、难清洗传质阻力小，透过通量高，被广泛使用传质阻力小，透过通量高，被广泛使用天然高分子膜天然高分子膜 醋酸纤维素、硝酸纤维素、再生纤维素醋酸纤维素、硝酸纤维素、再生纤维素合成聚合物膜合成聚合物膜 聚砜、聚酰胺、聚烯、含氟聚合物聚砜、聚酰胺、聚烯、含氟聚合物按膜的材料分类：按膜的材料分类：无机材料膜无机材料膜 陶瓷、微孔玻璃、不锈钢、碳素陶瓷、微孔玻璃、不锈钢、碳素影响膜分离的因素影响膜分离的因素影响膜分离效率的主要因素是膜的污染，其表现形式是：影响膜分离效率的主要因素是膜的污染，其表现形式是：溶质在膜孔内吸附溶质在膜孔内吸附造成膜污染的主要原因是：造成膜污染的主要原因是：蛋白质在不同蛋白质在不同pHpH条件下所带电荷对膜电荷的相互作用条件下所带电荷对膜电荷的相互作用无机盐通过形成复合物、改变溶液离子强度等机制污染膜无机盐通过形成复合物、改变溶液离子强度等机制污染膜溶质在膜表面沉淀或结晶溶质在膜表面沉淀或结晶膜分离过程中体系的粘度增大会污染膜膜分离过程中体系的粘度增大会污染膜 三、三、基因重组蛋白包涵体的分离和复性基因重组蛋白包涵体的分离和复性外源基因在大肠杆菌中的表达形式外源基因在大肠杆菌中的表达形式位于位于细胞质细胞质细胞周质细胞周质细胞外细胞外表达产物表达产物形式形式包涵体蛋白包涵体蛋白融合蛋白融合蛋白整合型外源蛋白整合型外源蛋白分泌型外源蛋白分泌型外源蛋白细胞质中表达细胞质中表达:外源基因在大肠杆菌寄主细胞质中高效表达时，常会外源基因在大肠杆菌寄主细胞质中高效表达时，常会发生一种特殊的生理现象，形成包涵体。发生一种特殊的生理现象，形成包涵体。包涵体：存在于细胞质中的一种由不可溶性蛋白质聚包涵体：存在于细胞质中的一种由不可溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。集折叠而成的晶体结构物。包涵体表达形式的优点包涵体表达形式的优点 在一定程度上保持表达产物的结构稳定在一定程度上保持表达产物的结构稳定 能够避免细胞内蛋白水解酶的作用，有利于目标蛋白的富集能够避免细胞内蛋白水解酶的作用，有利于目标蛋白的富集 简化外源基因表达产物的分离操作简化外源基因表达产物的分离操作 包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌 体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细 菌裂解物中分离出来菌裂解物中分离出来 能够表达对大肠杆菌宿主有毒或有致死效应的目标蛋白能够表达对大肠杆菌宿主有毒或有致死效应的目标蛋白。包涵体表达形式的缺点包涵体表达形式的缺点 以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过 有效的变性复性操作，才能得到有正确空间构象的目标蛋白。有效的变性复性操作，才能得到有正确空间构象的目标蛋白。体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过 30%复性处理工艺可使目标蛋白的制备成本上升。复性处理工艺可使目标蛋白的制备成本上升。n n包涵体直径约包涵体直径约包涵体直径约包涵体直径约0.5-1m0.5-1m，具有，具有，具有，具有很高的密度很高的密度很高的密度很高的密度（约（约（约（约1.3 mg/ml1.3 mg/ml），相差显微），相差显微），相差显微），相差显微镜下有镜下有镜下有镜下有折光性折光性折光性折光性，呈，呈，呈，呈非水溶性非水溶性非水溶性非水溶性，只溶于高浓度变性剂如尿素、盐酸胍只溶于高浓度变性剂如尿素、盐酸胍只溶于高浓度变性剂如尿素、盐酸胍只溶于高浓度变性剂如尿素、盐酸胍等。等。等。等。包涵体加工流程包涵体加工流程离离离离 心心心心去除细胞碎片去除细胞碎片（膜蛋白和脂类等）膜蛋白和脂类等）机械破碎法机械破碎法机械破碎法机械破碎法包涵体提包涵体提取取n如何对包涵体蛋白进行如何对包涵体蛋白进行高效体外复性高效体外复性以获得活性产品以获得活性产品是生物工程产业化经常是生物工程产业化经常面临的一个难题面临的一个难题包涵体的洗涤包涵体的洗涤n为除去包涵体上粘附的杂质，应用为除去包涵体上粘附的杂质，应用洗涤液洗涤液洗涤洗涤包涵体沉淀包涵体沉淀n常用常用去污剂去污剂Triton X-l00或或脱氧胆酸钠脱氧胆酸钠和和低浓度变性剂低浓度变性剂（如（如2mol/L尿素或盐酸胍等，洗涤尿素或盐酸胍等，洗涤以除去脂类和膜蛋白以除去脂类和膜蛋白。n如：如：50mM Tris-HCl，2M尿素，尿素，1mM EDTA包涵体的溶解包涵体的溶解n大多数在大多数在pH8的条件下，用的条件下，用强变性剂强变性剂如如8mol/L尿素、尿素、6mol/L盐酸胍，盐酸胍，打断包打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展n对于含有对于含有S-S的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一些的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一些链间链间形成的二硫形成的二硫键和键和链内链内的的非活性二硫键非活性二硫键n为将包涵体充分溶解，需为将包涵体充分溶解，需加入还原剂加入还原剂（如二硫苏糖醇（如二硫苏糖醇 DTT、GSH、巯基乙醇巯基乙醇-ME）打开蛋白质中所有二硫键，一般是）打开蛋白质中所有二硫键，一般是50-100mM-ME或或DTT（对于（对于目标蛋白没有二硫